PCR基本原理與應(yīng)用-黃廷華

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)長江大學(xué)動科學(xué)院PCR的用途體外擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)，能快速、特異地?cái)U(kuò)增目的DNA片段。能通過試管內(nèi)的數(shù)小時(shí)反應(yīng)將特定的DNA片段擴(kuò)增數(shù)百萬倍。迅速獲取大量的單一核酸片段，為分子生物學(xué)研究提供了強(qiáng)大的工具。1953年，Watson和Crick提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)及半保留復(fù)制模型。1958年，Meselson和Stahl用實(shí)驗(yàn)證實(shí)DNA半保留復(fù)制模型。70年代以來，人們采用兩種思路去嘗試建立基因的無性繁殖體系，一是基因克隆技術(shù)，二是體外擴(kuò)增技術(shù)。發(fā)展歷程1971年，Khorana（美國MIT教授，1968年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)得主）：“經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因。”核酸體外擴(kuò)增最早設(shè)想被遺忘原因:（1）很難進(jìn)行測序和合成寡核苷酸引物；（2）1970年Smith等發(fā)現(xiàn)了II型限制性內(nèi)切酶，體外克隆基因已成為可能。1976年，臺籍科學(xué)家錢嘉韻（AliceChien）從黃石國家公園的嗜熱菌Thermusaquaticus中分離出熱穩(wěn)定的TaqDNA聚合酶。1985年，美國Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis發(fā)明聚合酶鏈反應(yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR），Saiki等首次應(yīng)用PCR法成功地?cái)U(kuò)增了人-珠蛋白的DNA，并應(yīng)用于鐮刀狀紅細(xì)胞貧血的產(chǎn)前診斷。1988年Saiki開始將耐熱性TaqDNA聚合酶應(yīng)用于PCR，整個(gè)反應(yīng)只加一次酶即可，擴(kuò)增特異性和效率都明顯改善，操作大為簡化。1989年被譽(yù)為“分子年”，列PCR為十余項(xiàng)發(fā)明之首。1993年，Mullis榮獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。PCR的基本原理試管中進(jìn)行的DNA復(fù)制反應(yīng)，依據(jù)DNA半保留復(fù)制的機(jī)理；體外DNA分子于不同溫度下可變性和復(fù)性的性質(zhì)；通過人為控制體外合成系統(tǒng)的溫度，使雙鏈DNA變成單鏈，單鏈DNA與人工合成的引物退火，DNA聚合酶使引物沿著單鏈模板延伸為雙鏈DNA。引物引物Mullis的構(gòu)思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段94℃變性50-65℃退火XX℃延伸72℃94℃55℃PCR循環(huán)PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA95℃PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)95℃50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72℃第1輪結(jié)束95℃第2輪開始PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72℃第2輪結(jié)束PCR每一步的轉(zhuǎn)換通過溫度的改變控制。DNA模板解鏈（變性）、引物與模板結(jié)合（退火）、DNA聚合酶催化新生DNA的合成（延伸）三個(gè)步驟構(gòu)成PCR反應(yīng)的一個(gè)循環(huán)。此循環(huán)反復(fù)進(jìn)行，可使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。理論擴(kuò)增率：2n遞增（n為循環(huán)次數(shù)），25～30循環(huán)，目標(biāo)DNA可增加109倍。實(shí)際擴(kuò)增率：(１＋Ｘ)n，X為PCR的實(shí)際擴(kuò)增率，平均約為75%。由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因素，擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，逐漸由指數(shù)形式變?yōu)榫€性形式，所以實(shí)際上進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后，擴(kuò)增倍數(shù)一般可達(dá)106～107。以上“變性、退火、延伸”三部曲為PCR一輪循環(huán)。PCR反應(yīng)體系與流程反應(yīng)體系模板（DNA或RNA）引物TaqDNA聚合酶10×PCR緩沖液1.5～4

mM

Mg2+0.2

mM

dNTP反應(yīng)流程預(yù)變性變性退火延伸延伸完全終止25～35循環(huán)一、PCR的反應(yīng)體系引物（primer）酶（TaqDNApolymerase）dNTP模板（template）Mg2+（magnesium）1、引物引物：決定PCR反應(yīng)的特異性PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增基本原則是最大限度地提高擴(kuò)增效率和特異性，同時(shí)盡可能抑制非特異性擴(kuò)增。引物設(shè)計(jì)的原則①引物長度：15-30bp，常用20bp左右—引物的有效長度不能大于38bp，否則最適延伸溫度會超過TaqDNA聚合酶的最適溫度（74℃），不能保證PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性②引物擴(kuò)增跨度：以500bp為宜—特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜

