生化實(shí)驗(yàn)技術(shù)與方法

糖的薄層層析

實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)和掌握薄層層析的原理和方法實(shí)驗(yàn)原理層析法是利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等），使各組分在兩相（一相為固定的，稱為固定相；另一相流過固定相，稱為流動(dòng)相）中的分布程度不同，從而使各組分以不同的速度移動(dòng)而達(dá)到分離的目的。固定相：固定相是層析的一個(gè)基質(zhì)。它可以是固體物質(zhì)（如吸附劑，凝膠，離子交換劑等），也可以是液體物質(zhì)（如固定在硅膠或纖維素上的溶液），這些基質(zhì)能與待分離的化合物進(jìn)行可逆的吸附，溶解，交換等作用。流動(dòng)相：在層析過程中，推動(dòng)固定相上待分離的物質(zhì)朝著一個(gè)方向移動(dòng)的液體、氣體等，都稱為流動(dòng)相。柱層析中一般稱為洗脫劑，薄層層析時(shí)稱為展層劑。按操作形式不同分類：柱層析：將固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿一個(gè)方向移動(dòng)而達(dá)到分離。紙層析：用濾紙做液體的載體，點(diǎn)樣后，用流動(dòng)相展開，以達(dá)到分離鑒定的目的。薄層層析：將適當(dāng)粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙層析類似的方法進(jìn)行物質(zhì)的分離和鑒定。

層析法的分類按機(jī)理分類：吸附層析分配層析離子交換層析凝膠層析親和層析薄層層析是一種微量而快速的層析方法。該法是把吸附劑或支持劑涂布在玻璃板上成為一薄層，將要分析的樣品滴加到薄層上，然后用合適的溶劑進(jìn)行展開，使樣品各個(gè)成分分離，然后進(jìn)行定性鑒定和定量測(cè)定。

實(shí)驗(yàn)操作硅膠薄板的制備：注意膠要均勻。1.2g硅膠H加4.0ml0.5%CMC溶液，研磨數(shù)分鐘后，倒在預(yù)先準(zhǔn)備好的玻璃板上，鋪開，使?jié){液分部均勻，放在水平臺(tái)上，自然晾干。硅膠G硅膠H硅膠GF254硅膠HF2542.板的處理：薄板的活化：105℃，0.5h

薄板的刮分：徑向?qū)游龅膬?yōu)點(diǎn)是：樣品展層后圖譜呈弧形帶狀，使Rf值相近的化合物也能清楚地分開。3.點(diǎn)樣：樣品為鼠李糖、木糖和葡萄糖。點(diǎn)樣量8-10μl。注意：點(diǎn)樣點(diǎn)的直徑小于5mm，點(diǎn)樣要少量多次，吹風(fēng)機(jī)風(fēng)力不能過大。4.展層：展層溶劑為：乙酸乙酯：甲醇：乙酸：水=12：3：3：2（體積比），新鮮配制。5.顯色：顯色劑：苯胺-二苯胺-磷酸試劑。20mm10mm30mm8mm苯丙氨酸解氨酶的提取純化

實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆辗蛛x純化酶的基本操作和方法。實(shí)驗(yàn)原理苯丙氨酸解氨酶（L-phenylalanine：ammonialyase，簡(jiǎn)稱PAL；EC4.3.1.5）是植物體內(nèi)苯丙烷類代謝的關(guān)鍵酶，與一些重要的次生物質(zhì)如木質(zhì)素、異黃酮類植保素、黃酮類色素等合成密切有關(guān)，在植物正常生長(zhǎng)發(fā)育和抵御病菌侵害過程中起重要作用。本次實(shí)驗(yàn)是以銀杏葉為原料采用分步鹽析、透析脫鹽、離子交換等方法得到苯丙氨酸解氨酶。

離子交換層析法主要是利用溶液中各種帶電離子與離子交換劑之間的結(jié)合力的差異進(jìn)行的分離方法。各種氨基酸分子的等電點(diǎn)不同，在同一pH時(shí)所帶電荷不同，與離子交換樹脂的結(jié)合力有差異，因此可依據(jù)結(jié)合力從小到大的順序被洗脫液洗脫下來，達(dá)到分離的效果。離子交換劑為固定相。帶電離子與離子交換劑之間的作用力主要是靜電力，它們的結(jié)合是可逆的。

