脂肪干細胞的體外培養(yǎng)

脂肪干細胞基礎(chǔ)與臨床

干細胞（Stemcell，SC）：干細胞（Stemcell，SC）是有自我復(fù)制、高度增殖和多向化潛能的細胞群體，這些細胞以通過細胞分裂維持自身細胞的大小，同時又可以進一步分成為各種不同的組織細胞，從構(gòu)成機體各種復(fù)雜的組織器官。

干細胞技術(shù):又稱為再生醫(yī)療技術(shù)，是指通過對干細胞進行分離、體外培養(yǎng)、定向誘導(dǎo)、甚至基因修飾等過程，在體外繁育出全新的、正常的甚至更年輕的細胞、組織或器官，并最終通過細胞、組織或器官的移植實現(xiàn)對臨床疾病的治療。干細胞是整個人體生長發(fā)育的基礎(chǔ)“材料”。

干細胞生物學特性脂肪干細胞生物學特性2001年，Zuk等首次從人抽脂術(shù)抽取的脂肪組織中分離出一種多向分化干細胞，因其與骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSC)形態(tài)相似而稱為脂肪間充質(zhì)干細胞（ASC）。脂肪干細胞具有向脂肪、骨、軟骨、肌肉、內(nèi)皮、造血、肝、胰島和神經(jīng)等多種細胞方向分化的多分化潛能,是一種理想的種子細胞。因脂肪干細胞具有分化為脂肪的潛能，且其具有易獲得性、可迅速擴增、不易衰老等特點，目前脂肪干細胞已成為脂肪組織工程中種子細胞的研究熱點。Zuk等認為，ASC可能由多種異源性細胞構(gòu)成，其中包括內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、平滑肌細胞以及前體脂肪細胞等?，F(xiàn)有ASC主要由成纖維細胞以及來自間葉組織的細胞構(gòu)成，僅伴有少量內(nèi)皮細胞與平滑肌細胞。上述細胞在ASC中的含量甚低，不可能定向培養(yǎng)分化為其他組織細胞，但進一步確認和識別真正的ASC的表面蛋白及其基因仍是必要的。

脂肪來源干細胞脂肪來源干細胞脂肪來源干細胞的命名

脂肪來源干細胞(Adipose

Derived

Stem

Cell,

ADSC)脂肪來源間充質(zhì)干細胞(Adipose

Derived

MsenchymalStem

Cell,

AD-MSC(ASC))脂肪來源血管基質(zhì)成分(StromalVascularFraction,SVF)富含大量的CD34+細胞,從脂肪組織直接獲得富含一定量的CD34+細胞,SVF培養(yǎng)P0-P2不富含CD34+細胞,SVF培養(yǎng)P2之后脂肪干細胞的鑒定在缺少分化刺激因子的條件下，ASC表面標志蛋白有HLA-ABC、CD9、CD10、CD13、CD29、CD34、CD44、CD49、CD54、CD55、CD59、CD105、CD146、CD166；經(jīng)過14d的誘導(dǎo)培養(yǎng)后,ASC雖然發(fā)生了形態(tài)變化，表現(xiàn)出成脂細胞、成軟骨細胞、成骨細胞等分化的特征，但表面蛋白的表達卻大致與未分化前一致，這些表面蛋白與BMSC的表面蛋白很相似。ASC和BMSC均表達CD13、CD29、CD44、CD105，均不表達CD31、CD34、CD45、HLA-DR。雖然從分子標識上看ASC和BMSC具有相同的表面粘附分子和受體分子，但兩者仍有區(qū)別。ASC表達CD49d，而不表達CD106，BMSC則相反，造成這種區(qū)別的機制可能與細胞所處的微環(huán)境及具體功能有關(guān)。間充質(zhì)干細胞沒有特異的表面標志已得到公認。免疫組化染色和流式細胞儀檢測等免疫表型的結(jié)果對確認脂肪干細胞有輔助作用，但鑒定脂肪干細胞的最好方法是進行多系定向誘導(dǎo)，并進行相應(yīng)檢測以確定誘導(dǎo)成功。