—G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶

—ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列，尤其3′端不應(yīng)超過3個(gè)連續(xù)的G或C，因?yàn)檫@樣會使引物在G+C富集區(qū)引發(fā)錯(cuò)誤延伸④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)和引物間互補(bǔ)

—特別避免3’端的互補(bǔ)，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異性的擴(kuò)增條帶⑤引物3’端的堿基要求嚴(yán)格配對（不能做任何修飾）—特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失?、抟?′端可修飾

—引物5′端限定著PCR產(chǎn)物的長度，但對擴(kuò)增特異性影響不大；引物5′端堿基可不與模板DNA

互補(bǔ)而呈游離狀態(tài)；引物5′端最多可加10個(gè)堿基而對PCR反應(yīng)無影響

3’5’3’5’限制性內(nèi)切酶的識別序列啟動子序列定點(diǎn)突變探針標(biāo)記⑦引物的特異性：—引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性⑧引物量：—每條引物的濃度0.1~0.5μM，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好—引物濃度偏高會引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會2、酶及其濃度目前有兩種TaqDNA聚合酶供應(yīng)天然酶：從水生嗜熱桿菌中提純基因工程酶：大腸菌合成一個(gè)典型的PCR反應(yīng)約需酶量1-2.5U/100ul體系濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少DNA聚合酶

Klenow片段

T4DNA聚合酶

TaqDNA聚合酶（應(yīng)用最廣）其他DNA聚合酶：TthDNA聚合酶

VentDNA聚合酶

PfuDNA聚合酶等Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)溫度(℃)40506070809010010080604020Taq酶的保真性不高5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性，無3’→5’外切活性;在PCR反應(yīng)中如發(fā)生某些堿基的錯(cuò)配，該酶是沒有校正功能的。保真性不如PfuDNA聚合酶等。3、dNTP的質(zhì)量與濃度在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50～200μM，濃度過低會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量注意4種dNTP的濃度要相等（等摩爾配制）,如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)（偏高或偏低），就會引起錯(cuò)配高濃度的dNTP可與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性

4、模板DNA模板DNA的來源：

—微生物中提取DNA—從細(xì)胞中提取DNA：血細(xì)胞、絨毛、尿樣、毛發(fā)、精斑、口腔上皮細(xì)胞

—固定和包埋的組織標(biāo)本：脫蠟、蛋白酶K消化模板DNA的濃度：0.1～2ug/100ul體系

—PCR產(chǎn)量隨模板DNA濃度的增加而顯著升高

—模板DNA濃度過高導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物增加

5、Mg2+濃度Mg2+對PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時(shí)，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過低會降低TaqDNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少二、PCR的反應(yīng)流程溫度與時(shí)間的設(shè)置循環(huán)次數(shù)常見問題1、溫度與時(shí)間的設(shè)置設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40～60℃退火，然后快速升溫至70～75℃延伸，對于較短靶基因（長度100～300bp）可采用二溫度點(diǎn)法，將退火與延伸溫度合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸。1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍①變性溫度與時(shí)間：一般93℃～94℃，1min足以使模板變性若低于93℃則需延長時(shí)間但溫度不能過高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對酶的活性有影響。②退火(復(fù)性)溫度與時(shí)間：退火溫度是影響PCR特異性的重要因素退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基因序列的長度對于20個(gè)核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃作為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想引物的復(fù)性溫度

通過以下公式幫助選擇合適的溫度：Tm（解鏈溫度）＝4(G+C)+2(A+T)復(fù)性溫度=Tm值－（5～10℃）在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性復(fù)性時(shí)間一般為30～60s，足以使引物與模板之間完全結(jié)合③延伸溫度與時(shí)間：TaqDNA聚合酶的生物學(xué)活性：

