第十四章免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)

第十四章免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)主要內(nèi)容一、Ag或Ab檢測(cè)二、細(xì)胞免疫檢測(cè)三、細(xì)胞因子檢測(cè)一、Ag或Ab檢測(cè)抗原-抗體反應(yīng)：指抗原與相應(yīng)抗體在體內(nèi)、外發(fā)生高度特異性結(jié)合反應(yīng)。由于實(shí)驗(yàn)所用的抗體存在于血清中，故又稱(chēng)血清學(xué)反應(yīng)（serologicalreaction)應(yīng)用：用已知抗原檢測(cè)未知抗體；用已知抗體檢測(cè)未知抗原：定性或定量檢測(cè)體內(nèi)各種分子；用已知抗體檢測(cè)半抗原物質(zhì)。1.特異性和交叉反應(yīng)

特異性：一種抗原通常僅能與由它刺激所產(chǎn)生的抗體結(jié)合。分子基礎(chǔ)：抗原表位與抗體分子高變區(qū)之間空間構(gòu)型的互補(bǔ)性。（一）抗原-抗體反應(yīng)的特點(diǎn)交叉反應(yīng)（crossreaction）性：若兩種抗原分子有一個(gè)或數(shù)個(gè)相同（或相似）的決定基，則針對(duì)一種抗原的抗血清可與另一種抗原發(fā)生反應(yīng)。結(jié)合價(jià)：天然抗原分子表面一般含多種抗原決定基，可與多個(gè)抗體分子結(jié)合，為多價(jià)。單體形式的抗體分子有兩個(gè)Fab段，能結(jié)合兩個(gè)相同的抗原決定基，為兩價(jià)。

2.比例性比例合適：若抗原、抗體的數(shù)量比例合適，抗體分子的兩個(gè)Fab段分別與兩個(gè)抗原決定基結(jié)合，相互交叉連接成網(wǎng)格狀復(fù)合體，則反應(yīng)體系中基本不存在游離的抗原或抗體，此時(shí)形成肉眼可見(jiàn)的反應(yīng)物（沉淀物或凝集物）。因此，確定反應(yīng)體系中抗原、抗體的最適比例十分重要。前帶現(xiàn)象（prozone）和后帶現(xiàn)象(postzone)

Ab過(guò)剩和Ag過(guò)?？乖涂贵w結(jié)合是否呈現(xiàn)可見(jiàn)的反應(yīng)現(xiàn)象，與兩者的濃度和比例密切相關(guān)前帶現(xiàn)象（prozone）和后帶現(xiàn)象(postzone)Ab過(guò)剩和Ag過(guò)剩網(wǎng)格學(xué)說(shuō)（latticetheory）抗體過(guò)?？乖^(guò)剩抗體抗體比例合適抗原抗體抗原-抗體反應(yīng)為分子表面的非共價(jià)結(jié)合，結(jié)合雖穩(wěn)定但可逆。在一定條件下（如低pH、高濃度鹽、凍融等），抗原-抗體復(fù)合物可被解離。解離后的抗原和抗體仍保持原有理化特性和生物學(xué)活性。根據(jù)此特點(diǎn)，可借助親和層析法純化抗原或抗體。3.可逆性4.階段性抗原抗體反應(yīng)可分為兩個(gè)階段

特異性結(jié)合階段：反應(yīng)快，不可見(jiàn)。

可見(jiàn)的反應(yīng)階段：反應(yīng)慢，出現(xiàn)凝集、沉淀和細(xì)胞溶解等現(xiàn)象。

1.電解質(zhì)

抗原和抗體有對(duì)應(yīng)的極性基團(tuán)，能相互吸附并由親水性變?yōu)槭杷?。電解質(zhì)的存在使抗原-抗體復(fù)合物失去電荷而凝聚，出現(xiàn)可見(jiàn)反應(yīng)，故免疫學(xué)試驗(yàn)中多用生理鹽水稀釋抗原或抗體。（二）、抗原-抗體反應(yīng)的影響因素2.酸堿度抗原抗體反應(yīng)的最適pH是6-8。3.溫度最適溫度為37℃。有些例外，如冷凝集素在4℃左右與紅細(xì)胞結(jié)合最好，20℃以上反而解離。