脂肪干細胞的表面標記

a)粘附分子：ADAS細胞始終表達tetraspan蛋白(CD9)、整合素β1(CD29)和α4(CD49d)；細胞間粘附分子1(ICAM1，CD54)、endoglin(cd102)、血管細胞粘附分子(VCAM，CD106)及活化的淋巴細胞粘附分子(ALCAM，CD166)。但不表達神經(jīng)細胞粘附分子(NCAM，CD56)、細胞間粘附分子3(ICAM-3，CD50)、整合素αb(CD11b)和β2(CD18)及內(nèi)皮選擇蛋白(Eselectin，CD62)；b)分子受體：可表達透明質(zhì)酸鹽(CD44)和轉(zhuǎn)鐵蛋白(CD71)的受體；c)細胞外基質(zhì)蛋白和糖蛋白：ADAS細胞能生成Ⅰ和型膠原、骨橋蛋白、ostenectin、Thy-1(CD90)和MUC-18(CD146)；d)肌蛋白：能表達平滑肌細胞內(nèi)的肌動蛋白和波形蛋白；e)造血細胞標記：不表達造血細胞標志物CD14、CD31或CD45；f)補體調(diào)節(jié)蛋白：確定能表達衰變加速因子(CD55)和補體蛋白；g)組織相容性抗原：表達類組織相容性蛋白HLA-ABC，而不表達類蛋白HLA-DR。不同的試驗結(jié)果結(jié)果有不同，但這種差異可能是在細胞分離、培養(yǎng)、純正化方法不同，以及免疫組化技術(shù)和流式細胞儀敏感性的不同而造成。總的來說，PAL細胞的免疫表型與已經(jīng)報道的骨髓間充質(zhì)干細胞是相似的。脂肪干細胞的體外培養(yǎng)

脂肪干細胞在脂肪組織中含量很低，要利用脂肪干細胞就必須進行體外分離培養(yǎng)擴增。常用的方法是將剪碎的脂肪組織消化離心，傾去上層脂肪及上清，獲得基質(zhì)血管層，將其收集到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，除去未貼壁的紅細胞和殘渣，剩余的細胞群體稱為加工過的脂肪吸取物。原代培養(yǎng)的細胞中貼壁的細胞較少，細胞生長至融合后傳代，傳代后的細胞稱為脂肪干細胞。平均每300mL脂肪組織可獲得2×108～6×108

個這樣的細胞。

體外培養(yǎng)條件下，ASC的培養(yǎng)不像BMSC對培養(yǎng)基中胎牛血清的來源和質(zhì)量有嚴格要求，DMEM、αMEM、RPMI1640是ASC的常用培養(yǎng)基。一般只添加體積分數(shù)為10％的胎牛血清，并且血清無生產(chǎn)批號限制。在傳代培養(yǎng)中，平均倍增時間為60h。并表現(xiàn)低水平衰老，1代時細胞沒有出現(xiàn)衰老現(xiàn)象，10代時少于5％細胞出現(xiàn)衰老，15代時衰老細胞比例仍低于15％，這表明脂肪ASC體外擴增能力很強，傳代培養(yǎng)易于獲得大量有分化能力的細胞。

