土壤微生物研究方法

專題四土壤-微生物系統(tǒng)研究方法

第一節(jié)土壤微生物研究概述一、土壤微生物學(xué)的研究對(duì)象土壤微生物多樣性：土壤微生物過程土壤微生物與環(huán)境的關(guān)系

（一）土壤微生物的物種多樣性土壤微生物的功能多樣性土壤微生物的結(jié)構(gòu)多樣性土壤微生物的遺傳多樣性1、土壤微生物功能多樣性：

指土壤生態(tài)系統(tǒng)中微生物的物種豐富度和均一度，主要從分類學(xué)、系統(tǒng)學(xué)和生物地理學(xué)角度對(duì)一定地域內(nèi)物種的現(xiàn)狀進(jìn)行研究。目前主要通過培養(yǎng)基最大限度地培養(yǎng)各種菌落，由此了解土壤中可培養(yǎng)的微生物種群。

2、土壤微生物的功能多樣性

指土壤微生物群落所能執(zhí)行的功能范圍以及這些功能的執(zhí)行過程，對(duì)自然界元素循環(huán)具有重要意義如：分解功能、營養(yǎng)傳遞功能以及促進(jìn)或抑制植物生長的功能等。目前一般采用底物誘導(dǎo)下的代謝響應(yīng)模式測算土壤微生物群落的代謝功能多樣性。3、土壤微生物結(jié)構(gòu)多樣性

指土壤微生物群落在細(xì)胞結(jié)構(gòu)組分上的多樣化程度，這是導(dǎo)致微生物代謝方式和生理功能多樣化的直接原因4、土壤微生物的遺傳多樣性

是土壤微生物在基因水平上攜帶的各類遺傳物質(zhì)和遺傳信息的總和，這是微生物多樣性的本質(zhì)和最終反映（二）土壤微生物過程土壤微生物是土壤中物質(zhì)轉(zhuǎn)化的動(dòng)力：如;固氮作用，硝化作用、反硝化作用、腐殖質(zhì)的分解和合成

土壤酶與微生物細(xì)胞一起推動(dòng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化（三）土壤微生物與環(huán)境的關(guān)系

如：全球變暖、森林銳減、土壤退化都與微生物有關(guān)。二、土壤微生物研究方法進(jìn)程

1676年，虎克用自制的單式顯微鏡觀察到細(xì)菌個(gè)體1897年，畢希納用無細(xì)胞酵母菌壓榨汁中的“酒花酶”對(duì)葡萄糖進(jìn)行乙醇發(fā)酵成功，從而開創(chuàng)了微生物生化研究的新時(shí)代1953年，沃森和克里克發(fā)表了關(guān)于DNA雙螺旋模型，整個(gè)生命科學(xué)領(lǐng)域進(jìn)入分子生物學(xué)研究階段，是微生物學(xué)發(fā)展史上成熟到來的標(biāo)志。第二節(jié)土壤微生物的計(jì)數(shù)與分析一、培養(yǎng)計(jì)數(shù)法

根據(jù)培養(yǎng)基上所生長微生物的數(shù)量來估算土壤中微生物的數(shù)量的方法稀釋平板法最大或然數(shù)法（MPN稀釋法）土粒法（一）一般微生物的分離與計(jì)數(shù)

稀釋平板法：

用已知質(zhì)量的土壤在適量的溶液中攪拌的時(shí)候，微生物和土壤分離，這些分開的微生物細(xì)胞在營養(yǎng)瓊脂平板上生長成為分散的菌落，根據(jù)菌落數(shù)換算得單位重量土壤中微生物的數(shù)量。土壤中微生物的數(shù)量很多，因此必須取少量樣品制成土壤懸液，然后稀釋，使發(fā)育在培養(yǎng)皿中的菌落可以很好地分散開最大或然數(shù)法（MPN稀釋法）