離子交換劑由基質(zhì)（惰性不溶性載體）、電荷基團(tuán)（功能基團(tuán)）和反離子（平衡離子）三部分組成。纖維素-O-CH2-COO--Na+

基質(zhì)電荷基團(tuán)反離子離子交換劑的種類

（一）按載體種類不同1.離子交換樹脂：主要有聚苯乙烯樹脂2.離子交換纖維素3.離子交換凝膠（二）按功能基團(tuán)帶電荷性質(zhì)不同陽離子交換劑—功能基團(tuán)帶負(fù)電荷（平衡離子帶正電荷），與陽離子交換。陰離子交換劑

—功能基團(tuán)帶正電荷（平衡離子帶負(fù)電荷）

，與陰離子交換。

聚苯乙烯-苯二乙烯是由苯乙烯（單體）和苯二乙烯（交聯(lián)劑）進(jìn)行聚合和交聯(lián)反應(yīng)生成的具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高聚物。它是離子交換樹脂的基質(zhì)，帶電基團(tuán)是通過后來的反應(yīng)引入基質(zhì)的，樹脂一般都制成球形顆粒。

—CH2—CH2—CH—CH2—CH2—CH—SO3—

—CH—CH2—CH2—CH—苯環(huán)—SO3—有氫型和鈉型H+或Na+H+或Na+從交換劑上洗脫目的物的方法有兩種：1.調(diào)節(jié)洗脫液的pH，使目的物在此pH下失去電荷甚至帶相反電荷。2.用高濃度的同性離子，將目的離子取代下來。儀器高速冷凍離心機(jī)；恒溫水??；電子天平；柱層析系統(tǒng)等試劑0.1mol/L硼酸-硼砂緩沖液（含1mmol/LEDTA、20mmol/Lβ-巰基乙醇）固體硫酸銨0.01mol/LTris-HCl（pH8.8）緩沖液）；DEAE纖維素52操作步驟酶的提?。?）植物材料2g，剪成小段，加入5倍體積的酶提取液，于冰浴上用研缽研磨。（2）將已勻漿的酶液轉(zhuǎn)入離心管，4000r冷凍離心30min。（3）取離心后的上清液（酶粗提液），量出其體積，留樣0.5ml。硫酸銨分級(jí)沉淀酶蛋白（1）根據(jù)實(shí)際體積、溫度和硫酸銨飽和度用量表，算出達(dá)到38%飽和度應(yīng)加入酶粗提液中的硫酸銨量，并稱硫酸銨。（240g/L)（2）將酶液倒入燒杯內(nèi)，邊緩慢攪拌邊緩慢加入稱好的固體硫酸銨，待全部加完后，再緩慢攪拌10min；然后于9000r離心15min，保留上清液于燒杯內(nèi)。（3）根據(jù)硫酸銨飽和度用量表，算出從38%到75%飽和度所需硫酸銨用量。（222g/L)（4）按上述（2）步同法處理，離心后，棄去上清液，保留沉淀。（5）將沉淀溶于2ml酶抽提液中,留樣0.5ml。透析脫鹽酶液裝入透析袋，放入低鹽溶液中透析過夜,留樣0.5ml。銀杏葉2g+10ml酶提取液研磨4000rpm、30min取上清液加硫酸銨至飽和度38%

9000rpm、15min取上清液加硫酸銨至飽和度75%

9000rpm、15min取沉淀溶于2ml酶抽提液透析純化離子交換層析DEAE纖維素（1）稱取DEAE纖維素52干粉1~1.5g，加20ml的0.01mol/LTris-HCl（pH8.8）浸泡4h以上（或浸泡過夜）。（2）裝柱：把預(yù)處理的DEAE纖維素52裝柱。裝柱完成后，用2~3個(gè)床體積的0.01mol/LTris-HCl（pH8.8）洗脫平衡該柱。（3）上樣：把所得的酶洗脫液小心地注入柱床面中央，上樣結(jié)束后，在床面以上小心地加入0.01mol/LTris-HCl（pH8.8）2~3cm厚液層。注意上樣開始就收集流出液。（4）洗柱：用A液（0.01mol/LTris-HCl（pH8.8））及B液（含1mol/LNaCl的0.01mol/LTris-HCl（pH8.8））洗柱，流速為1mL/min，3ml/管,紫外檢測(cè)儀檢測(cè)，取A280值高的管中洗脫液測(cè)其PAL的活力；合并主要含有PAL活力的各管洗脫液，并量出其體積（ml）。苯丙氨酸解氨酶的活力測(cè)定