脂肪干細胞成脂分化ASC在特定促進因素下可分化為脂肪細胞，長期培養(yǎng)仍可維持此種分化能力。脂肪細胞分化過程大致如下：（1）脂肪干細胞向脂肪細胞定向分化，形成脂肪母細胞（一種尚未出現(xiàn)脂滴的梭形細胞）；（2）脂肪母細胞經(jīng)過生長抑制、克隆性增殖，形成前體脂肪細胞（此時細胞剛開始出現(xiàn)脂滴）；（3）前體脂肪細胞經(jīng)過生長抑制、克隆性增殖和一系列基因表達的變化，形成不成熟脂肪細胞或多室脂肪細胞（內(nèi)含大量小脂滴）；（4）多室脂肪細胞隨著脂肪在細胞中的沉積，小脂滴逐漸匯集成一個大脂滴充滿脂肪細胞的大部分，形成成熟脂肪細胞或單室脂肪細胞，成為成熟的脂肪細胞。目前普遍認為脂肪母細胞是脂肪干細胞接受相關(guān)刺激，如寒冷、激素、生物活性因子、體外實驗性誘導(dǎo)劑刺激后，由多能變?yōu)閱文芏ㄏ蚍只钠鹗茧A段。前脂肪細胞的增殖與分化的關(guān)系為：生長停頓—生長再續(xù)—細胞分化。其中生長停頓是必要的第一步，由單層細胞形成產(chǎn)生的接觸抑制或是藥物的作用、營養(yǎng)因子缺乏引起。脂肪干細胞成脂分化目前已鑒定出的對前脂肪細胞增殖和分化有直接影響的轉(zhuǎn)錄因子主要有：過氧化物酶增殖體（PPARs）——在前脂肪細胞的成脂分化中起主要調(diào)控作用；CCAT增強子結(jié)合蛋白（C／EBP）與ADD-1——可啟動和維持前脂肪細胞向脂肪方向分化，PPARs與配體結(jié)合激活脂肪發(fā)育過程中關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄；脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白(FA)、類胰島素生長因子-1（IGF-1)及其受體在此階段也有表達。脂肪干細胞成脂分化脂肪細胞分化過程中，其細胞形態(tài)、膜表面蛋白、胞質(zhì)內(nèi)容物和基因表達均發(fā)生了極大的改變?？梢愿鶕?jù)這些變化來判定脂肪細胞的分化狀態(tài)。(1)細胞形態(tài)。脂肪細胞貼壁后最初為小圓形，核／漿比例增大，4d后即可觀察到細胞漸成梭形，7d后梭形細胞擴大增殖，開始積聚脂肪顆粒，9d時可觀察到細胞由梭形漸變成橢圓形，積聚有脂肪顆粒的細胞增多。到2周時分化成多脂滴或單脂滴的細胞。(2)脂肪細胞內(nèi)的脂肪含量。對前脂肪細胞分化結(jié)果的定性研究一般采用油紅O或甲烯蘭染色，一般來說，前脂肪細胞在培養(yǎng)的前3d即開始有脂肪的積聚，1周后積聚量明顯增高，2周后達到高峰。(3)脂肪細胞分化不同時期的標志物。細胞開始分化后，隨時間的推移出現(xiàn)PobmRNA以及LPLmRNA這兩種轉(zhuǎn)化早期的標志物，其中前者是體內(nèi)及體外脂肪狀態(tài)的獨特標志物，此時如果外界條件改變，解除了這種生長停頓，則前脂肪細胞的早期標志物消失，重新出現(xiàn)生長和增殖，DNA合成增加。否則，將出現(xiàn)磷酸脫氫酶(GPDH)mRNA這個晚期標志物，并最終變成脂肪細胞。除了上述分化標志外，脂肪細胞在分化過程中還表達其他的標志物，如早期標志物FAtransport，中期標志物FAS、HSL、ACC、aP2、GPAT、GDPH，晚期標志物ACBP、Leptin。可以用PCR技術(shù)檢測這些物質(zhì)的mRNA來判斷脂肪細胞的分化階段。

目前，將脂肪干細胞應(yīng)用于脂肪組織工程的研究剛剛興起，研究還都處于細胞和實驗動物階段，還沒有體外構(gòu)建的脂肪組織在體內(nèi)穩(wěn)定長期存在的報道。

當前，脂肪干細胞應(yīng)用于脂肪組織工程主要有兩種方式：⑴用脂肪干細胞體外擴增一定量的細胞數(shù)后結(jié)合適當?shù)闹Ъ懿牧虾鸵欢ǖ纳锘钚晕镔|(zhì)應(yīng)用于患者；⑵用脂肪干細胞體外構(gòu)建脂肪組織后移植。有研究者利用脂肪生成所需的環(huán)境和細胞因子吸引、招募和趨化周圍的脂肪干細胞，在原位誘導(dǎo)分化成脂肪組織。舉例：Kimura等將Matrigel凝膠和FGF-2細胞生長因子一起注射到大鼠的皮下組織，以吸引鄰近的結(jié)締組織中脂肪干細胞遷移過來形成新的脂肪組織，但僅有微小的脂肪組織生成。Cho等將改進性能的PLGA支架材料做成中空的圓頂狀，移植入裸鼠的皮下，隨后將包被有脂肪干細胞的纖維蛋白凝膠注射于其中，6周后發(fā)現(xiàn)有脂肪組織形成，而且支架結(jié)構(gòu)完好穩(wěn)定。但目前尚未發(fā)現(xiàn)脂肪組織存活更長時間的實驗報道。究其原因，可能是脂肪干細胞的數(shù)量、支持材料的生物相容性和促進脂肪細胞生成的微環(huán)境影響了工程化脂肪組織的長期穩(wěn)定存在?！N子細胞數(shù)量不足！脂肪干細胞的應(yīng)用脂肪來源干細胞臨床實驗

(1)脂肪干細胞雖然可以在誘導(dǎo)下向脂肪組織分化，但目前誘導(dǎo)分化的機制尚不清楚。(2)研究發(fā)現(xiàn)，來自于不同個體、不同部位的脂肪干細胞的分化能力有明顯差別，其具體原因尚不清楚，但卻為進一步探尋脂肪干細胞在體外誘導(dǎo)分化的條件和最佳供體、供區(qū)提供了新的課題。(3)體外培養(yǎng)的脂肪干細胞最終要移入體內(nèi)進行研究，然而用人體來做實驗是不可能的，所以必須建立動物模型。(4)種子細胞最后移入體內(nèi)還需要有合適的載體（即生物材料），目前關(guān)于生物材料的研究較少，所以特異性組織生物材料也將是一個重要而廣闊的研究領(lǐng)域。

