王金福生物化學PPT01

制作：王金福生物化學教學課件

生物化學(Biochemistry)：生命的化學,在分子水平探討生命的本質(zhì)。研究對象：生物。生物化學的主要任務(wù)是闡述活細胞內(nèi)及細胞間的化學反應(yīng)及其與生命活動的關(guān)系。主要內(nèi)容:1、研究生物分子的結(jié)構(gòu)及功能。生物大分子是由某些基本單位按一定順序和方式連接所形成的多聚體（polymer）。包括蛋白質(zhì)、核酸、脂類及糖等。2、新陳代謝及其調(diào)節(jié)。3、遺傳信息的貯存、傳遞、表達及調(diào)控（分子生物學）。緒論國外生物化學的發(fā)展1、18世紀下半葉前：“燃素說”；2、18世紀下半葉：（1）拉瓦錫：證明燃燒是氧的作用；（2）舍勒：發(fā)現(xiàn)檸檬酸、蘋果酸等生物中間代謝產(chǎn)物；3、19世紀以后：李比希（1803~1873，德國化學家）：首創(chuàng)大學化學實驗的教學，首次提出新陳代謝；霍佩-賽勒（1825-1895，德國醫(yī)生）：建成獨立的生物化學學科，并提出“Biochemie”和“蛋白質(zhì)”一詞；寇南（1837-1900，德國化學家）：提出胰酶的名詞，研究血紅蛋白和胰液對蛋白質(zhì)的消化；4、20世紀以后生物化學的發(fā)展

1902年德國艾貝爾首次獲得結(jié)晶腎上腺素；

1904年英國哈頓分離出“輔酶”，還發(fā)現(xiàn)了磷酸基在生化中的重要作用；1902~1907年德國?！べM歇證明蛋白質(zhì)由氨基酸組成，開始了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究的時代；1909年丹麥威約翰遜在《精密遺傳學原理》一書中首次提出基因是遺傳單位的概念；1912年波蘭的豐克分離出維生素B結(jié)晶，首次提出維生素的概念；1925年英國凱林發(fā)現(xiàn)細胞色素，并指出生物氧化過程中的電子傳遞作用；1926年美國薩姆納首次制成尿素酶，開辟了酶化學的研究。同年美國的摩爾根發(fā)表《基因論》，使基因遺傳理論系統(tǒng)化；1929年美籍俄國人勒溫發(fā)現(xiàn)核酸中的核糖和脫氧核糖，認識到核酸分為核糖核酸和脫氧核糖核酸兩類；同年德國羅曼發(fā)現(xiàn)ATP。1937年美國羅思發(fā)現(xiàn)組成蛋白質(zhì)的氨基酸分為兩類，其中一類對營養(yǎng)無效，另一類是20余種基本氨基酸；同年英籍德國人克勒勃斯發(fā)現(xiàn)三羧酸循環(huán)；1941年德國李普曼發(fā)現(xiàn)ATP高能鍵在代謝過程中的重要作用；并在1947-1951年發(fā)現(xiàn)乙酰CoA在TCA循環(huán)中的重要地位；1953年美國華特森和英國克里克根據(jù)維爾肯做DNA的X

光衍射資料，提出DNA一級雙螺旋的分子結(jié)構(gòu)模型；1954年美籍俄國人伽莫夫首次提出一個核苷酸編成一個遺傳密碼的“三聯(lián)密碼說”。1961年克里克加以了證實；1955~1956年美籍西班牙人奧巧阿和美國孔勃首次用酶促法人工合成核糖核酸RNA和DNA；1961年法國雅各布和莫諾首次提出mRNA的存在，證實

mRNA與DNA的堿基互補以及蛋白質(zhì)的合成場所---核糖體，同時發(fā)現(xiàn)了操縱子的基因集團；80年代發(fā)展了生物工程和生物技術(shù)。人類基因組計劃（humangenomeproject）：美國RenatoDulbecco在1985年提出,美國政府1990年10月正式啟動,耗資30億美元，旨在畫出一張人體地圖,找到46條染色體上30億個堿基對約10萬個基因的準確位置，破譯人類全部遺傳信息，使人類第一次在分子水平上全面認識自己。是生命科學領(lǐng)域有史以來最寵大的全球性研究計劃，“生命登月計劃”。2000年6月26日,克林頓親自在白宮發(fā)表了人類基因密碼組合草圖。后基因組計劃將進一步深入研究各種基因的功能與調(diào)節(jié)。拿著基因組圖譜去看病；10年內(nèi)基因檢測會成為例行手段；基因療法會成為常規(guī)療法。

中國近代生物化學的發(fā)展吳憲與汪猷、張昌潁等人一起完成了蛋白質(zhì)變性理論、血液生化檢測和免疫化學等一系列有重大影響的研究，成為我國生物化學界的先驅(qū)。

1965年，我國首次人工合成了結(jié)晶牛胰島素。

1981年又成功合成了酵母丙氨酰tRNA。本世紀末我國參與了人類基因組計劃。生物化學與臨床醫(yī)學1、Alldiseasehasabiochemical

basis.2、Biochemicalstudiescontributetodiagnosis,prognosisandtreatment.3、Manybiochemistrystudiesilluminatediseasemechanismsanddiseaseinspireresearchinspecificareaofbiochemistry。總目錄第一篇生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能第二篇物質(zhì)代謝及其調(diào)節(jié)第三篇基因信息的傳遞第四篇專題篇第一編生物大分子結(jié)構(gòu)與功能第一章蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能第二章酶第三章維生素與輔酶第四章核酸的結(jié)構(gòu)與功能第一章蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能第一節(jié)氨基酸與多肽第二節(jié)蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)第三節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系第四節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及分離純化

蛋白質(zhì)的元素組成碳、氫、氧，還有氮和少量硫等C50~55%H6~7%O19~24%N13~19%S0~4%有些蛋白質(zhì)還含有P、Fe、Cu、Mn、Zn、Se等。各種蛋白質(zhì)含氮量接近，平均為16%。

1克氮相當于6.25克蛋白質(zhì)為測定樣品中蛋白質(zhì)含量的依據(jù)。凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量：蛋白質(zhì)含量=蛋白氮×6.25蛋白質(zhì)是由20種L-型α氨基酸組成的長鏈分子，包括：

1、簡單（單純）蛋白質(zhì)：完全由氨基酸構(gòu)成；

2、結(jié)合（綴合）蛋白質(zhì)：還有非蛋白質(zhì)成份的輔基或配基。蛋白質(zhì)構(gòu)象：每一種天然的蛋白質(zhì)都有自己特有的空間結(jié)構(gòu)，這稱為蛋白質(zhì)構(gòu)象。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的不同組織層次：1、一級結(jié)構(gòu)：多肽鏈共價主鏈的氨基酸順序；2、二級結(jié)構(gòu)：多肽鏈以氫鍵排列成沿一維方向的周期性結(jié)構(gòu)的構(gòu)象，如纖維狀蛋白質(zhì)中的-α螺旋和-β折疊片；3、三級結(jié)構(gòu)：多肽鏈以各次級鍵（非共價鍵）盤繞成具有特定走向的緊密球狀構(gòu)象；4、四級結(jié)構(gòu)：寡聚蛋白質(zhì)中各亞基之間在空間上的相互結(jié)合方式。第一節(jié)氨基酸與多肽一、氨基酸及其分類組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸均為L-α-氨基酸HCOO-RH3N+L-氨基酸通式

