基因工程原理第4章質(zhì)粒和噬菌體載體的基礎(chǔ)生物學(xué)

1思考題什么是基因工程？你對轉(zhuǎn)基因有何看法？發(fā)揮想象力，開發(fā)一種基因工程產(chǎn)品。主題報告重組DNA技術(shù)的應(yīng)用全班同學(xué)分為六個小組：六個主題，可以突破，自己選題，保證與基因工程相關(guān)班長負責(zé)分組，安排報告時間，從第14周開始。23第四章質(zhì)粒和噬菌體載體的基礎(chǔ)生物學(xué)第一節(jié)質(zhì)粒生物學(xué)質(zhì)粒是在染色體外穩(wěn)定遺傳的復(fù)制體大多數(shù)質(zhì)粒是以雙鏈環(huán)狀DNA分子的形式存在共價閉環(huán)DNA,cccDNA開環(huán)DNA,ocDNA45線性超螺旋開環(huán)質(zhì)粒電泳圖譜6質(zhì)粒酶切圖譜7溴化乙錠影響質(zhì)粒的超螺旋8并不是所有質(zhì)粒都是環(huán)狀分子在多種細菌中都發(fā)現(xiàn)有線性質(zhì)粒線性質(zhì)粒的末端保護機制：在末端DNA發(fā)卡環(huán)中以重復(fù)序列結(jié)尾通過共價結(jié)合蛋白來保護末端9質(zhì)粒所攜帶基因的表型特征10質(zhì)粒的分類接合型和非接合型依據(jù)是否攜帶有一套促進細菌接合的轉(zhuǎn)移基因（tra基因）松弛型和嚴謹型取決于單個細胞中的拷貝數(shù)1112質(zhì)粒的宿主范圍由它的ori區(qū)域決定嚴格的宿主范圍：如ColE1提供的ori的質(zhì)粒只能在腸細菌中復(fù)制廣宿主范圍：復(fù)制所需的蛋白質(zhì)大部分甚至全部都是自己編碼的13質(zhì)粒的拷貝數(shù)通過調(diào)控質(zhì)粒復(fù)制的起始來決定。兩種調(diào)控機制：通過反義RNA調(diào)控（RNAII和RNAI）通過關(guān)鍵蛋白與重復(fù)區(qū)結(jié)合來進行調(diào)控

Rop促進RNAI和RNAII的配對

RepA蛋白14ColE1衍生質(zhì)粒的復(fù)制調(diào)控15pSC101的ori區(qū)域RepA蛋白由質(zhì)粒編碼，可以與ori區(qū)域的重復(fù)區(qū)結(jié)合，抑制DNA的合成。RepA蛋白通過與自身啟動子結(jié)合，阻斷自身基因轉(zhuǎn)錄，抑制自身合成。RepA蛋白通過結(jié)合兩個質(zhì)粒的重復(fù)區(qū)序列把它們連接起來，這樣避免它們起始復(fù)制。（手銬機制）1617質(zhì)粒的分配和分離穩(wěn)定性人們把由于錯誤的分配而造成的質(zhì)粒丟失稱為分離不穩(wěn)定性。Par分配機制涉及DNA的超旋性質(zhì)粒形成多聚體18質(zhì)粒的不相容性在沒有選擇壓力的情況下，兩種質(zhì)粒不能共存于同一個宿主細胞內(nèi)。如果質(zhì)粒擁有相同的復(fù)制調(diào)控機制，它們就不相容。19第二節(jié)質(zhì)粒DNA的純化Vinograd的經(jīng)典方法：CsCl，EtBr密度梯度離心Binrnboim和Doly：堿裂解法20CsCl，EtBr密度梯度離心21堿裂解法NaOH和SDS裂解乙酸鈉中和離心，取上清沉淀TER消化RNA沉淀，75%乙醇洗干燥、溶解22質(zhì)粒產(chǎn)量的影響因素細胞收獲時的拷貝數(shù)制備清亮裂解液宿主細胞中野生型endA基因23質(zhì)粒克隆載體的理想特性相對分子量小(易于操作、拷貝數(shù)高、利于出現(xiàn)單一酶切位點)可以在宿主細胞內(nèi)產(chǎn)生便于選擇的表型特性(便于篩選)存在多種限制性酶的單一位點區(qū)域，且最好位于易測表型基因上(便于克隆、篩選）pBR322載體25pBR322的限制圖譜262728pBR322衍生出更好的載體29pUC8質(zhì)粒衍生自pBR322含有復(fù)制起始位點(ori)和另兩個基因：氨芐青霉素抗性基因和lacZ’基因30Lac篩選(藍白斑篩選)pUC質(zhì)粒含LacZ基因，該酶能分解生色底物X-gal產(chǎn)生藍色，從而使菌株變藍。當(dāng)外源DNA插入LacZ基因后失活，菌株呈白色，稱之為藍白斑篩選。31pUC8等大腸桿菌質(zhì)粒的缺點不能操作大于10kb的DNA片段大片段的插入會引起重組或干擾質(zhì)粒的復(fù)制體系，且重組DNA分子在宿主細胞中丟失32第三節(jié)λ噬菌體線性的雙螺旋分子，大約長48.5kb每個末端都有短的12個核苷酸的單鏈5’突出，它們在序列上互補，進入宿主細胞后形成環(huán)形結(jié)構(gòu)33λ噬菌體的基因組34λ噬菌體非必須DNAλ噬菌體基因組大小為48.5kb，其中有15kb只在噬菌體DNA整合到大腸桿菌染色體過程(即溶源性感染周期)中必須，該片段的刪除不影響噬菌體感染細菌的能力，也不影響裂解周期中新的λ噬菌體顆粒合成，稱為隨意DNA。35λ噬菌體的生活周期36λ噬菌體裂解性感染周期與溶源性感染周期為了能夠復(fù)制，噬菌體必須進入細菌細胞并促使細菌的酶表達噬菌體基因所包含的信息，以便于細菌能合成新的噬菌體。一旦復(fù)制完成，新的噬菌體便離開細菌，并通常引起細菌死亡，并繼續(xù)感染新的細胞，這稱為裂解性感染周期。λ噬菌體基因組整合到細菌染色體上，保持多代的休眠狀態(tài)，并隨細胞分裂而與宿主染色體一起復(fù)制，稱為溶源性感染周期。3738λ噬菌體的主要啟動子和轉(zhuǎn)錄終止位點λ噬菌體載體插入型載體(insertionvector)，部分或全部隨意DNA被刪除，并在刪除后的基因組內(nèi)部某位點引入單一的限制性酶切位點。取代型載體(replacementvector)，隨意DNA兩側(cè)引入限制性酶切位點，用需克隆的DNA在連入時替代隨意DNA。39噬菌體λ克隆載體EMBL3

和EMBL4的結(jié)構(gòu)40λ噬菌體的體外包裝4142混合裂解液中串聯(lián)噬菌體λDNA的體外包裝43用單鏈DNA載體進行DNA克隆M13、f1和fd是包含一個環(huán)形的單鏈DNA分子的絲狀大腸桿菌噬菌體。