脂肪干細胞研究存在問題及展望脂肪干細胞臨床應(yīng)用優(yōu)越性ASC與其它來源干細胞相比有顯著的優(yōu)越性：脂肪是人體來源最豐富的組織。相對于人體其它組織，脂肪干細胞更易于通過脂肪抽吸術(shù)等方式大量獲得，患者的痛苦小，不會對人體產(chǎn)生明顯的生物學和解剖學不良后果。研究發(fā)現(xiàn)250～500mL脂肪抽吸組織可產(chǎn)生超過108個細胞。來自自體，具備免疫相容性，不會產(chǎn)生排斥反應(yīng)和倫理學問題。與骨髓干細胞不同,脂肪干細胞的生長和增殖不需要特殊血清，并且在體外增殖速度快，不必進行永生化處理就能獲得足夠的細胞用于移植，這為臨床移植提供了充足的細胞來源。因此，脂肪干細胞具有用于脂肪組織工程所需細胞的理想特性。以脂肪干細胞作為種子細胞的脂肪組織工程有望在乳房再造術(shù)、除皺術(shù)及凹陷畸形矯正術(shù)中發(fā)揮作用。不同部位成體干細胞來源

優(yōu)點

缺點骨髓來源間充質(zhì)干細胞(BMSC)

自體應(yīng)用無免疫排斥反應(yīng)獲取細胞對病人造成的痛苦大,來源于自體（來源受限）,被感染等不安全因素；細胞相對擴增能力與患者的年齡有關(guān)，越小越好；脂肪來源間充質(zhì)干細胞(ADSC)

自體應(yīng)用無免疫排斥反應(yīng)獲取細胞對病人造成的痛苦大,來源于自體（來源受限）,被感染等不安全因素；血液來源間充質(zhì)干細胞(PBMSC)采集安全,對病人造成痛苦少，來源廣泛（血液干細胞庫）含量少，臨床應(yīng)用受限；細胞擴增能力較差；臍帶來源間充質(zhì)干細胞（HUMSC）

來源廣泛；對于病人造成的痛苦少；建立生命銀行（干細胞庫）；細胞的擴增能力強；研究的歷史比較短幾種間充質(zhì)干細胞的比較20世紀初，自體顆粒脂肪移植開始應(yīng)用于臨床，由于其吸收率高、存活率低，且并發(fā)癥較多，限制了其在臨床中的應(yīng)用。21世紀初，通過改進脂肪獲取技術(shù)，加速了脂肪血管化，提高了脂肪顆粒移植的成活率。但是壞死、吸收仍然是顆粒脂肪移植的主要并發(fā)癥。1998年，Coleman發(fā)明了結(jié)構(gòu)脂肪（liposuction）移植技術(shù)，即在脂肪移植的整個過程中保證脂肪細胞具有更多的完整性和活性，也就是后來所說的Coleman技術(shù)，使脂肪移植的存活率有了很大的提高。近年來，隨著組織工程技術(shù)的迅速發(fā)展，為克服常規(guī)注射顆粒脂肪移植的問題，如吸收、囊腫、硬結(jié)等，Yoshimura等又發(fā)明了細胞輔助的脂肪移植術(shù)（cell-assistedlipotransfer，CAL），為脂肪移植提供了一種更為可靠的方法。該技術(shù)是將自體脂肪來源干細胞（Adipose-derivedstemcells，ASCs）與脂肪細胞混合，聯(lián)合注射移植。脂肪來源干細胞用于醫(yī)學美容細胞輔助的脂肪移植術(shù)-理論基礎(chǔ)細胞輔助的脂肪移植術(shù)的理論基礎(chǔ)1)ASCscandifferentiateintovascularendothelialcellsthatmaycontributetoneoangiogenesisduringthehealingprocessaftertransplantation.Thiseffectmaycontributetothedecreased

amountofcentralnecrosisandmarkedmicrovasculatureintheouterlayersofCALfatseeninthisstudy.2)someASCsmaydifferentiateintomatureadipocytes

andpartlyconstitutetransplantedfat.3)ASCsreleaseangiogenicsolublefactorssuchasvascularendothelial