與羧基相鄰的α-碳（Cα）上都有一個氨基，因此稱為α-氨基酸。α-碳上還連著一個H和一個可變的側(cè)鏈R基，各種氨基酸的區(qū)別在于R基的不同。1、非極性疏水性氨基酸20種氨基酸按側(cè)鏈R的理化性質(zhì)分為4類：2、極性中性氨基酸3、酸性氨基酸4、堿性氨基酸人體必需氨基酸有八種：

MetTrpLysValIleLeuPheThr

“假設(shè)來借一兩本書”脯氨酸為亞氨基酸。2H-OOCCHCH2SH+NH3HSCH2CH-OOC+NH3-OOCCHCH2SSCH2CH-OOC+NH3+NH3二硫鍵胱氨酸半胱氨酸（Cys）常以胱氨酸的形式存在二、氨基酸的理化性質(zhì)一、氨基酸的旋光性除甘氨酸外，其余的α-碳原子為不對稱碳原子，其結(jié)合的四個不同的取代基在空間的排列可有兩種形式：L型和D型。

L型：氨基在左邊D型：氨基在右邊

D-α-氨基酸L-α-氨基酸

它們互為光學異構(gòu)體。此外，蘇氨酸、異亮氨酸、羥脯氨酸和羥賴氨酸等還有一個不對稱碳原子，所以可存在4種光學異構(gòu)體（p.143，圖3-15）。

二、氨基酸的酸堿性質(zhì)（一）氨基酸的兼性離子形式：氨基酸能使水的介電常數(shù)增高，這是因為氨基酸在晶體和水中主要以兼性離子（偶極離子）的形式存在：

偶極離子形式的氨基酸是強極性分子，這就增加了水的介電常數(shù)。

(二）氨基酸的兩性解離：酸與堿的關(guān)系：HA（酸）←→A-（堿）+H+（質(zhì)子）酸是質(zhì)子（H+）的供體，堿是質(zhì)子的受體。氨基酸在水中的偶極離子既起酸（質(zhì)子供體）的作用，也起堿（質(zhì)子受體）的作用：因此是一類兩性電解質(zhì)。思考:為什么定量測定氨基酸的常用方法是甲醛滴定?

（三）氨基酸的等電點：氨基酸的帶電狀況與溶液的pH有關(guān)，改變pH可使氨基酸帶上正電荷或負電荷，也可使其處于正負電荷數(shù)相等，即凈電荷為零的兼性離子狀態(tài)。這時的溶液pH值即為該氨基酸的等電點（pI）（見p.131，圖3-9）。在等電點以上的任一pH，氨基酸帶凈負電荷，并因此在電場中將向正極移動；在低于等電點的任一pH，氨基酸帶正電荷，在電場中將向負極移動。三、氨基酸的化學反應(yīng)（一）α-氨基參加的反應(yīng)1、與亞硝酸反應(yīng)：生成氮氣

可根據(jù)氮氣體積，進行氨基酸定量和蛋白質(zhì)水解程度的測定（生成的氮氣只有一半來自氨基酸）2、與酰化試劑反應(yīng)：氨基被酰基化

?；噭┛杀挥米靼被谋Ｗo劑3、烴基化反應(yīng)：氨基中的H原子被烴基取代

可用來鑒定N-末端氨基酸4、形成西佛堿反應(yīng)：氨基與醛類反應(yīng)形成弱堿

是某些酶促反應(yīng)的中間產(chǎn)物（如轉(zhuǎn)NH2反應(yīng)）

（二）α-羧基參加的反應(yīng)1、成鹽和成酯反應(yīng)：與堿作用生成鹽；與醇反應(yīng)生成酯

2、成酰氯反應(yīng)：在氨基被保護下，羧基與五氯化磷等作用生成酰氯

可使羧基活化，易與另一氨基酸的氨基結(jié)合，在人工多肽合成中使用。

3、脫羧反應(yīng)：在氨基酸脫羧酶作用下，放出CO2而生成相應(yīng)的一級胺（三）α-氨基和α-羧基共同參加的反應(yīng)

1、與茚三酮反應(yīng)：在弱酸中與茚三酮共熱，引起脫氧、脫羧反應(yīng)，最后茚三酮再與產(chǎn)生的NH3和還原茚三酮作用生成紫色物質(zhì)

可定性或定量（分光光度法和測壓法）測定各種氨基酸。脯氨酸和羥脯氨酸反應(yīng)生成黃色物質(zhì)2、成肽反應(yīng)：氨基酸與氨基酸之間的氨基與羧基可縮合成肽，形成肽鍵H2NCHCOOHR1+H2NCHCOOHR2H2NCHCONHCHR1R2COOH肽鍵H2二肽O三、氨基酸混合物的分析分離一、分配層析層析系統(tǒng)：固定相（靜相）

，流動相（動相）

。動相可以充滿靜相的空隙中，并能流過靜相。物質(zhì)可以在動相和靜相之間發(fā)生分配。氨基酸混合物中各種氨基酸成分在一定的動相和靜相之間的分配系數(shù)有差異，當動相流經(jīng)靜相時，不同分配系數(shù)的氨基酸就會隨著動相流經(jīng)靜相時在兩相之間發(fā)生不同的連續(xù)分配，從而將不同的氨基酸分離開。二、分配層析種類1、分配柱層析

5、氣液相層析2、紙層析

6、高效液相層析3、薄層層析4、離子交換層析：氨基酸分析儀1、分配柱層析固定相：層析柱中的填充物結(jié)合一層不會流動的結(jié)合水流動相：沿固定相流過的溶劑填充料似無數(shù)的微觀“分溶管”，當流動相移動時，加在柱上端的氨基酸混合物樣品在兩相之間發(fā)生連續(xù)分配，這樣不同分配系數(shù)的各種成分沿柱以不同速度向下移動。2、紙層析固定相：濾紙纖維素上吸附的水流動相：展層用的溶劑將氨基酸混合物點在濾紙的一個角上（原點），然后在密閉的容器中用溶劑沿濾紙的一個方向展層。然后旋轉(zhuǎn)90o，再用另一溶劑進行第二向展層。由于各種氨基酸在兩個溶劑系統(tǒng)中具有不同的分配系數(shù)，由此彼此分開。3、離子交換層析固定相：陽離子交換樹脂或陰離子交換樹脂流動相：洗脫液陽離子交換樹脂含有酸性基團，可解離H+離子而使樹脂帶負電荷。在酸性環(huán)境中，氨基酸陽離子可與H+發(fā)生交換而“結(jié)合”在樹脂上；陰離子交換樹脂含有堿性基團，可解離出OH-離子而使樹脂帶正電荷。在堿性環(huán)境中，氨基酸陰離子可和OH-發(fā)生交換而“結(jié)合”在樹脂上。逐步改變洗脫液的pH和鹽濃度（離子強度），可將各種氨基酸以不同速度洗脫下來.四、多肽

