第5章表達載體2014

第五章表達載體第一節(jié)大腸桿菌表達載體第二節(jié)穿梭載體第三節(jié)整合載體表達載體構(gòu)建的一般原則1、閱讀框架要使目的基因得以表達，最重要的因素是外源目的基因本身必須置于正確的閱讀框架之中。用人工接頭可以調(diào)節(jié)閱讀框架，選擇適當?shù)娜斯そ宇^，就可使外源基因處于正確的閱讀框架中。2、啟動子（關(guān)鍵因素）有效的轉(zhuǎn)錄起始是外源基因能否在宿主細胞中高效表達的關(guān)鍵步驟之一。

因此，選擇強的啟動子及其相關(guān)的調(diào)控序列，是構(gòu)建一個高效表達載體首先要考慮的問題。3、轉(zhuǎn)錄的有效延伸和終止外源基因的轉(zhuǎn)錄一旦被起始，接下來的問題是如何保證mRNA有效地延伸、終止。轉(zhuǎn)錄衰減和非特異性終止可誘發(fā)轉(zhuǎn)錄提前終止。措施：

（1）除去衰減子

（2）插入抗轉(zhuǎn)錄終止序列

（3）強轉(zhuǎn)錄終止序列4、有效的翻譯起始（關(guān)鍵因素）原核：SD序列，能幫助從起始AUG處開始翻譯。真核：kozak（科扎克）序列，核糖體能夠識別mRNA上的這段序列，并把它作為翻譯起始位點。5、翻譯終止密碼選擇在原核生物中，翻譯的終止由兩個釋放因子所控制，RF1識別UAA和UAG，RF2識別UAA和UGA。由于UAA為兩個釋放因子所識別，因此在基因工程中，一般采用UAA作為終止碼。6、外源蛋白的穩(wěn)定性可采取以下措施避免克隆的蛋白被選擇性降解：（1）構(gòu)建融合基因，產(chǎn)生融合蛋白，使外源蛋白不被選擇性降解（2）構(gòu)建成可分泌的蛋白：不是所有的外源蛋白都可以通過基因操作成為可分泌蛋白。（3）使外源蛋白在宿主細胞中以包涵體的形式表達總之，構(gòu)建表達載體應根據(jù)表達體系的特性，選擇性地應用上述原則，刪除降低外源基因表達的一些元件，插入提高外源基因表達的一些必需元件。大腸桿菌表達外源基因的優(yōu)勢

全基因組測序，共有4405個開放型閱讀框架基因克隆表達系統(tǒng)成熟完善繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定被美國FDA(美國食品藥物管理局)批準為安全的基因工程受體生物第一節(jié)大腸桿菌表達載體大腸桿菌表達外源基因的劣勢

缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的復性功能缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng)內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白細胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素10一、大腸桿菌表達載體的結(jié)構(gòu)

原核表達載體：適用于在原核細胞中表達外源基因的載體。均是質(zhì)粒載體，首先必然滿足克隆載體的基本要求，然后增加表達元件。111、表達元件(expressionelements)1）啟動子(promoter)：三類，即lac啟動子、trp啟動子和它們的雜合啟動子tac或trc，都受IPTG誘導。T7噬菌體啟動子λ噬菌體的PL啟動子。2）終止子：依賴于ρ因子或不依賴于ρ因子（遇莖環(huán)結(jié)構(gòu)而終止）。3）核糖體結(jié)合位點(ribosomebindingside,RBS)：是mRNA上的特異性序列，核糖體可以識別并結(jié)合這一序列來啟動翻譯過程。2、表達形式完整單一蛋白：單一基因的編碼區(qū)表達。融合蛋白(fusionprotein)：多個基因的編碼區(qū)的串聯(lián)體，但構(gòu)成一個整體的單一ORF，如果融合標簽蛋白有利于蛋白的定向、純化，如果融合多個目標蛋白，則類似于直接表達了一個多酶復合體一樣，可減少載體構(gòu)建難度，而且可以偶連兩個或多個相關(guān)基因的表達。12133、表達的控制誘導表達系統(tǒng)：IPTG防滲漏表達系統(tǒng)：lacIq，一種能產(chǎn)生過量的LacI阻遏蛋白（阻遏轉(zhuǎn)錄過程）的lacI