70～80℃150核苷酸/S/酶分子

70℃60核苷酸/S/酶分子

55℃24核苷酸/S/酶分子

高于90℃時(shí)，DNA合成幾乎不能進(jìn)行③延伸溫度與時(shí)間：延伸溫度：一般選擇在70～75℃之間常用溫度為72℃過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。延伸反應(yīng)時(shí)間：根據(jù)待擴(kuò)增片段長度而定1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時(shí)間1min（足夠）3～4kb的靶序列需3～4min擴(kuò)增10kb需延伸至15min延伸時(shí)間過長會導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增對低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時(shí)間要稍長些2、循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)決定PCR擴(kuò)增程度循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度循環(huán)次數(shù)：選在30～40次之間循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多如何提高PCR中的DNA聚合酶的保真性？在PCR反應(yīng)體系中，除使用TaqDNA聚合酶，摻入少量的具有3′→5′外切酶活性的耐熱DNA聚合酶，如Pfu，Vent，Pwo等，錯(cuò)配率可降為原來的1/10；Mg2+濃度盡可能低，但不影響DNA合成；減少高溫反應(yīng)時(shí)間，這樣DNA熱損傷將減少；減少循環(huán)數(shù)。如何提高PCR擴(kuò)增的特異性？升高退火溫度可增加引物與模板結(jié)合的特異性；縮短退火和延伸時(shí)間，可減少錯(cuò)誤引發(fā)及多余的DNA聚合酶分子參與酶促延伸的機(jī)會；降低引物和酶的濃度也可以減少錯(cuò)誤引發(fā)，尤其是能減少引物二聚體的引發(fā)；改變Mg2+的濃度可進(jìn)一步提高擴(kuò)增的特異性。引物設(shè)計(jì)的特異性；減少循環(huán)次數(shù)；熱啟動（HotStart）。即首先將模板變性，然后在較高溫度時(shí)加入TaqDNA聚合酶、引物及MgCl2等一些重要成分，這樣使得引物在較高溫度下與模板退火，提高了反應(yīng)的嚴(yán)謹(jǐn)性，使擴(kuò)增更特異；采用二對引物即外引物和內(nèi)引物進(jìn)行擴(kuò)增來提高擴(kuò)增的特異性。

RT-PCR及定量RT-PCR（1）RT-PCR（reversetranscription-PCR）原理：先在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下、以mRNA為模板合成互補(bǔ)的cDNA（complementaryDNA），再以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。是一種快速、簡便、敏感性極高的檢測mRNA表達(dá)的方法。PCR技術(shù)的主要類型常用的兩種逆轉(zhuǎn)錄酶AMV（avianmyeloblastosisvirus）：酶活性最適溫度42℃MMLV（Moloneymurineleukemiavirus）：酶活性最適溫度37℃（2）定量RT-PCR（qRT-PCR）：利用RT-PCR對mRNA水平進(jìn)行半定量或絕對定量分析。半定量RT-PCR選用在組織中普遍表達(dá)、表達(dá)量比較恒定的看家基因作為內(nèi)源性基因標(biāo)準(zhǔn)看家基因和目的基因共同進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄計(jì)算出擴(kuò)增后目的基因/看家基因的比值，從而達(dá)到半定量的目的半定量PCR的注意事項(xiàng)步驟：1.抽提RNA，2.反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，3.以cDNA為模板做PCRRNA抽提質(zhì)量一定要好，注意污染內(nèi)參的選擇，常用的有βactin和GAPDH倆中半定量RT-PCR應(yīng)該在兩管中進(jìn)行，既內(nèi)參和目的基因各一管，這樣便于控制指數(shù)期和平臺期一定要摸清楚！實(shí)時(shí)熒光定量PCR常規(guī)半定量PCR技術(shù)：

—對PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行定量（需要跑電泳）

—重復(fù)性差

—半定量實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)：通過熒光染料對PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物進(jìn)行定量

實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析（1）熒光標(biāo)記方法

可分為兩種：

—熒光探針（Taqman）

—熒光染料（SYBRGreen）（2）Ct值是熒光定量PCR的一個(gè)重要的概念，C代表Cycle，t代表threshold含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)熒光域值（threshold）的設(shè)定PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號作為熒光