（一）肽鍵與肽鏈H2NCHCOOHR1+H2NCHCOOHR2H2NCHCONHCHR1R2COOH肽鍵H2O二肽寡肽(oligopeptide)多肽(polypeptide)氨基酸殘基(reside):主鏈、側(cè)鏈氨基末端(aminoterminal)或N末端羧基末端（carboxylterminal）或C末端H2NCHCONHCHR1R2CONHCHR3CONHCHR4COOH主鏈側(cè)鏈N末端C末端（二）重要的多肽1、谷胱甘肽（Glutathione，γ-GSH）

谷氨酰半胱氨酰甘氨酸

GSH具有重要的功能：1）解毒功能：與重金屬離子、環(huán)氧化物（致癌物）結(jié)合排出體外。2）維持紅細胞膜的完整性。3）參與高鐵血紅蛋白的還原作用。4）促進鐵的吸收。2、多肽類激素：促甲狀腺素釋放激素。3、多肽類抗生素：短桿菌肽4、酪蛋白磷肽（促進鈣吸收劑CPP）CPP分子中具有絲氨酸磷酸化結(jié)構(gòu)，腸道內(nèi)有鈣能與CPP上的磷結(jié)合使之成為可溶性鈣，利于小腸對其吸收。一、蛋白質(zhì)的分類按組成分類:單純蛋白質(zhì)：如血清清蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)：核蛋白、糖蛋白、脂蛋白、磷蛋白、金屬蛋白、色蛋白。按溶解度分類：清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶谷蛋白、硬蛋白、組蛋白、精蛋白。按分子形狀分類：纖維狀蛋白質(zhì)：分子構(gòu)象呈纖維形，長/短軸之比大于10，多為結(jié)構(gòu)蛋白，難溶于水。球狀蛋白質(zhì)：近似球形或橢圓形，多數(shù)可溶于水或鹽溶液。第二節(jié)蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)二、蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)（PrimaryStructure）蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)指多肽鏈中氨基酸的排列順序。1954年英國生化學家Sanger報道了胰島素的一級結(jié)構(gòu)，是世界上第一例確定一級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。Sanger由此1958年獲Nobel化學獎。1965年我國科學家完成了結(jié)晶牛胰島素的合成，是世界上第一例人工合成蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)由遺傳信息決定，其一級結(jié)構(gòu)決定高級結(jié)構(gòu)，一級結(jié)構(gòu)是基本結(jié)構(gòu)。但一級結(jié)構(gòu)并不是決定蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的唯一因素。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定的意義許多先天性疾病是由于某一重要的蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)發(fā)生了差錯引起的。如血紅蛋白β亞基6位Glu被Val代替（基因突變），即表現(xiàn)為鐮刀狀貧血，為世上最常見的血紅蛋白病。若β亞基6位Glu被Lys取代引起另一類貧血：血紅蛋白C病。比較不同生物細胞色素C的一級結(jié)構(gòu)可以幫助了解物種間的進化關(guān)系，物種間越接近，則細胞色素C的一級結(jié)構(gòu)越相似。（一）肽和肽鍵結(jié)構(gòu)1、肽鏈的結(jié)構(gòu)特點是：（1）肽鏈中的骨干是單位規(guī)則地重復(fù)排列，稱之為共價主鏈：

（2）每個肽鍵的形成都丟失一個水分子，故肽鍵中的氨基酸稱氨基酸殘基。（3）各種肽鏈的主鏈結(jié)構(gòu)一樣，但側(cè)鏈R基即氨基酸殘基的順序不同。（4）一條多肽鏈通常在一端含有一個游離的末端氨基，稱N端；另一端含一個游離的末端羧基，稱C端。2、肽的命名：從N端氨基酸開始，稱某氨基酰某氨基?！嘲被幔绾唽懀篠er-Gly-Tyr-Ala-Leu。

3、肽鍵的平面結(jié)構(gòu)：

順式構(gòu)型中的兩個Cα彼此接近，引起各R基之間的空間位阻，造成結(jié)構(gòu)不穩(wěn)；反在式構(gòu)型中兩者相距較遠，結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定。肽鏈中的肽鍵全是反式構(gòu)型。4、肽鍵共振（p.164，圖4-2）：

肽鍵是一種酰胺鍵，通常在羰基碳和酰胺氮之間是單鍵，這樣肽鏈主鏈上的3種鍵（Cα-C鍵，C-N肽鍵，N-Cα鍵）都是單鍵，所以原則上多肽主鏈上的任何共價鍵都可發(fā)生旋轉(zhuǎn)。

但在酰胺氮和羰基氧之間會發(fā)生共振相互作用，其結(jié)果表現(xiàn)兩種極端形式：

C和O之間有一個σ鍵和一個π鍵連接，而酰胺N上留有一個孤電子對，這種結(jié)構(gòu)允許C-N鍵自由旋轉(zhuǎn)（A）；

C和N原子參與π鍵的形成，在羰基O上留下一個孤e-對，帶負電荷，酰胺N帶正電荷，這樣C-N鍵就成為一個雙鍵，阻繞C-N鍵的自由旋轉(zhuǎn)（B）。

肽鍵共振的結(jié)果：（1）阻繞肽鍵C-N的自由旋轉(zhuǎn)，只保留N-Cα鍵和Cα-C鍵的旋轉(zhuǎn)；（2）組成肽基的4個原子和2個相鄰的Cα原子傾向于共平面，形成多肽主鏈的酰胺平面。（二）肽的物理和化學性質(zhì)1、物理性質(zhì)在水溶液中以偶極離子存在，這決定于游離末端α-NH2，α-COOH以及酸性和堿性氨基酸側(cè)鏈R基團上可解離的功能團。肽鍵中的亞氨基不解離。2、化學反應(yīng)（1）游離的-NH2和-COOH及R基團可發(fā)生與氨基酸中相應(yīng)的基團類似的反應(yīng)；（2）N末端的氨基酸殘基也能與茚三酮發(fā)生定量呈色反應(yīng)；（3）雙縮脲反應(yīng)為肽和蛋白質(zhì)所特有、而氨基酸所沒有的一種顏色反應(yīng)（紫紅色或紫藍色，與CuSO4堿性液反應(yīng)），借助分光光度計可定量分析。（三）蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)與功能一級結(jié)構(gòu)的局部斷裂與蛋白質(zhì)激活有些蛋白質(zhì)分子的部分肽鏈按特定方式斷裂后才能呈現(xiàn)生物活性。1、血液凝固的機理：凝血酶致活物交聯(lián)的纖維蛋白（血凝塊）纖維蛋白溶解致活物