用于一些特殊功能菌的計(jì)數(shù)，如，硝化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌

假設(shè)被測定的微生物在稀釋液中均勻分布，并在試管中全部存活，隨著稀釋倍數(shù)的加大，稀釋液中微生物的數(shù)量將越來越少，直到將某一稀釋度的土壤稀釋液接種到培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，沒有或很少出現(xiàn)微生物，根據(jù)沒有出現(xiàn)細(xì)菌的最低稀釋度和出現(xiàn)菌落的最高稀釋度計(jì)算土壤中微生物的數(shù)量。稀釋度10-110-210-310-410-5生長情況++++++++++++++-++--------讀數(shù)55420該系列稀釋中，所有重復(fù)都有生長的最高稀釋度的數(shù)量指標(biāo)是5（10-2），出現(xiàn)菌落的最低稀釋度指標(biāo)是2（10-4），則該例的數(shù)量指標(biāo)為542，查重復(fù)為5稀釋法測數(shù)統(tǒng)計(jì)表得近似值為25稀釋度10-110-210-310-410-5生長情況+++++++++-++---++--------讀數(shù)54220該系列稀釋中，所有重復(fù)都有生長的稀釋度是10-1，指標(biāo)是5，后面還有三個(gè)稀釋度有數(shù)字，則將數(shù)量指標(biāo)最后一個(gè)數(shù)字（2）加到前一個(gè)數(shù)字（2）即544，由表查得近似值為35如果在所有試管都有微生物生長的稀釋度后仍有三個(gè)數(shù)字，土粒法該法是將供試土壤顆粒，排列在適于某一生理類群微生物生長的選擇性固體培養(yǎng)基上，這一類微生物的菌落圍繞著顆粒發(fā)育起來，由這些顆粒在試樣中所占的百分?jǐn)?shù)可以得到這類菌在土壤中的含量及其近似值。（二）、厭氧微生物的分離與計(jì)數(shù)

充氮厭氧培養(yǎng)法

用真空泵抽去真空干燥器中的空氣，用N2、CO2H

或H2代替。在真空干燥器中培養(yǎng)嚴(yán)格厭氧細(xì)菌，可得表面菌落。焦性沒食子酸吸氧法

利用焦性沒食子酸在堿性溶液中能吸收游離氧來創(chuàng)造厭氧環(huán)境。二、土壤微生物生物量的測定氯仿熏蒸法根據(jù)熏蒸和未熏蒸土壤釋放的CO2的量計(jì)算生物量。底物誘導(dǎo)呼吸法在土壤中加入容易分解的底物進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)CO2釋放量計(jì)算。腺苷三磷酸測定法

通過測定土壤中ATP的量測定土壤微生物量第三節(jié)土壤微生物多樣性分析

土壤微生物多樣性是指土壤生態(tài)系統(tǒng)中微生物的物種豐富度和均一度,是調(diào)節(jié)和維護(hù)土壤生態(tài)系統(tǒng)功能的關(guān)鍵因素。她包括微生物群落多樣性、結(jié)構(gòu)多樣性及遺傳多樣性。研究方法基于培養(yǎng)和分離手段來揭示土壤微生物的群落變化?；谏镏甘痉肿樱ㄈ缌字舅?、DNA及RNA）變異模式的土壤微生物多樣性一、微生物功能多樣性研究方法