基因的突變體。PL啟動子受cⅠ基因（阻遏溶菌周期基因表達）產(chǎn)物的抑制，在λ噬菌體溶原的大腸桿菌中表達。cⅠ基因的溫度敏感突變體cI857（ts）：低溫(30℃)下阻抑轉(zhuǎn)錄，高溫(40-45℃)下解除抑制。T7噬菌體啟動子：較復雜二、利用T7噬菌體啟動子的表達載體大腸桿菌T7噬菌體具有一套專一性非常強的轉(zhuǎn)錄體系，利用這一體系中的元件為基礎(chǔ)構(gòu)建的表達系統(tǒng)稱為T7表達系統(tǒng)。14

T7表達系統(tǒng)T7噬菌體基因1編碼的T7RNA聚合酶選擇性的激活T7噬菌體啟動子的轉(zhuǎn)錄。T7RNA聚合酶活性高，其合成RNA的速度比大腸桿菌RNA聚合酶快5倍左右。并可以轉(zhuǎn)錄某些不能被大腸桿菌RNA聚合酶有效轉(zhuǎn)錄的序列。15T7表達系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機理

T7噬菌體啟動子的轉(zhuǎn)錄完全依賴于T7RNA聚合酶，因此T7RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式就決定了表達系統(tǒng)的調(diào)控方式。

化學誘導型溫度誘導型雙質(zhì)粒系統(tǒng)T7RNA

聚合酶T7啟動子目的基因

T7RNA聚合酶基因？啟動子16化學誘導型噬菌體DE3是λ噬菌體的衍生株，一段含有l(wèi)acI啟動子和T7RNA聚合酶基因的DNA片段被插入其中。用噬菌體DE3的溶源菌作為表達載體的宿主菌，調(diào)控方式為化學誘導型，類似于Lac表達系統(tǒng)。

T7RNA聚合酶基因

lac

啟動子E.Coli（DE3）T7啟動子

目的基因T7RNA

聚合酶IPTG誘導溫度誘導型

PL

啟動子控制T7RNA聚合酶基因，通過熱誘導方式激發(fā)T7噬菌體啟動子的轉(zhuǎn)錄。

這種方式可以使本底轉(zhuǎn)錄降到很低的水平，尤其適用于表達對大腸桿菌宿主有毒性的重組蛋白質(zhì)。

T7RNA聚合酶基因

PL

啟動子E.Coli（CE6）T7啟動子

目的基因T7RNA

聚合酶熱誘導cI857雙質(zhì)粒系統(tǒng)

一個質(zhì)粒帶有T7RNA聚合酶基因，另一個質(zhì)粒帶有T7啟動子和目的基因

兩個質(zhì)粒的復制子和抗性標記不能相同，調(diào)控方式為控制T7RNA聚合酶的啟動子調(diào)控類型T7RNA

聚合酶熱誘導T7啟動子

目的基因

T7RNA聚合酶基因

PL

啟動子

cI857

p15Aori

KanRColE1ori

AmpR19T7表達系統(tǒng)存在的問題

T7表達系統(tǒng)表達目的基因的水平是目前所有表達系統(tǒng)中最高的，但也不可避免出現(xiàn)在相對較高的本底轉(zhuǎn)錄，如果目的基因產(chǎn)物對大腸桿菌宿主有毒性，會影響細胞的生長。解決辦法在表達系統(tǒng)中低水平表達T7溶菌酶基因，能與T7RNA聚合酶結(jié)合抑制其轉(zhuǎn)錄的活性。通過共轉(zhuǎn)化質(zhì)粒導入表達系統(tǒng)，它能明顯降低本底轉(zhuǎn)錄。20表達融合蛋白有下列優(yōu)點：

