FCM的原理及應(yīng)用

流式細(xì)胞術(shù)

---原理及應(yīng)用什么是流式細(xì)胞術(shù)？流式細(xì)胞儀由哪些結(jié)構(gòu)組成？各個系統(tǒng)的工作原理是什么？流式細(xì)胞儀能做些什么？1.1流式細(xì)胞術(shù)簡介流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry，F(xiàn)CM）：是以流式細(xì)胞儀為檢測手段的一項能快速、精確的對單個細(xì)胞(或生物學(xué)顆粒)的理化特性進行多參數(shù)定量分析和分選的技術(shù)。在流動的狀態(tài)中檢測細(xì)胞或顆粒的各項特性。檢測參數(shù)：多參數(shù)；檢測速度：高速，最高達(dá)上萬個細(xì)胞/秒；檢測結(jié)果：精度高、準(zhǔn)確性好；檢測對象：單細(xì)胞懸液或生物顆粒檢測特點：單細(xì)胞水平分析可對目標(biāo)細(xì)胞進行分選

流式：單個細(xì)胞分析，收集每個細(xì)胞的數(shù)據(jù)，更精準(zhǔn)；WB：群體分析，得到多個細(xì)胞的平均值。1.2流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)組成液流系統(tǒng)流動室液流驅(qū)動系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)激發(fā)光源光束收集系統(tǒng)電子系統(tǒng)光電轉(zhuǎn)換器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)細(xì)胞分選系統(tǒng)噴嘴電偏轉(zhuǎn)板樣本收集器液流驅(qū)動系統(tǒng)液流系統(tǒng)鞘流技術(shù)：根據(jù)層流原理發(fā)展起來的技術(shù)，可以實現(xiàn)兩種液體的同軸流動，樣本細(xì)胞流位于軸心穩(wěn)定流動，外面包裹有鞘液(sheath)。流體動力學(xué)聚焦：穩(wěn)定的液流從截面積較大的部分流入截面積較小的部分后，有一個聚焦收縮作用，細(xì)胞流直徑被約束在10-20um，避免了多個細(xì)胞重疊進入檢測區(qū)。鞘液的作用：1.約束樣品位于噴嘴中心，提高測量精度；2.防止樣品靠近噴孔壁，避免堵塞噴空；3.鞘液與細(xì)胞流同軸流動防止細(xì)胞流發(fā)生湍流。鞘液鞘液細(xì)胞流激光照射點流體動力學(xué)聚焦示意圖進樣速率控制通過改變樣本壓力可以調(diào)節(jié)樣本的進樣速率，而這并不是提高樣本流的流速，而是改變了細(xì)胞之間的距離。高速時樣本流變寬，單位時間內(nèi)流經(jīng)激光照射區(qū)的細(xì)胞數(shù)就增加，這樣會導(dǎo)致變異系數(shù)增加。光收集系統(tǒng)濾光片的組成長通濾片(LP)：只允許特定波長以上的光束通過；短通濾片(SP)：只允許特定波長以下的光束通過；帶通濾片(BP)：只允許一定波長范圍內(nèi)的光束通過。Long

passShortpassBandpass460500540SP500LP500BP500/50460500540460500540流式細(xì)胞儀信號檢測系統(tǒng)透射光路FACSCantoII雙激光六色電子系統(tǒng)光電檢測器將光信號轉(zhuǎn)換成電子信號。前置放大電路將信號等比例放大，輸出電脈沖信號。模數(shù)轉(zhuǎn)換器將模擬的電脈沖信號轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號。數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)計算機系統(tǒng)數(shù)據(jù)采集、分析。（一）光電檢測器(photodetector)光電二極管(photodiode)光靈敏度低，測定強信號（FSC）；光電倍增管(photomultiplier,PMT)光靈敏度高，測定弱信號（SSC,FL1,FL2,FL3,FL4)。PMT前向散射光光電二極管（二）電信號兩種放大方式由于光信號比較弱，需將其等比例放大，方便計算機分析處理，一般信號的放大可以使用線性或?qū)?shù)兩種方式。