凝血酶原不溶性纖維蛋白纖維蛋白溶酶原

凝血酶（活性）纖維蛋白原纖維蛋白溶酶（活性）

纖維蛋白溶解

凝血酶致活物作用凝血酶原，使其分子中的二個肽鍵斷裂。釋放出一個N端片段后成為有活性的凝血酶（p.187，圖4-21）；纖維蛋白原由2α條鏈、2β條鏈和2γ條鏈組成，在凝血酶作用下，從2條α鏈和2β條鏈的N端各斷裂一個-Arg-Gly-鍵，釋放出2個纖維肽A和2個纖維肽B，而剩下的纖維蛋白分子成為形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的不溶性纖維蛋白（p.188，圖4-22，23）。

凝血酶致活物作用凝血酶原，使其分子中的二個肽鍵斷裂。釋放出一個N端片段后成為有活性的凝血酶；纖維蛋白原由2α條鏈、2β條鏈和2γ條鏈組成，在凝血酶作用下，從2條α鏈和2β條鏈的N端各斷裂一個-Arg-Gly-鍵，釋放出2個纖維肽A和2個纖維肽B，而剩下的纖維蛋白分子成為形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的不溶性纖維蛋白。

纖維蛋白原纖維蛋白單體纖維蛋白的生成及聚合暴露了粘合位點2、胰島素原的激活：胰島素原可分三部分：中間的連接肽（C肽），兩側(cè)的A鏈和B鏈。

C肽的一端通過兩個堿性氨基酸殘基（31、32位）與A鏈的C末端相連，另一端通過另兩個堿性氨基酸殘基（62、63位）與B鏈的N末端相連：

A鏈------31—32----C肽----62—63------B鏈

SSSS

在高爾基體內(nèi)，特異的肽酶斷裂二個特定的肽鍵，釋放包括C肽的一段中間肽鏈后成為有活性的胰島素（A鏈和B鏈以二個二硫鍵相連著）。

三、蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)（secondarystructure）二級結(jié)構(gòu)：多肽鏈中各原子在局部空間或一段肽鏈的氨基酸殘基的空間排布方式。為主鏈構(gòu)象，不涉及側(cè)鏈構(gòu)象。（一）構(gòu)型與構(gòu)象構(gòu)型：立體異構(gòu)體中取代原子或基團在空間的取向

構(gòu)象：取代基團在單鍵旋轉(zhuǎn)時可能形成的不同的立體結(jié)構(gòu)

一個碳原子和四個不同的基團相連時，只可能有兩種不同的空間排列，即構(gòu)型，兩種構(gòu)型的互變需要共價鍵的斷裂；而構(gòu)象的改變不涉及共價鍵的斷裂，構(gòu)象可以是無數(shù)種，其中交叉型的構(gòu)象最穩(wěn)定，重疊型的最不穩(wěn)定。

（二）肽單元（peptideunit）或肽鍵平面：

1925年L.Pauling和R.B.Corey等用X線衍射分析肽鍵的C—N鍵長時發(fā)現(xiàn)其鍵長為0.132nm，不同于C—N單鍵鍵長0.149nm，也不同于C=N雙鍵鍵長0.127nm，介于二者之間，故其有一定程度的雙鍵性能，C與N不能以C—N為軸心自由旋轉(zhuǎn)。參與肽鍵的6個原子Cα1、C、O、N、H、Cα2被約束于一個平面上，稱為肽鍵平面，為形成二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。（三）二級結(jié)構(gòu)類型

1、蛋白質(zhì)α螺旋結(jié)構(gòu)(α-helix)PaulingandCorey提出。右手螺旋(順時針)。肽鏈的主鏈形成緊密的螺旋，側(cè)鏈伸向外側(cè)，每一圈包含3.6個氨基酸殘基，每個殘基跨距為0.15nm，螺旋上升一圈的距離(螺距)為3.6×0.15=0.54nm。螺旋通過氫鍵維持穩(wěn)定。第一個肽鍵的NH和第四個肽鍵的CO形成氫鍵，第n個肽鍵的NH和第n+3個肽鍵的CO形成氫鍵。蛋白質(zhì)中的α-螺旋幾乎都是右手螺旋（穩(wěn)定），原因見p.207-208。α螺旋結(jié)構(gòu)形成的限制因素:凡是有Pro存在的地方,不能形成。因Pro形成的肽鍵N原子上沒有H，不可能形成氫鍵。靜電斥力。若一段肽鏈有多個Glu或Asp相鄰，則因pH=7.0時都帶負電荷，防礙α螺旋的形成；同樣多個堿性氨基酸殘基在一段肽段內(nèi)，正電荷相斥，也防礙α螺旋的形成。位阻。如Asn、Leu側(cè)鏈很大，防礙α螺旋的形成。2、β—折疊（β-pleatedsheet）

兩條或多條幾乎完全伸展的多肽鏈側(cè)向聚集在一起，相鄰的肽鍵主鏈上的-NH和C=O之間形成有規(guī)則的氫鍵，這樣的多肽構(gòu)象就是β-折疊片。在此構(gòu)象中，所有的肽鍵都參與鏈間氫鍵的交聯(lián)，氫鍵與肽鍵的長軸接近垂直。N端反平行式C端N端β—折疊靠不同肽鍵之間的肽鍵上CO與NH形成氫鍵而得以穩(wěn)定。反平行式比平行式穩(wěn)定。平行式N端3、β—轉(zhuǎn)角（β-turn）：

β—折疊反平行式的轉(zhuǎn)折處。第一個殘基的C=O與第四個殘基的NH形成氫鍵。脯氨酸和甘氨酸常在這種結(jié)構(gòu)中存在。脯氨酸具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)和固定的φ角，能迫使β轉(zhuǎn)角的形成；甘氨酸缺少側(cè)鏈，在β轉(zhuǎn)角中能很好地調(diào)整其他殘基的空間阻礙。4、無規(guī)卷曲（randomcoil）：沒有確定的規(guī)律性。超二級結(jié)構(gòu)若干相鄰的二級結(jié)構(gòu)單元組合在一起，彼此相互作用，形成有規(guī)則、在空間上能辨認的二級結(jié)構(gòu)組合體，充當三級結(jié)構(gòu)的組體，這稱為超二級結(jié)構(gòu)。有三種基本組合方式：（1）αα：有兩股或三股右手-螺旋彼此纏繞而成的左手超螺旋，重復(fù)距離約140?。螺旋鏈之間是由向著超螺旋內(nèi)部的非極性側(cè)鏈相互作用，而極性側(cè)鏈處于蛋白質(zhì)分子表面，與水接觸。超螺旋的穩(wěn)定性主要是非極性側(cè)鏈間的范德華相互作用的結(jié)果。（2）βαβ：最簡單的βαβ組合是由二段平行式的β-鏈和一段連接鏈組成。連接鏈是α-螺旋或無規(guī)則卷曲，大體上反平行于β-鏈。最常見的βαβ組合是由三段平行式的β-鏈和二段α-螺旋鏈構(gòu)成。連接鏈都是以右手交叉連接方式處于β-折疊片的一側(cè)。