4.抗原和抗體的性質(zhì)抗體的特異性和親和力是決定抗原-抗體反應(yīng)的關(guān)鍵因素。此外，抗原理化性質(zhì)、抗原決定基多寡和種類(lèi)等均可影響抗原-抗體反應(yīng)。

抗體分子上一個(gè)抗原結(jié)合點(diǎn)與對(duì)應(yīng)的抗原決定基之間的結(jié)合能力親和力(affinity)

根據(jù)抗原的性質(zhì)、結(jié)合反應(yīng)的現(xiàn)象、參與反應(yīng)的成分等因素分類(lèi)：

1.凝集反應(yīng)

2.沉淀反應(yīng)

3.補(bǔ)體參加的反應(yīng)

4.中和反應(yīng)

5.免疫標(biāo)記技術(shù)（三）、Ag-Ab反應(yīng)的基本檢測(cè)方法

反應(yīng)類(lèi)型實(shí)驗(yàn)技術(shù)非標(biāo)記凝集反應(yīng)直接凝集試驗(yàn)、間接凝集試驗(yàn)、間接抑制凝集試驗(yàn)、協(xié)同凝集試驗(yàn)沉淀反應(yīng)液相內(nèi)凝集試驗(yàn)、凝膠內(nèi)凝集試驗(yàn)補(bǔ)體參與的反應(yīng)補(bǔ)體溶血試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)中和反應(yīng)病毒中和試驗(yàn)、毒素中和試驗(yàn)標(biāo)記標(biāo)記免疫反應(yīng)熒光免疫技術(shù)放射免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)發(fā)光免疫技術(shù)金免疫技術(shù)顆粒性抗原（細(xì)菌或細(xì)胞等）與相應(yīng)抗體結(jié)合，在一定條件下，出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集物，稱(chēng)為凝集反應(yīng)(agglutination)

。用于凝集反應(yīng)中的抗原稱(chēng)凝集原(agglutinogen)。用于凝集反應(yīng)中的抗體稱(chēng)凝集素（agglutinin)。

凝集反應(yīng)（AgglutinationTests）1．直接凝集（directagglutination)

：

細(xì)菌或紅細(xì)胞與相應(yīng)抗體直接反應(yīng)，可出現(xiàn)細(xì)菌或紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。2．間接凝集（indirectorpassiveagglutination)：檢測(cè)針對(duì)可溶性Ag的Ab3．間接凝集抑制試驗(yàn)

(directagglutinationinhibitiontest)4.協(xié)同凝集試驗(yàn)（co-agglutinationtest）妊娠免疫診斷試驗(yàn)

孕婦尿中，絨毛膜促性腺激素（HCG）含量明顯增高。（HCG是可溶性抗原）反之，非孕婦尿中HCG含量甚微，不足以消耗掉抗HCG抗體。Definition:可溶性抗原（血清蛋白、外毒素、細(xì)菌濾液等）與相應(yīng)抗體結(jié)合，在一定條件下，形成出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的沉淀物的現(xiàn)象稱(chēng)為沉淀反應(yīng)。沉淀反應(yīng)（PrecipitationTests）

用于沉淀反應(yīng)中的抗原稱(chēng)沉淀原(precipitonogen)。用于沉淀反應(yīng)中的抗體稱(chēng)沉淀素（precipitin)。

大多沉淀反應(yīng)多用半固體瓊脂凝膠作為介質(zhì)進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散或免疫擴(kuò)散，即可溶性抗原與抗體在凝膠中擴(kuò)散，在比例合適處相遇即形成可見(jiàn)的白色沉淀。1．單向免疫擴(kuò)散(singleimmunodiffusion)2．雙向免疫擴(kuò)散(doubleimmunodiffusion)3．免疫電泳(immunoelectrophoresis)4．免疫比濁(immunonephelometry)沉淀反應(yīng)單向免疫擴(kuò)散

(SingleImmunodiffusion)是將一定量已知抗體混于瓊脂凝膠中制瓊脂板，在適當(dāng)位置打孔后將抗原加入孔中擴(kuò)散?？乖跀U(kuò)散過(guò)程中與凝膠中的抗體相遇，形成以抗原孔為中心的沉淀環(huán)，環(huán)的直徑與抗原含量成正比相關(guān)。本法常用于測(cè)定血清IgG、IgM、IgA