實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)苯丙氨酸解氨酶活力測(cè)定方法。PAL催化L-苯丙氨酸裂解為反式肉桂酸，反式肉桂酸在290nm處有最大吸收值。若酶的加入量適當(dāng)，A290升高的速率可在幾小時(shí)內(nèi)保持不變，因此通過測(cè)定A290升高的速率以測(cè)定PAL活力。規(guī)定1h內(nèi)A290增加0.01為PAL的一個(gè)活力單位。實(shí)驗(yàn)原理取試管2支，按表中所述（0號(hào)為調(diào)零管，1號(hào)為測(cè)定管。注意按表格從上到下的順序加入試劑）。（單位：ml）

將各管混勻，放入40℃恒溫水浴保溫1h（準(zhǔn)確計(jì)時(shí)），到時(shí)在待測(cè)管（1號(hào)）加0.2ml2mol/LHCl終止反應(yīng)。紫外分光光度于波長(zhǎng)290nm處測(cè)定1號(hào)管的A290。操作步驟蛋白質(zhì)測(cè)定（考馬斯亮藍(lán)染色法）取酶液0.1ml，用蒸餾水稀釋至5ml取試管8支，按下表加入各溶液：將上述各試管混勻，靜置2min，測(cè)定各管的A595。

PAL總活力、比活力、蛋白質(zhì)含量的計(jì)算SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳

（SDS－PAGE）測(cè)定蛋白質(zhì)分子量

實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆誗DS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的原理和方法SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳

（SDS－PAGE）測(cè)定蛋白質(zhì)分子量

原理：SDS－PAGE是最常用的定性分析蛋白質(zhì)的電泳方法，特別是用于蛋白質(zhì)純度檢測(cè)和測(cè)定蛋白質(zhì)分子量。電泳遷移率與顆粒的電荷、形狀、大?。ǚ肿恿浚┯嘘P(guān)，如電荷、形狀都一樣，則電泳遷移率只與分子量有關(guān)。SDS是在PAG系統(tǒng)中引進(jìn)SDS（十二烷基磺酸鈉）。

SDS的作用：1.能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，強(qiáng)還原劑（巰基乙醇）能使二硫鍵斷裂，使蛋白質(zhì)完全變性。2.能與變性的蛋白質(zhì)按比例結(jié)合，形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物。SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物的特點(diǎn)：1.由于結(jié)合大量的SDS，使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)，從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異。2.復(fù)合物都是橢圓棒狀，從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的形狀差異。因此在進(jìn)行電泳時(shí)，蛋白質(zhì)分子的遷移速度取決于分子大小。測(cè)定各條帶的相對(duì)遷移率，根據(jù)已知蛋白質(zhì)分子量和它們的相對(duì)遷移率，以相對(duì)遷移率為橫坐標(biāo)，lgMr為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)未知蛋白質(zhì)的相對(duì)遷移率從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出它們的lgMr，再換算成蛋白質(zhì)分子量．

在一定范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)。若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)分子量對(duì)數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。操作如同PAGE。樣品：蛋白質(zhì)要完全變性。蛋白質(zhì)+SDS+巰基乙醇100℃2-5分鐘標(biāo)準(zhǔn)蛋白市場(chǎng)有售，被測(cè)蛋白質(zhì)的分子量應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量以內(nèi)。染色：考馬氏亮藍(lán)、銀染色該法測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的局限性：1.蛋白質(zhì)是由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（如胰凝乳蛋白酶）組成的，測(cè)定時(shí)只是它們的亞基或單條肽鏈的MW。2.電荷異常的蛋白質(zhì)（如組蛋白，帶大量正電荷）3.結(jié)構(gòu)異常，不于分子量呈線性關(guān)系（如膠原蛋白）4.帶有較大輔基的蛋白質(zhì)（如糖蛋白）實(shí)驗(yàn)操作

膠的制備樣品的處理：按4:1的比例向標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)或待測(cè)樣品中加入樣品溶解液（小試管），充分溶解后，置沸水浴3min，取出冷至室