(1)轉(zhuǎn)錄和翻譯起始從正常的E.coli序列開始，故通?？梢援a(chǎn)生高水平的融合蛋白。

(2)融合蛋白往往比天然的外源蛋白更加穩(wěn)定。

(3)產(chǎn)生的融合蛋白較大，因此很容易從蛋白質(zhì)凝膠電泳中區(qū)別出來。融合蛋白帶可以從凝膠上切下，經(jīng)冷凍干燥，磨成粉末后即可作為抗原。

(4)有些融合蛋白帶有信號肽，可以分泌到細胞外，這有助于蛋白質(zhì)的分離和純化。三、表達融合蛋白的表達載體2122

融合型表達載體PSDForeignDNA融合型表達載體融合基因23技術(shù)關(guān)鍵：克隆基因可插入標簽肽序列的3’或5’端，但必須維持正確的ORF。選擇合適酶切位點加人工合成的DNA接頭構(gòu)建位相載體24位相載體----含有3種讀碼框的系列載體25常用的融合表達載體1、GST(glutahioneS-transferase,谷胱苷肽S-轉(zhuǎn)移酶)表達載體：如Amersham公司(阿莫仙醫(yī)藥公司)的pGEX系列，其GST來自于血吸蟲，融合蛋白下保持酶學活性，對谷胱苷肽有很強的結(jié)合能力，融合蛋白純化出來后用凝血蛋白酶切割可得到純的目的蛋白。谷胱甘肽固定在瓊脂糖樹脂上形成親和層析柱表達融合蛋白的全細胞提取物通過層析柱融合蛋白吸附在樹脂上其他細胞蛋白被洗脫出來用含游離的還原型谷胱甘肽的緩沖液洗脫融合蛋白被釋放出來用凝血蛋白酶切割融合蛋白獲得純化的目的蛋白26位相載體Ptac：IPTG誘導GST融合蛋白—直接純化產(chǎn)物，切割方便：

pGEX-1T—凝血酶

pGEX-2T---凝血酶

pGEX-3T---X因子融合型載體----pGEX系列2、組氨酸標簽表達載體：如Novagen公司的pET系列，可在目標蛋白的N-端或C-端加上6個組氨酸的標簽和Xa因子酶切位點，多聚組氨酸能與鎳等二價金屬離子結(jié)合，純化目的蛋白，用Xa因子處理可得到純的目的蛋白。

將2價重金屬陽離子固定在樹脂上，便可對帶His標簽的融合蛋白進行親和層析分離。純化的融合蛋白再用Xa因子處理可去除標簽多肽，從而獲得純化的目的蛋白。27283、內(nèi)含肽表達載體(即蛋白質(zhì)內(nèi)含子,是存在于前體蛋白質(zhì)中的一段氨基酸序列)：如NEB公司的Impact-Twin系統(tǒng)，將目的蛋白放在兩個可自裂解的內(nèi)含肽(intein)中間，在得到融合蛋白以后不通過蛋白酶消解、只需要調(diào)節(jié)pH值等條件就將標簽蛋白切除。4、分泌表達載體：產(chǎn)物可跨膜分泌至胞周間隙，可避免受細胞內(nèi)蛋白酶的降解，或使其正確折疊，或去除N-端甲硫氨酸，以維護活性。信號肽(signalpeptide)有堿性磷酸酶信號肽、蛋白質(zhì)A信號肽（如Amersham公司的pEZZ18系統(tǒng)）。29分泌型融合表達載體----pEZZ18Plac：Lac啟動子Pspa：金黃色葡萄球菌蛋白A啟動子S：蛋白A的信號肽序列兩個合成的Z功能域（結(jié)合免疫球蛋白G，瓊脂糖層析柱）四、表達產(chǎn)物的純化1、包涵體蛋白的純化通過機械法、超聲波處理等方法破碎外源蛋白的細胞→離心→獲得包涵體→洗滌→去除包涵體結(jié)合的細胞蛋白→利用鹽酸胍、尿素和SDS等溶解包涵體→蛋白質(zhì)重新折疊302、可溶性蛋白的純化融合蛋白的表達標簽可用于分離純化目的蛋白分泌表達載體也有助于分離純化可溶性的表達產(chǎn)物?？扇苄缘谋磉_產(chǎn)物一般可展現(xiàn)應有的蛋白質(zhì)活性。31不同微生物種類所產(chǎn)生的活性物質(zhì)類型有明顯差異，不同的研究目標應選擇不同的宿主菌株。如70%的抗生素來源于放線菌，如以尋找抗菌抗腫瘤活性物質(zhì)為目標，選擇鏈霉菌為宿主較理想，而篩選新的酶則采用大腸桿菌為宜。3233穿梭載體(shuttlevector)：能夠在兩類不同的宿主中復制、增殖和選擇的載體，主要是質(zhì)粒，它們至少有兩套復制單元和兩套選擇標記，相當于兩個載體的聯(lián)合。通常穿梭載體在細菌中用于克隆、擴增克隆的基因，在酵母菌中用于基因表達分析。