指土壤微生物群落所能執(zhí)行的功能范圍以及這些功能的執(zhí)行過程，如分解功能、營養(yǎng)傳遞功能等BIOLOG碳素利用法：

是由美國BIOLOG公司于1989年開發(fā)成功，最初應(yīng)用于純種微生物的鑒定，1991年開始應(yīng)用于土壤微生物群落功能多樣性研究，目前以使用BIOLOGECO（生態(tài)板）板最為實(shí)惠而受歡迎?；驹恚和寥牢⑸锛?xì)胞利用31種碳源進(jìn)行代謝，以代謝過程產(chǎn)生的酶與四唑類顯色物質(zhì)（如TTC、TV）發(fā)生顏色反應(yīng)的濁度差異為基礎(chǔ)，運(yùn)用獨(dú)有的顯性排列技術(shù)分析土壤微生物的代謝特征指紋圖譜，反映不同環(huán)境條件引起的土壤微生物群落變化BIOLOG測試板含有96個(gè)小孔，除對(duì)照外，其余孔內(nèi)分別含有不同的有機(jī)碳源和一種指示劑，通過接種菌懸液，根據(jù)微生物對(duì)碳源利用時(shí)指示劑顏色變化差異來鑒定微生物群落功能多樣性該法優(yōu)點(diǎn)靈敏度高、分辨力強(qiáng)無需分離培養(yǎng)純種微生物，可以最大限度地保留微生物群落原有的代謝特征測定簡便，數(shù)據(jù)讀取與記錄可以由計(jì)算機(jī)輔助完成可以連續(xù)監(jiān)測微生物的變化，可批量分析該法缺點(diǎn)特別依賴于群體生理活性，不能監(jiān)測休眠體，也不能檢測那些不能利用BIOLOG碳源底物的群體；如果不能很好地解釋一個(gè)區(qū)系中微生物種類的相互作用如何影響底物的利用情況，很難把這些變化同種類變化聯(lián)系起來；測定是微生物在與野外環(huán)境完全不同的溶液中的代謝活性，因此，也不能確定它的結(jié)果能否反映土壤區(qū)系的實(shí)際代謝情況；二、土壤微生物結(jié)構(gòu)多樣性分析磷脂脂肪酸法也稱為PLEA法（phospholipidfattyacid法）；磷酸脂肪酸是所有微生物細(xì)胞膜磷脂的組分，具有結(jié)構(gòu)多樣性和較高的生物學(xué)特異性，用磷酸脂肪酸作為標(biāo)記物來研究鑒別土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性變化?；驹鞵LEA是構(gòu)成活體生物細(xì)胞膜的重要組分，不同類群微生物能通過相應(yīng)生化途徑形成特定的PLEA，使部分PLEA總是出現(xiàn)在同一類群的衛(wèi)生中，作為區(qū)分活體微生物群落生物標(biāo)記的基礎(chǔ)。以此根據(jù)脂肪酸的種類及組分比例可鑒別土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性變化。該法的缺點(diǎn)很難從種的水平鑒定微生物類群，只能鑒定到屬該法依賴于標(biāo)記脂肪酸，PLEA的組成和濃度可能受土壤微生物生長發(fā)育及其外界環(huán)境的影響，難以區(qū)別死與活的微生物，給微生物群落結(jié)構(gòu)的定性和定量分析帶來了一定困難。土壤中PLEA標(biāo)記物的組成及其穩(wěn)定性受提取方法、提取條件等因素直接影響三、土壤微生物遺傳多樣性的分析指土壤微生物在基因水平所攜帶的各類遺傳物質(zhì)和遺傳信息的綜合，是微生物多樣性的本質(zhì)和最終反映

基于雜交的分析方法(fish技術(shù))基于PCR（聚合酶鏈反應(yīng)，polymerasechainreaction）的分析方法基于PCR（聚合酶鏈反應(yīng)，polymerasechainreaction）的分析方法

土壤DNA提取與純化PCR：PCR能快速特性性擴(kuò)增任何已知序列，并能將pg水平的DNA混合物中的目的基因擴(kuò)增到ng、ug、mg級(jí)的特異性片段變性處理和分析檢測：電泳和酶切海南福山香蕉園土壤微生物多樣性分析過程16SrRNA基因擴(kuò)增轉(zhuǎn)化宿主構(gòu)建16SrRNA基因文庫HhaI酶切構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.香蕉地土壤細(xì)菌種類多樣性分析流程總DNA的提取陽性克隆子進(jìn)行菌落PCR挑選測序、Blast分析多樣性分析16SrRNA基因擴(kuò)增轉(zhuǎn)化宿主構(gòu)建16SrRNA基因文庫HhaI酶切構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹4.香蕉地土壤細(xì)菌種類多樣性分析總DNA的提取陽性克隆子進(jìn)行菌落PCR挑選測序、Blast分析多樣性分析（1）庫容coverageC文庫的庫容計(jì)算：（2）Shannon―Wiener指數(shù)的計(jì)算（3）物種均勻度指數(shù)的計(jì)算公式（4）物種優(yōu)勢度Simpson指數(shù)的計(jì)算公式

（5）物種豐富度Margalef指數(shù)的計(jì)算公式多樣性指數(shù)計(jì)算香蕉園土壤真菌種類多樣性分析香蕉園土壤總DNA進(jìn)行ITS片段擴(kuò)增篩選陽性克隆子進(jìn)行菌落PCR選擇克隆子測序并比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹測得序列提交GeneBank香蕉根際土壤樣品的DNA含量和DNA純度比較土壤樣品DNA純度濃度μg/ml干土μgDNA/gOD260/OD230OD260/OD280發(fā)病蕉園直接法1.571.760.0960.96間接法1.401.690.2560.51健康蕉園直接法1.631.640.0880.88間接法1.481.780.2110.42香蕉地土壤細(xì)菌種類多樣性