和C3等的含量。含抗體的凝膠沉淀環(huán)雙向免疫擴(kuò)散

（DoubleImmunodiffusion)是將抗原與抗體分別加入瓊脂凝膠的小孔中，二者自由向周?chē)鷶U(kuò)散并相遇，在比例合適處形成沉淀線。如果反應(yīng)體系中含兩種以上的抗原抗體系統(tǒng)，則小孔間可出現(xiàn)兩條以上的沉淀線。本法常用于抗原或抗體的定性、組成和兩種抗原相關(guān)性分析的檢測(cè)。免疫電泳

（Immunoelectrophoresis)

免疫電泳技術(shù)是電泳分析與沉淀反應(yīng)的結(jié)合產(chǎn)物。兩大優(yōu)點(diǎn)：一是加快了沉淀反應(yīng)的速度，二是將某些蛋白組分利用其帶電荷的不同而將其分開(kāi)，再分別與抗體反應(yīng)，以此作更細(xì)微的分析。免疫電泳包括:血清免疫電泳、對(duì)流免疫電泳、火箭電泳、免疫印跡等免疫電泳

（Immunoelectrophoresis)是先將待側(cè)血清標(biāo)本作瓊脂凝膠電泳，血清中各蛋白組分被分成不同的區(qū)帶，然后與電泳方向平行挖一小槽，加入相應(yīng)的抗血清，把分成區(qū)帶的蛋白抗原成分作雙向免疫擴(kuò)散，在各區(qū)帶相應(yīng)的位置形成沉淀弧。該法常用于血清蛋白種類(lèi)分析，以觀察Ig的異常增多或缺失。免疫電泳原理圖解火箭電泳（RocketElectrophoresis)

火箭電泳也稱(chēng)單向電泳擴(kuò)散免疫沉淀試驗(yàn)，是把單向免疫擴(kuò)散同電泳結(jié)合在一起的方法。抗原在含有定量抗體的瓊脂中泳動(dòng)，兩者比例適宜時(shí)，在較短時(shí)間內(nèi)生成錐形的沉淀峰。在一定濃度范圍內(nèi)，沉淀峰的高度與抗原含量成正比。此法的特點(diǎn)是需時(shí)較短，故可用于快速沉淀標(biāo)本中抗原的含量。火箭電泳示意圖沉淀線的高度與抗原量成正比補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（ComplementFixationtest,CFT)

敏感性和特異性均較高，但該試驗(yàn)影響因素較多，現(xiàn)在已有被其它新方法取代的趨勢(shì)。補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(complementfixationtest，CFT)

將免疫溶血作為指示系統(tǒng)，用以檢測(cè)另一反應(yīng)系統(tǒng)中抗原或抗體的傳統(tǒng)方法。試驗(yàn)原理作用原理：利用補(bǔ)體的溶細(xì)胞作用進(jìn)行各種物理狀態(tài)的抗原抗體測(cè)定5種成分，3個(gè)系統(tǒng)反應(yīng)系統(tǒng)（溶菌系統(tǒng)）：已知抗原（或抗體）與待測(cè)抗體（或抗原）補(bǔ)體系統(tǒng)：指示系統(tǒng)（溶血系統(tǒng)）：SRBC與相應(yīng)溶血素。試驗(yàn)時(shí)常將其預(yù)先結(jié)合，成為致敏綿羊紅細(xì)胞（sensitizedsheepredbloodcell,SRBCS）。溶菌系統(tǒng)反應(yīng)分兩步進(jìn)行

第一步:反應(yīng)系統(tǒng)與補(bǔ)體的作用

第二步:指示系統(tǒng)利用剩余補(bǔ)體的反應(yīng)不溶血為補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)陽(yáng)性，而溶血為試驗(yàn)陰性已知抗原加入血清（檢測(cè)抗體）加入標(biāo)準(zhǔn)量補(bǔ)體加入包被抗體的紅細(xì)胞檢測(cè)紅細(xì)胞溶解情況AgYYPatient’sserum

YYYYYYYYAbNoAbAg用熒光素、酶、放射性核素或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等標(biāo)記抗體或抗原，進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)的檢測(cè)，是目前應(yīng)用最為廣泛的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)。標(biāo)記物與抗體或抗原連接后并不改變抗原抗體的免疫特性，具有靈敏度高、快速、可定性、定量、定位等優(yōu)點(diǎn)。免疫標(biāo)記技術(shù)（Immunolabellingtechnique）