線性(linear;lin)對數(shù)(logarithmic;log)一般FSC和SSC變異范圍較小，故使用線性放大；熒光信號變異范圍較大，多使用對數(shù)放大。1.3流式細(xì)胞術(shù)光信號檢測光信號的類型散射光信號：與標(biāo)記熒光素?zé)o關(guān)，是細(xì)胞的固有參數(shù)。前向散射光(forwardscatter,FSC);側(cè)向散射光(sidescatter,SSC).熒光信號自發(fā)熒光：微弱特異熒光：標(biāo)記的熒光素分子發(fā)出

的熒光，比自發(fā)熒光強很多倍。散射光信號（一）前向散射光FSC

FSC信號方向與激光束平行，偏離度一般在1-6度范圍內(nèi)，亦稱小角度散射光，主要反映被測細(xì)胞的體積大小和活力。（二）側(cè)向散射光SSCSSC方向與激光束和液流形成的平面相垂直，亦稱90度散射光，其信號強度反映細(xì)胞內(nèi)部顆粒度和精細(xì)結(jié)構(gòu)的變化。（三）散射光的作用實驗中，常利用FSC和SSC這兩種參數(shù)的組合，區(qū)分不同的細(xì)胞群體，去除碎片、死細(xì)胞和粘連細(xì)胞的干擾。粒細(xì)胞單核細(xì)胞淋巴細(xì)胞紅細(xì)胞、死細(xì)胞和碎片閾值Threshold閾值：溶液中的雜質(zhì)或者死細(xì)胞，很容易產(chǎn)生微小的干擾信號，所以必須設(shè)置閾值，排除雜質(zhì)、細(xì)胞碎片或體積較小的死細(xì)胞。FSC反映細(xì)胞體積的大小，F(xiàn)CM應(yīng)用時常選取FSC設(shè)定閾值。5%32%默認(rèn)閾值升高閾值后

熒光信號（一）熒光：

物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時釋放出的光。發(fā)射波長(熒光波長)Emissionwavelength激發(fā)波長Excitationwavelength＜（二）常用熒光素<499nm藍(lán)色熒光（Blue）；

500-549nm，綠色熒光（Green）；550-584nm，黃色熒光（Yellow）；

585-615nm，橙色熒光（Orange）；616-700nm，紅色熒光（Red）；

≥700nm，遠(yuǎn)紅外熒光（Far-Red）。標(biāo)記抗體的熒光素?zé)晒馑胤肿蛹ぐl(fā)光波長（nm）發(fā)射光波長（nm）中文名FITC490520異硫氰酸熒光素PE488575藻紅蛋白PerCP490675多甲藻葉綠素蛋白APC650660別藻青蛋白PE-Cy5496/546670藻紅蛋白-花青素5PE-Cy7496/546767藻紅蛋白-花青素7Alexa

Flour488495519AlexaFlour647650665核酸熒光染料PI（碘化丙啶535,623）可選擇性的插入核酸雙螺旋堿基對中。常用于DNA分析，需要用RNase處理細(xì)胞排除RNA對DNA熒光定量的影響；PI不能透過活細(xì)胞膜，常用于鑒定死細(xì)胞。7-AAD（7-氨基放線菌素D545,647）以插入的方式與DNA鏈的G-C堿基對結(jié)合，不能透過活細(xì)胞膜，常用于鑒定死細(xì)胞。DAPI（4,4,6-二脒基二苯基吲哚358,456）可以非嵌入方式與DNA鏈上的A-T堿基對特異性結(jié)合。變異系數(shù)明顯小于其他染料，一種理想的DNA定量染料。Hoechst（343,450）常見為Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的方式與DNA鏈上的A-T堿基對結(jié)合。能對活細(xì)胞染色，用于活細(xì)胞DNA定量分析，如精子分選；還用于側(cè)群細(xì)胞的分選。PY（派若寧560,573）RNA染料，能進入活細(xì)胞。AO（吖啶橙509,525）DNA、RNA染料，染色后DNA呈黃綠色熒光，RNA呈橙黃色熒光，可進行DNA/RNA雙參數(shù)分析。細(xì)胞周期(CellCycle)