（3）ββ：有β-曲折和回形拓撲結(jié)構(gòu)二種組合形式。

β-曲折是由一級結(jié)構(gòu)上連續(xù)、在β-折疊中相鄰的三條反平行式β-鏈通過緊湊的β-轉(zhuǎn)角連接而成。回形拓撲結(jié)構(gòu)也是反平行式β-折疊片通過緊湊的β-轉(zhuǎn)角連接形成，但構(gòu)成的是回形結(jié)構(gòu)。模序（motif）：蛋白質(zhì)分子中，二個或三個具有二級結(jié)構(gòu)的肽段，在空間上相互接近，形成一個有特殊功能的空間結(jié)構(gòu)。如鈣結(jié)合蛋白中的結(jié)合鈣離子的模序。α螺旋α螺旋NCCa2+鈣結(jié)合蛋白中的結(jié)合鈣離子的模序蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的正確形成除一級結(jié)構(gòu)為決定因素外，還需要一類稱為分子伴侶（chaperon）的蛋白質(zhì)參加。分子伴侶可防止錯誤的聚集發(fā)生，使肽鏈正確的折疊；也可與錯誤聚集的肽段結(jié)合，使之解聚后，再誘導(dǎo)其正確折疊。分子伴侶對二硫鍵的形成起重要作用。四、蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)（teritarystucture）三級結(jié)構(gòu):整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置，即整條肽鏈的三維構(gòu)象。結(jié)構(gòu)域:在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中形成一緊密的結(jié)構(gòu)，具有特殊的功能，多為蛋白質(zhì)的活性部位。有的蛋白質(zhì)分子有一個結(jié)構(gòu)域，有的有多個，如纖連蛋白含有6個結(jié)構(gòu)域。維持蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的主要作用力為側(cè)鏈間的相互作用:氫鍵、離子鍵、疏水鍵及二硫鍵。1、氫鍵如水分子

多肽主鏈上的羰基氧和酰氨氫之間形成的氫鍵是維持蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要作用力。

側(cè)鏈與側(cè)鏈、側(cè)鏈與介質(zhì)水、主鏈肽基與側(cè)鏈或主鏈肽基與水之間形成的氫鍵，參與三級結(jié)構(gòu)。

電負性原子（N、O、S）與氫形成的基團（N-H、O-H）具有很大的偶極距，成鍵電子云分布偏向負電性大的重原子核，而氫原子核周圍的電子分布就少，正電荷的氫核就在外側(cè)裸露，所以遇到另一個電負性強的原子時，就產(chǎn)生靜電吸引，即所謂氫鍵：

X─H-----YX、Y是負電性強的原子，X─H是共價鍵，H----Y是氫鍵，X是氫（質(zhì)子）供體，Y是氫（質(zhì)子）受體。2、疏水鍵

水介質(zhì)中球狀蛋白質(zhì)總是傾向把疏水殘基埋藏在分子的內(nèi)部，這稱疏水相互作用（疏水效應(yīng)）。疏水相互作用是疏水基團或疏水側(cè)鏈出自避開水的需要而被迫接近。3、離子鍵是正電荷與負電荷之間的一種靜電相互作用。在生理pH下，酸性氨基酸（Asp、Glu）的側(cè)鏈可解離成負離子，堿性氨基酸（Lys、Arg、His）的側(cè)鏈可解離成正離子。大多數(shù)情況下，這些基團分布在球狀蛋白分子表面，與介質(zhì)水分子發(fā)生電荷-偶極之間的相互作用形成排列有序的水化層，對穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象有一定作用(負電荷----H+-OH，正電荷----HO--H+)。4、二硫鍵是肽鏈內(nèi)部或肽鏈間的半胱氨酸的巰基之間形成的共價鍵，它對穩(wěn)定構(gòu)象起作用。大多數(shù)二硫鍵在β-轉(zhuǎn)角附近形成。5、范德華力包括三種較弱的作用力：（1）定向效應(yīng)：發(fā)生在極性分子或基團之間，是永久偶極間的靜電相互作用，氫鍵屬于這種范德華力。(-OH------HO-)（2）誘導(dǎo)效應(yīng)：發(fā)生在極性物質(zhì)與非極性物質(zhì)之間，是永久偶極與由它誘導(dǎo)而來的誘導(dǎo)偶極之間的相互作用。(-OH-------CH3-)（3）分散效應(yīng)：為主要的范德華力，是非極性分子或基團間的相互作用。這是瞬時偶極，即偶極方向瞬時變化，是由其所在的分子或基團中電子電荷密度的波動所造成的。

(-CH3-----------CH3-)

范德華力包括吸引力和斥力兩種相互作用。因此，范德華力（吸引力）只有當兩個非鍵原子處于一定距離時才達到最大，這稱范德華距離（=兩個原子的范德華半徑之和）。

蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域多肽鏈在超二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進一步折疊成近乎球狀的結(jié)構(gòu)，就是三級結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)域：對于較小的蛋白質(zhì)分子或亞基---其三級結(jié)構(gòu)=結(jié)構(gòu)域；對于由兩個或兩個以上相對獨立的三維實體締合而成的三級結(jié)構(gòu)---------三維實體=結(jié)構(gòu)域。所以，結(jié)構(gòu)域是球狀蛋白質(zhì)的折疊單位。結(jié)構(gòu)域的意義：（1）從結(jié)構(gòu)形成來看，一條長的多肽鏈先分別折疊成幾個相對獨立的區(qū)域，再締合成三級結(jié)構(gòu)要比直接折疊成三級結(jié)構(gòu)在動力學上更為合理；（2）從功能來看，多結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)活性中心往往位于結(jié)構(gòu)域之間，這樣容易構(gòu)建具有特定三維排布的活性中心。結(jié)構(gòu)域之間常有一段肽鏈相連，形成“鉸鏈區(qū)”使結(jié)構(gòu)域容易發(fā)生相對運動，有利于別構(gòu)中心結(jié)合調(diào)節(jié)物和發(fā)生別構(gòu)效應(yīng)。

五、蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)（quaternarystructure）（一）四級結(jié)構(gòu)的概念四級結(jié)構(gòu)：亞基的種類和數(shù)目、各亞基的空間排布。亞基（subunit）：有的蛋白質(zhì)分子由兩條以上的肽鏈通過非共價鍵相連聚合而成，每條多肽鏈稱為一個亞基，即每個三級結(jié)構(gòu)的球狀蛋白質(zhì)。也稱單體蛋白質(zhì)。維持四級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的因素為各亞基之間的作用力如氫鍵、離子鍵、疏水鍵。含有四級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，單獨的亞基一般沒有生物學功能，只有完整的四級結(jié)構(gòu)才有生物學功能。多體蛋白質(zhì)（寡聚蛋白質(zhì)）：由二個或多個亞基組成的蛋白質(zhì)（如二體蛋白質(zhì)、四體蛋白質(zhì)）。對稱的寡聚蛋白質(zhì)：由二個或多個不對稱的等同結(jié)構(gòu)（原體）組成。原體一般是一個亞基，也可以是二個或多個原體的聚集體。如：血紅蛋白分子由二個原體對稱組成，每個原體由一個α亞基和一個β亞基構(gòu)成（αβ）。這里，如果把原體看作單體，則是二體；如果把亞基看作單體，則是四體。（二）寡聚蛋白質(zhì)與別構(gòu)效應(yīng)1、別構(gòu)蛋白的結(jié)構(gòu)和效應(yīng)：別構(gòu)蛋白質(zhì)就是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，具有別構(gòu)效應(yīng)，即蛋白質(zhì)與配基結(jié)合可改變蛋白質(zhì)構(gòu)象，進而改變其生物活性。別構(gòu)蛋白質(zhì)都是寡聚蛋白質(zhì)。分子中每個亞基都有活性部位或者還有別構(gòu)部位（調(diào)節(jié)部位）。這樣別構(gòu)蛋白質(zhì)分子中至少含有二個活性部位或者還有別構(gòu)部位，各部位之間可通過構(gòu)象變化傳遞發(fā)生的過程，構(gòu)象變化可以從一個原體傳遞給另一個原體，引起協(xié)同的相互作用。