第二節(jié)穿梭載體34一、大腸桿菌/革蘭氏陽性菌穿梭載體：如向枯草芽孢桿菌的穿梭。二、大腸桿菌/酵母菌穿梭載體：主要用于遺傳學和真核表達研究，尤其是當?shù)鞍仔枰M行真核修飾時，如磷酸化、糖基化等。三、其它穿梭載體：如動物病毒載體、植物轉(zhuǎn)化的Ti質(zhì)粒、昆蟲桿狀病毒等，更為復雜一些。第三節(jié)整合載體當外源基因整合到宿主細胞的染色體后，可以穩(wěn)定地遺傳，進而達到穩(wěn)定表達的目的。整合載體：將某個基因或某些基因插入到染色體中去的載體。根據(jù)整合方式的不同可分為定點整合和隨機整合。根據(jù)其作用可分為目的基因的插入或敲除以及隨機突變體庫的構(gòu)建。353.1基因插入/基因敲除同源重組整合載體是最常用的整合載體，該載體不僅含有大腸桿菌克隆載體的骨架，更主要的是含有一段便于同源重組的重組DNA片段。

363.2隨機插入突變載體

隨機突變體庫——指標記基因在載體的攜帶下通過DNA重組事件隨機插入基因組中而形成的突變體的集合。37（1）、微生物插入突變載體轉(zhuǎn)座子是一類在細菌的染色體、質(zhì)?；蚴删w之間自行移動的遺傳成分,是基因組中一段特異的具有轉(zhuǎn)位特性的獨立的DNA序列。以pEG922為例，其可用于革蘭氏陽性細菌插入突變體庫的構(gòu)建。該載體上含有在革蘭氏陽性細菌中復制和選擇的復制區(qū)（該復制區(qū)是溫度敏感型的，在42℃下不能復制）和氯霉素抗性基因。38插入突變體庫的構(gòu)建將裝載了一個四環(huán)素抗性基因的轉(zhuǎn)座子Tn5401插入到載體pEG922中→將該載體轉(zhuǎn)化到革蘭氏陽性細菌→轉(zhuǎn)座子發(fā)生一定頻率的轉(zhuǎn)座→在42℃下篩選僅有四環(huán)素抗性的菌落→得到的菌落就是發(fā)生轉(zhuǎn)座的突變子（由于在高溫下載體不能復制，隨著細胞的分裂，載體就會丟失，只有發(fā)生轉(zhuǎn)座事件的菌體才能表現(xiàn)出四環(huán)素抗性的表型。）392、構(gòu)建植物突變體庫所用的載體

根瘤農(nóng)桿菌介導的T-DNA插入或植物轉(zhuǎn)座子標簽是植物基因功能研究中常用的產(chǎn)生突變體的方法。

（1）T-DNA插入突變體

根瘤農(nóng)桿菌介導的T-DNA