growthfactorandhepatocytegrowthfactor,accelerating

neoangiogenesisfromthesurroundinghosttissueina

paracrinemanner.間質(zhì)血管碎片是CAL最重要的組分ASCs存在于脂肪組織的間質(zhì)血管碎片中（stromalvascularfraction,SVF）。間質(zhì)血管碎片（SVF）是干細胞輔助脂肪移植中最重要的組分。通過膠原酶消化，從脂肪組織中分離的多種細胞混合物形成的細胞團就叫做間質(zhì)血管碎片（SVF）。間質(zhì)血管碎片中含有豐富的間充質(zhì)細胞，可分化為多種譜系的細胞，是再生醫(yī)學、組織工程等最理想的種子細胞。其中主要包括間質(zhì)細胞、血管內(nèi)皮細胞和壁細胞。另外，SVF中也包括一些血管來源的細胞，如白細胞和紅細胞等，而血管來源細胞的比率主要取決于個體出血的多少。在CAL中，不需經(jīng)過人工的分選及培養(yǎng)，直接將分離的新鮮的自體SVF用來做脂肪移植補充物。另外，有研究指出新鮮分離的脂肪干細胞與培養(yǎng)增殖的干細胞相比可能在治療方面更具有安全性和有效性。因為SVF包含其他細胞，如血管內(nèi)皮細胞或巨噬細胞等，許多研究發(fā)現(xiàn)它們之間有一種協(xié)同效應(yīng)。

ASCs在脂肪移植中的作用脂肪移植后脂肪組織的存活和萎縮的機制并未得到證明。移植后無微血管的脂肪組織被安置于異位組織中—相對缺血區(qū)，最初幾天的營養(yǎng)灌注來自于宿主組織周圍組織，直到形成新的微血管。對于損傷的反應(yīng)，損傷的宿主組織，特別是細胞外基質(zhì)和死亡的細胞會釋放FGF。在修復(fù)過程中，脂肪細胞（對缺氧很敏感）在氧壓低于其閾值的情況下24h內(nèi)可能死亡。ASCs更能耐受缺氧，其在缺氧情況下可保持功能72h。在動物模型的缺血再灌注損傷的脂肪組織中，ASCs在脂肪移植的修復(fù)過程中及在脂肪化和血管化中起著重要的作用其可調(diào)節(jié)周圍組織中生長激素及細胞因子的釋放，并通過分泌各種生長因子如VEGF,IGF-1防止細胞凋亡，使脂肪組織的再生和凋亡達到平衡。ASCs被認為是一種脂肪細胞和血管細胞的雙重祖細胞。ASCs可為脂肪組織的轉(zhuǎn)歸和下一代的再生提供原始細胞，脂肪組織細胞凋亡后可被ASCs來源的下一代細胞取代。脂肪組織會隨著發(fā)育、肥胖而增殖，也會隨著老齡化、缺血而發(fā)生萎縮，還可在損傷后修復(fù)、缺血再灌注的損傷及脂肪移植后起到塑形作用。CAL技術(shù)簡介CAL技術(shù)簡介ASCs在細胞輔助的脂肪移植術(shù)（CAL）中的作用CAL技術(shù)是將新抽取脂肪分成兩份:一份用來提取SVF，另一份作為提取的細胞外基質(zhì)，兩部分聯(lián)合提高ASCs濃度，注射于受區(qū)。吸脂的脂肪組織與完整脂肪組織相比，ASCs的數(shù)量只有原來的一半。其原因可能是因為一部分ASCs停留在大血管周圍或留在受體組織中，一部分ASCs釋放入吸脂脂肪的液體成分中。這種低ASCs比率可能是移植的脂肪組織長時間后萎縮的主要原因。在CAL中，脂肪組織可作為有活力的生物支架，使新鮮的包含ASCs的SVF粘附于脂肪組織上，不僅增加了前體細胞的數(shù)量，還有利于組織血管的形成和ASCs向脂肪組織的轉(zhuǎn)歸，提高了脂肪組織的成活率。Yoshimura認為ASCs在CAL中的作用可能是：①分化成脂肪細胞并促進脂肪再生；②代替內(nèi)皮祖細胞分化成血管內(nèi)皮細胞和壁細胞，，加速移植脂肪的血管化和再成活；③在缺氧、損傷等條件下可促進血管生長因子釋放，如肝細胞生長因子（HGF）,基質(zhì)細胞衍生因子-1(SDF-1)；④最有可能的就是ASCs作為原始的ASCs而成活。多位點微劑量注射技術(shù)抽取脂肪在無菌手術(shù)室中進行（surgicalunit，SU），兩個細胞無菌處理室連接在一起（cellprocessingandsurgicalunit，CPSU），同時進行。將上述高濃度干細胞與脂肪混合物，均勻注入乳房后間隙和皮下脂肪中，可增大乳房每側(cè)１００～２００ｍｌ，最大可達２７０ｍ