同位效應(yīng)：相互作用的都是活性部位，即一個亞基與配基的結(jié)合會影響另一個亞基與配基的結(jié)合。如果這種影響是促進作用，則是正協(xié)同效應(yīng)；如果這種影響是降低作用，則是負協(xié)同效應(yīng)。

異位效應(yīng)：別構(gòu)部位與活性部位之間的相互影響。2、血紅蛋白的結(jié)構(gòu)和功能：血紅蛋白由4個亞基組成（α2β2），每個亞基都有一個血紅素基和一個氧結(jié)合部位（p.260，圖6-10）。

O2在這里是正協(xié)同效應(yīng)物，血紅蛋白的氧合具有正協(xié)同效應(yīng)：一個O2的結(jié)合會增加同一血紅蛋白分子中其余的氧結(jié)合部位對O2的親和力。（具體參閱p.261-263）。第三節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系一、一級結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的基礎(chǔ)蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)決定高級結(jié)構(gòu)，一級結(jié)構(gòu)是基本結(jié)構(gòu)。

Anfinsen在研究核糖核酸酶時發(fā)現(xiàn)。58658426954011072天然狀態(tài)β-巰基乙醇尿素SHSH5826_40SHSHSH657284SH95SH110SH84269540110586572天然狀態(tài)無活性二、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系（一）肌紅蛋白（Myoglobin）Mb存在于肌肉中，心肌含量特別豐富。是分子量為16700的小分子球狀蛋白質(zhì)，由153個氨基酸殘基及一個血紅素組成。五十年代，英國科學家JohnKendrew和Perutz用X衍射對抹香鯨肌紅蛋白的三級結(jié)構(gòu)研究獲得成功，是第一個獲得完整構(gòu)象的蛋白質(zhì)。它有8段α螺旋結(jié)構(gòu)：A、B、C、D、E、F、G、H。整條肽鏈折疊成緊密球狀分子，疏水側(cè)鏈大都在分子內(nèi)部，極性帶電荷的則在分子表面，因此水溶性好。1962年Kendrew和Perutz由于測定了肌紅蛋白及血紅蛋白的高級結(jié)構(gòu)而獲Nobel化學獎。Mb分子內(nèi)部有一個口袋形空穴，血紅素居于其中。血紅素是血紅蛋白及細胞色素等的輔基，具有重要的生理功能。血紅素是含鐵的卟啉化合物，卟啉由四個吡咯環(huán)組成，鐵原子位于卟啉環(huán)的中央，F(xiàn)e2+有6個配位鍵，其中4個和吡咯環(huán)的N配位結(jié)合，1個與Mb93位（F8）His結(jié)合，氧與Fe2+形成第6個配位鍵，接近64位E7His。（二）血紅蛋白(Hemoglobin)血紅蛋白（Hb）由四個亞基(珠蛋白)和血紅素組成。成人紅細胞中主要為HbA1(α2β2)，其中α鏈141aa，β鏈146aa，各帶有一個血紅素與O2結(jié)合，所以一分子Hb能與4分子O2結(jié)合。不同發(fā)育階段α鏈相同,β鏈不同，胎兒期為αγ，胚胎期為αε。Mb與Hb的氧飽和曲線

Hb氧飽和曲線為S形，Mb為直角雙曲線。

說明Mb對氧有很強的親和力。在體內(nèi)毛細血管中氧分壓大于4KPa(30mmHg)，組織中Mb幾乎全與O2結(jié)合而達到飽和，只有細胞內(nèi)氧耗很大而使PO2下降到很低時，Mb才釋放其中的氧，故組織中的肌紅蛋白是很好的儲氧物質(zhì)。Mb的P50=0.13KPa(1mmHg)Mb：Mb與O2結(jié)合的直角雙曲線提示單個血紅素與1個O2結(jié)合的一個恒定平衡常數(shù)（三）Mb與Hb的氧飽和曲線

Mb為直角雙曲線，Hb氧飽和曲線為S形。Hb：Hb與O2結(jié)合的S型曲線提示其4個亞基與4個O2結(jié)合時平衡常數(shù)不同。K1＜K2=K3＜K4協(xié)同效應(yīng):一個亞基與其配體結(jié)合后，能影響此寡聚體中另一亞基與配體的結(jié)合能力。正協(xié)同效應(yīng)、負協(xié)同效應(yīng).Perutz等利用X線衍射分析了Hb和氧合Hb的三維結(jié)構(gòu)圖譜，解釋了正協(xié)同效應(yīng)。未結(jié)合O2時，Hb結(jié)構(gòu)緊密，稱為緊張態(tài)（T態(tài)），T態(tài)Hb與O2親和力?。唤Y(jié)合O2

后，結(jié)構(gòu)變得相對松弛，稱為松弛態(tài)（R態(tài)）。變構(gòu)效應(yīng)（allostericeffect）：一個蛋白質(zhì)與它的配體或其它蛋白質(zhì)結(jié)合后，蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生變化，使它更適合于功能需要。小分子O2稱為變構(gòu)劑。Bohr效應(yīng)：1904年ChristianBohr發(fā)現(xiàn)Hb與O2的結(jié)合也受CO2及pH影響。PCO2升高時，Hb與O2的結(jié)合降低，酸性溶液中Hb與O2的親合力也降低，氧解離曲線右移。故PCO2升高實際上是pH下降影響Hb。pH降低，即溶液中H+濃度升高，使-NH2及咪唑基等質(zhì)子化，有利于分子內(nèi)部鹽鍵的形成，使Hb結(jié)構(gòu)趨向緊密，從而降低Hb與O2親和力，Mb沒有四級結(jié)構(gòu)也就沒有Bohr效應(yīng)。Bohr效應(yīng)使Hb運輸O2效率更為提高。肺部呼出CO2，PCO2下降，Hb與O2親和力加強，利于結(jié)合更多氧輸入體內(nèi)。當血液流經(jīng)組織時，CO2自組織進入血液，PCO2升高，pH下降，Hb與O2親和力減弱，有利于O2釋放入組織。（三）纖維狀蛋白質(zhì)

纖維狀蛋白質(zhì)都是由幾條肽鏈絞合而成，難溶于水，如膠原蛋白、毛發(fā)中的角蛋白、彈性蛋白。主要功能是提供堅實的支架，連接各細胞、組織、器官。1、膠原蛋白（Collagen）