原理：細(xì)胞在有絲分裂的過程中，核內(nèi)的DNA會進行復(fù)制，造成DNA含量的變化。如果把處于G0/G1期的細(xì)胞的DNA含量看做2N的話，處于G2/M期的細(xì)胞的DNA含量則為4N。熒光染料碘化丙錠（PropidiumIodide，PI）是一種核酸特異性染料，染料的熒光強度與結(jié)合的DNA數(shù)量成正比。根據(jù)PI的這種特性，我們常常用它來揭示細(xì)胞內(nèi)DNA倍性的關(guān)系，從而推導(dǎo)出細(xì)胞群體的周期分布。細(xì)胞凋亡(Apoptosis)

原理：細(xì)胞程序性死亡/細(xì)胞凋亡（apoptosis）是機體移除不需要的細(xì)胞的一種常見的機制。細(xì)胞凋亡早期的標(biāo)志事件之一是磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）從胞膜內(nèi)表面到外表面的轉(zhuǎn)移。AnnexinV（AV）和PS有很強的親和力，所以被熒光標(biāo)記后常常在流式中被用來檢測外翻的PS。在細(xì)胞凋亡后期，細(xì)胞膜與核膜常常會破裂。這種現(xiàn)象在流式中可以用PropidiumIodide（PI）檢測。PI是一種核酸特異性染料。當(dāng)細(xì)胞膜完整時，PI無法穿透胞膜，故無法對細(xì)胞核進行染色。AV與PI共同使用時，可以對細(xì)胞凋亡的各個時期進行檢測：正常活細(xì)胞顯示AV和PI的雙陰性；早凋細(xì)胞顯示AV陽性和PI陰性；晚凋細(xì)胞則顯示AV和PI的雙陽性。然而，可以被AV和PI共同染色的細(xì)胞并不一定處于凋亡晚期。壞死的細(xì)胞在晚期也會被AV和PI共同染色。所以要想做到對細(xì)胞凋亡精確的檢測則需要對整個凋亡過程進行監(jiān)測，即AV陰性&PI陰性→AV陽性&PI陰性→AV陽性&PI陽性。

FCM可檢測下列細(xì)胞成分：表面標(biāo)記物胞漿標(biāo)記物核內(nèi)標(biāo)記物可溶性成分免疫熒光染色黏附因子表面受體細(xì)胞因子分泌到胞外的細(xì)胞因子胞內(nèi)抗原核酸含量核內(nèi)抗原免疫熒光染色主要包括直接和間接免疫熒光染色兩種方法。間接標(biāo)記的方法難以進行多色標(biāo)記，而且操作復(fù)雜、信噪比高，所以一般首先直標(biāo)熒光抗體。熒光抗體熒光二抗第一抗體直接標(biāo)記間接標(biāo)記熒光抗體的選擇本實驗室的FACSCantoII配置兩根激光器激發(fā)六色熒光。第一激光器：488nm藍(lán)色固態(tài)激光器激發(fā)四色。第二激光器：633nm紅色氦氖激光器激發(fā)二色。熒光濾片：488nm激光：530/30nm、585/42nm、695/40nm、780/60nm633nm激光：660/20nm、780/60nm總共可以檢測6色熒光可選擇的熒光如下：B根據(jù)抗原表達(dá)強弱合理選擇抗體不同的熒光素強度有所不同；高表達(dá)的抗原可用不太“亮”的染料，更“亮”的熒光素分配給表達(dá)低的抗原：CD4-FITC、CD25-APC、Foxp3-PEC選擇熒光波譜間光譜