圖4

土壤總DNA的16SrDNA擴(kuò)增結(jié)果本研究采用的PCR循環(huán)次數(shù)是15次，同時(shí)做10管，將PCR產(chǎn)物回收后混合均勻，減少PCR偏向性的影響，以保證所構(gòu)建的文庫準(zhǔn)確。香蕉地土壤總DNA16SrDNA片段擴(kuò)增香蕉園土壤微生物多樣性參數(shù)表3土樣16SrDNA文庫的微生物多樣性參數(shù)文庫RFLP庫容香農(nóng)-維納指數(shù)均勻度指數(shù)優(yōu)勢度指數(shù)豐富度指數(shù)編號(hào)類型CHEDdmax發(fā)病蕉園2196%1.710.560.974.34健康蕉園4793.5%3.590.930.928.87測序結(jié)果比對(duì)分析表4發(fā)病香蕉園土壤16SrDNA文庫部分克隆子測序分析編號(hào)所屬物種E值同源性所屬門D1B5Streptomycessp.（鏈霉菌屬）0.0100%放線菌門D1B7Nitrospirasp.（硝化螺菌屬）0.096%硝化螺旋菌門D1B11UnculturedAcidobacteriabacterium0.097%未培養(yǎng)酸桿菌門D1B17

Acidobacteriumsp.（酸桿菌屬）0.094%酸桿菌門D1B19Unculturedprokaryote0.094%未培養(yǎng)原核生物D1B24

Chloroflexussp.（綠彎菌屬）0.095%綠屈撓菌門D1B31Clostridiumsp.（梭菌屬）0.099%厚壁菌門發(fā)病香蕉園病土壤16SrDNA文庫的克隆子有6個(gè)屬，大約有29%屬于厚壁菌門，22%屬于放線菌門，還有少部分屬于硝化螺旋菌門、酸桿菌門、綠屈撓菌門等。編號(hào)所屬種屬E值同源性所屬門D2B006Streptomycessp.（鏈霉菌屬）0.0100%放線菌門D2B007Oscillatoriasp.（顫藻屬）0.099%藍(lán)藻門D2B011Clostridiumsp.（梭菌屬）0.094%厚壁菌門D2B015Azospirillumsp.（固氮螺菌屬）0.087%α-變形菌綱D2B016Sphingomonassp.（鞘脂單胞菌屬）0.097%α-變形菌綱D2B022Clostridiumsp.（梭菌屬）0.094%厚壁菌門D2B027Nitrospirasp.（硝化螺菌屬）0.096%硝化螺旋菌門D2B056Enterobactersp.（腸桿菌屬）0.099%γ-變形菌綱D2B064Acinetobactersp.（不動(dòng)桿菌屬）0.0100%β-變形菌綱D2B075Bacillussp.（芽孢桿菌屬）0.091%厚壁菌門D2B101Sinorhizobiumsp.（中華根瘤菌屬）0.088%α-變形菌綱D2B121Acidobacterialessp.（酸桿菌屬）0.097%酸桿菌門D2B154Lysinibacillussp.

（屬芽孢桿菌科）0.099%厚壁菌門D2B165Dokdonellasp.（屬黃色單胞菌科）0.098%γ-變形菌綱表5健康香蕉園土壤16SrDNA文庫部分克隆子測序分析健康香蕉園土壤16SrDNA文庫的克隆子中有14個(gè)屬，變形菌門占42%，厚壁菌門占26%，放線菌門占11%，酸桿菌門占6%，還有藍(lán)藻門、硝化螺旋菌門等，圖6基于16SrDNA序列的發(fā)病香蕉園土壤細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹B圖6基于16SrDNA序列的健康香蕉園土壤細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹B香蕉地土壤真菌種類多樣性圖7

土壤總DNA的ITS擴(kuò)增結(jié)果香蕉地土樣總DNA的ITS序列擴(kuò)增編號(hào)所屬種屬E值同源性D1I1Fusariumsp.(鐮刀菌屬)0.099%D1I2Stenellamusicola(疣絲孢屬)0.095%D1I14Dioscoreapolystachya(薯蕷屬)0.090%D1I16Cladosporiummusae(