組織中膠原蛋白及彈性蛋白含量（占蛋白質(zhì)總量百分比）氨基酸組成特點：Gly占1/3，脯氨酸和羥脯氨酸占1/5以上，Tyr含量少，Trp、Cys缺乏，為營養(yǎng)不完全氨基酸。氨基酸序列及分型：膠原蛋白α是組成膠原的基本單位。膠原蛋白α又有數(shù)種（α1、α2鏈等），其氨基酸組成不同，但肽鏈長度近于相同。原膠原（Tropocollogen）：3條α鏈絞合一起，3條α鏈可以相同，也可以不同。不同類有膠原由于其α鏈的氨基酸組成及含糖量不同而性能不同。膠原纖維：電鏡下可見原膠原有規(guī)律地排列成原纖維。如Ⅰ型原膠原由三條長肽鏈相互盤繞成右手螺旋，每條長肽鏈本身為左手螺旋。其穩(wěn)定與其一級結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。原膠原的α鏈一級結(jié)構(gòu)中96%屬(Gly—X—Y）n，其中，X常為Pro，Y常為Hyp，在三鏈超螺旋中，Gly殘基在超螺旋內(nèi)側(cè)，Gly側(cè)鏈為H，故三鏈排列緊密。

-13Gly–Pro–Met–Gly–Pro–Ser–Gly–Pro–Arg--22Gly–Leu–Hyp–Gly–Pro–Hyp–Gly–Ala–Hyp--31Gly–Pro–Gln–Gly–Phe–Gln–Gly–Pro–Hyp-除了有范德華引力之外，GlyNH和鄰近鏈CO形成氫鍵，有賴于大量無側(cè)鏈的Gly存在于內(nèi)側(cè)，才能形成緊密的構(gòu)象。膠原蛋白合成后還受到一系列修飾。如脯氨酸及賴氨酸羥化為羥脯氨酸和羥賴氨酸，羥化反應(yīng)以Vc為輔因子。

ProPHase4-羥脯氨酸

O2+Fe+抗壞血酸

α-酮戊二酸VcCO2+琥珀酸賴氨酸殘基的ε氨基在賴氨酰氧化酶的催化下，可氧化成醛基，此醛基可與鄰近的賴氨酸氨基或羥賴氨酸的羥基縮合，形成共價鍵穩(wěn)定原纖維的結(jié)構(gòu)。因為羥化酶需要Vc，故Vc缺乏時此類穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的共價鍵不能形成,以致發(fā)生牙齦出血，創(chuàng)傷不易愈合等病變。2、彈性蛋白分布：富有彈性的組織，如肺、大動脈等。初合成時為水溶性單體稱為原彈性蛋白。原彈性蛋白從細胞分泌出來后，Lys的εNH2受賴氨酰氧化酶催化而氧化脫氨生成醛基。3個Lys衍生的醛基與1個Lys的εNH2縮合形成十字架樣的特殊交聯(lián)，使彈性蛋白卷曲而具有彈性。交聯(lián)后極穩(wěn)定，極難溶解.3、角蛋白毛發(fā)、指甲、羽毛為角蛋白。哺乳動物角蛋白為α-角蛋白、鳥類及爬行類為β-角蛋白。α-角蛋白富含半胱氨酸,并與鄰近的多肽鏈交聯(lián)，形成二硫鍵，因此α-角蛋白很難溶解，也經(jīng)受得起一定的拉力。毛料衣服易被蛀掉是由于一類蛾的幼蟲消化液中有大量巰基化合物，使二硫鍵還原成巰基，肽鏈之間的聚合被解除，肽鏈被消化。蠶絲蛋白是β折疊富含Gly、Ala、Ser。牢固但不能拉伸。（四）球狀蛋白質(zhì)肌紅蛋白（Myoglobin）Mb存在于肌肉中，心肌含量特別豐富。是分子量為16700的小分子球狀蛋白質(zhì)，由153個氨基酸殘基及一個血紅素組成。血紅素是血紅蛋白及細胞色素等的輔基,具有重要的生理功能。血紅素是含鐵的卟啉化合物，卟啉由四個吡咯環(huán)組成，鐵原子位于卟啉環(huán)的中央。Fe2+有6個配位鍵，其中4個和吡咯環(huán)的N配位結(jié)合，1個與Mb93位（F8）His結(jié)合，氧與Fe2+形成第6個配位鍵，接近64位E7His。五十年代，JohnKendrew用X衍射對抹香鯨肌紅蛋白的三級結(jié)構(gòu)研究獲得成功，是第一個獲得完整構(gòu)象的蛋白質(zhì)。它有8段α螺旋結(jié)構(gòu),A、B、C、D、E、F、G、H。整條肽鏈折疊成緊密球狀分子，疏水側(cè)鏈大都在分子內(nèi)部，極性帶電荷的則在分子表面，因此水溶性好。第四節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)一、蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量1、根據(jù)化學組成測定相對分子量用化學分析方法測定出蛋白質(zhì)中某一微量元素的含量，并根據(jù)蛋白質(zhì)分子中含有的微量元素數(shù)，可計算出蛋白質(zhì)的最低相對分子質(zhì)量。

鐵的原子量55.8×100=鐵的百分含量0.335最低相對分子質(zhì)量==16700肌紅蛋白含鐵量為0.335%。2、滲透壓法測定相對分子量當用一種半透膜將蛋白質(zhì)溶液與純水隔開時，只有水分子能自由地通過半透膜進入蛋白質(zhì)溶液，而蛋白質(zhì)分子卻不能透過進入純水中。由于滲透的結(jié)果，溶液內(nèi)體積增加，液面升高，直至達到一定的凈水壓力時維持平衡。這時的凈水壓力就是溶液在平衡濃度時的滲透壓。Π=nRT/V=（g/Mr）RT/V=cRT/MrΠ：滲透壓；V：溶液體積；n：溶液中溶質(zhì)的摩爾數(shù)；g：溶質(zhì)的質(zhì)量；c：溶質(zhì)的濃度；T：絕對溫度；R：氣體常數(shù)；Mr：溶質(zhì)的相對分子質(zhì)量？為什么要在蛋白質(zhì)分子處于等電點時測定滲透壓3、蛋白質(zhì)的擴散和擴散系數(shù)

把純水小心地放在蛋白質(zhì)溶液上面，蛋白質(zhì)分子將從下面的高濃度區(qū)向上面的低濃度區(qū)遷移，直至達到平衡，既蛋白質(zhì)均勻地分布在整個溶劑系統(tǒng)中。由于濃度差引起的這種溶質(zhì)分子的凈遷移為擴散。溶質(zhì)的擴散系數(shù)可由下式計算：C2C1e-X22-X214Dt=即測定兩個不同部位的濃度，就可計算擴散系數(shù)D。？為什么在用擴散系數(shù)確定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量時，需要與沉降系數(shù)結(jié)合來確定4、沉降分析法測定相對分子質(zhì)量

蛋白質(zhì)分子在溶液中受到強大離心力作用時，蛋白質(zhì)分子會沉降。沉降的速率與蛋白質(zhì)分子大小、密度、分子形狀以及溶液的密度和粘度有關(guān)。1、沉降速率法蛋白質(zhì)樣品溶液在離心力作用下，產(chǎn)生沉降界面。可通過界面移動的速率計算沉降系數(shù)，并計算蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量。2、沉降平衡法在離心力作用下，蛋白質(zhì)顆粒發(fā)生沉降。由于沉降的結(jié)果造成濃度梯度，因而產(chǎn)生了擴散作用，擴散力的作用方向與離心力相反?？赏ㄟ^測定擴散速率，計算出蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量。5、凝膠過濾法測定相對分子質(zhì)量

通過凝膠過濾可以把蛋白質(zhì)混合物按分子的大小分離開來。

蛋白質(zhì)分子通過凝膠柱的速度并不直接取決于分子的質(zhì)量，而是它的斯托克半徑。某種蛋白質(zhì)如果與一理想的非水化球體具有相同的過柱速度，則認為這種蛋白質(zhì)具有與此球體相同的半徑，稱蛋白質(zhì)分子的斯托克半徑。測定方法：首先側(cè)得幾種相對分子質(zhì)量已知的蛋白質(zhì)標準物的過柱速度，并以其相對分子質(zhì)量的對數(shù)與過柱速度作標準直線圖，然后測出蛋白質(zhì)樣品的過柱速度，即可從標準直線圖中確定樣品的相對分子質(zhì)量。5、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定相對分子質(zhì)量

蛋白質(zhì)顆粒在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時，其遷移率決定于其所帶的凈電荷、分子大小和形狀等。如果在聚丙烯酰胺凝膠中加入陰離子去污劑十二烷基硫酸鈉（SDS），則蛋白質(zhì)遷移率主要取決于其相對分子質(zhì)量，而與原來所帶的電荷和分子形狀無關(guān)。

SDS是一種有效變性劑，能破壞蛋白質(zhì)分子中的氫鍵和疏水作用，而巰基乙醇能破壞二硫鍵，因此在二者作用下，單體蛋白質(zhì)或亞基處于展開狀態(tài)，SDS與蛋白質(zhì)分子結(jié)合成復(fù)合體。復(fù)合體的形成造成了2種結(jié)果：1、不同蛋白質(zhì)被陰離子SDS覆蓋而具有相同密度的負電荷；2、不同蛋白質(zhì)單體分子由于SDS結(jié)合而具有統(tǒng)一的直徑，但長度隨蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量成正比變化。聚丙烯酰胺凝膠的分子篩效應(yīng)，使得電泳遷移率與多肽鏈分子量有如下關(guān)系：

LogMr=K1–K2（樣品遷移距離/前沿遷移距離）由于蛋白質(zhì)分子上除了肽鏈兩端有自由的α-NH2和α-COOH外，在側(cè)鏈上還有很多解離基團（ε-NH2、γ-COOH、β-COOH、咪唑基、胍基（精氨酸）），在一定的pH條件下都能解離成帶電基團，而使蛋白質(zhì)帶電。二、兩性電離及等電點等電點：當溶液在某一定pH環(huán)境中，使蛋白質(zhì)所帶正、負電荷相等，凈電荷為零，在電場中不向陽極也不向陰極移動。H2O+PCOO-NH2H+OH_PNH3+COO-PNH3+COOHH+OH-pH

＞pIpH＜pIpH=pI酸性氨基酸pI＜7，堿性氨基酸pI＞7。蛋白質(zhì)pI與所含氨基酸種類和數(shù)量有關(guān)，若蛋白質(zhì)中堿性aa較多，其pI偏堿，如從雄性魚類精子中提取的魚精蛋白含Arg多，其pI約為12；若含酸性aa較多，則pI偏酸。蛋白質(zhì)在等電點時其溶解度、導(dǎo)電性、粘度、滲透壓最小。蛋白質(zhì)等電點性質(zhì)為電泳分離的依據(jù).三、膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)水溶液是一種比較穩(wěn)定的親水膠體，這是因為蛋白質(zhì)顆粒表面帶有很多極性基團（親水基團向外翻，疏水基團向內(nèi)鉆），在蛋白質(zhì)顆粒外面形成一層水膜（水化層）；同時，蛋白質(zhì)顆粒在非等電點狀態(tài)時帶的相同電荷，使蛋白質(zhì)顆粒間相互排斥，不致相互凝聚沉淀。四、蛋白質(zhì)的沉淀作用如果使蛋白質(zhì)成為膠體的穩(wěn)定條件發(fā)生變化，就很容易使蛋白質(zhì)變得不穩(wěn)定而發(fā)生沉淀現(xiàn)象。

這種穩(wěn)定條件變化方法有：（1）在蛋白質(zhì)溶液中加入適當?shù)脑噭茐乃乃せ蛑泻退碾姾?。如無機鹽（硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等，中和電荷作用）、有機溶劑（乙醇、丙酮等，破壞水膜作用）；（2）調(diào)節(jié)溶液的pH值，使達到蛋白質(zhì)的等電點而失去電荷；（3）加熱法（失去活性）；（4）重金屬鹽（汞、銀、銅鹽等）、磷鎢酸、三氯醋酸和生物堿等沉淀劑可使蛋白質(zhì)沉淀（失去活性）。五、蛋白質(zhì)變性（denaturation）在某些物理化學因素作用下，蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的非共價鍵斷裂，天然構(gòu)象破壞，從而引起理化性質(zhì)改變，生物活性喪失。蛋白質(zhì)變性后一級結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生變化。只是空間構(gòu)象發(fā)生變化。蛋白質(zhì)變性后其溶解度降低，粘度增加，生物活性喪失，易被蛋白酶水解。變性蛋白質(zhì)不一定都沉降，沉降出的蛋白質(zhì)也不一定變性。造成蛋白質(zhì)變性的因素：強酸、強堿、尿素、重金屬鹽、乙醇、加熱、紫外線、X線等。復(fù)性：有的蛋白質(zhì)變性后，將變性劑除掉，能恢復(fù)活性。六、蛋白質(zhì)的紫外吸收

Trp、Tyr在280nm處有特征吸收峰，可作蛋白質(zhì)定量測定七、蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)（1）茚三酮反應(yīng)（ninhydrinreaction）。（2）雙縮脲反應(yīng)（biuretreaction）。肽鍵與雙縮脲試劑反應(yīng)呈紫色。氨基酸無此反應(yīng)，可用于檢測蛋白質(zhì)水解程度。第五節(jié)蛋白質(zhì)的分離與純化一、蛋白質(zhì)的抽提原理與方法原理

大部分蛋白質(zhì)均可溶于水、稀鹽、稀酸或稀堿溶液中，少數(shù)與脂類結(jié)合的蛋白質(zhì)溶于乙醇、丙酮及丁醇等有機溶劑中。蛋白質(zhì)在不同溶劑中溶解度的差異，主要取決于蛋白分子中非極性疏水基團與極性親水基團的比例，其次取決于這些基團的排列和偶極矩。所以，分子結(jié)