用熒光素與抗體連接成熒光抗體，再與待檢標(biāo)本中抗原反應(yīng)，置熒光顯微鏡下觀察，抗原-抗體復(fù)合物散發(fā)熒光，借此對(duì)抗原進(jìn)行定性或定位。

1．免疫熒光法(immunofluorescence,IF)（1）直接熒光法：熒光素直接標(biāo)記抗體，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。該法優(yōu)點(diǎn)是特異性高，缺點(diǎn)是檢查任一抗原均須制備相應(yīng)熒光抗體。（2）間接熒光法：用一抗與標(biāo)本中抗原結(jié)合，再用熒光素標(biāo)記的二抗進(jìn)行檢測(cè)。該法優(yōu)點(diǎn)是敏感度比直接法高，制備一種熒光素標(biāo)記的二抗即可用于多種抗原的檢測(cè),但非特異性反應(yīng)亦增強(qiáng)。免疫熒光法分類(lèi)免疫熒光法圖示

此法將抗原-抗體反應(yīng)的特異性與酶催化作用的高效性相結(jié)合，借助酶作用于底物的顯色反應(yīng)判定結(jié)果。應(yīng)用酶標(biāo)測(cè)定儀測(cè)定光密度（OD）值可反映抗原含量，靈敏度達(dá)ng/ml甚至pg/ml水平。常見(jiàn)的標(biāo)記物為：辣根過(guò)氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AP）

２．酶免疫測(cè)定(enzymeimmunoassay,EIA)常用的方法如下：（1）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)（2）免疫細(xì)胞或組織化學(xué)（immunocytochemistryorimmunohistochemistry,ICCorIHC)1）ELISA是酶免疫測(cè)定中應(yīng)用最廣的技術(shù)，用于測(cè)定可溶性抗原或抗體。優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性強(qiáng)，可自動(dòng)化檢測(cè)，從而被廣泛用于檢測(cè)多種病原體抗原或抗體、血液及其他體液中微量蛋白成分、細(xì)胞因子等。雙抗體夾心法：用于檢測(cè)特異性抗原。該試驗(yàn)所用的包被抗體與酶標(biāo)抗體應(yīng)分別針對(duì)不同抗原決定基，或其中之一用多克隆抗體，且相互間應(yīng)無(wú)交叉反應(yīng)。間接法：用于檢測(cè)特異性抗體。用已知抗原包被固相，加入待檢血清標(biāo)本，再加酶標(biāo)記的二抗，加底物觀察顯色反應(yīng)。ELISA分類(lèi)應(yīng)用酶標(biāo)記的抗體與組織或細(xì)胞抗原發(fā)生反應(yīng)，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，對(duì)組織或細(xì)胞表面抗原進(jìn)行定性、定量、定位。2）免疫細(xì)胞或免疫組化技術(shù)ICCIHC乃用放射性核素標(biāo)記抗原或抗體進(jìn)行免疫學(xué)檢測(cè)。該法兼有放射性核素的高靈敏度和抗原-抗體反應(yīng)的特異性，檢測(cè)靈敏度達(dá)pg水平。常用于標(biāo)記的放射性核素為125I和131I，分為液相和固相兩種方法。該法常用于測(cè)定微量物質(zhì)，如胰島素、生長(zhǎng)激素、甲狀腺素、孕酮等激素，嗎啡、地高辛、IgE等。3．放射免疫測(cè)定法(radioimmunoassay,RIA)４．化學(xué)發(fā)光免疫分析將發(fā)光物質(zhì)（如吖啶酯、魯米諾等）標(biāo)記抗原或抗體，發(fā)光物質(zhì)在反應(yīng)劑（如過(guò)氧化陰離子）激發(fā)下發(fā)射光子，通過(guò)自動(dòng)發(fā)光分析儀測(cè)定光子產(chǎn)量，可反映待檢樣品中抗體或抗原含量。該法靈敏度高，常用于檢測(cè)血清超微量活性物質(zhì)（甲狀腺素等激素）。

該法又稱(chēng)Western印跡法，其結(jié)合凝膠電泳與固相免疫技術(shù)，將借助電泳所區(qū)分的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至固相載體，再應(yīng)用酶免疫、放射免疫等技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。該法能對(duì)分子大小不同的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離并確定其分子量，常用于檢測(cè)多種病毒抗體或抗原。５．免疫印跡法(immunoblotting)免疫印跡法示意圖原理：病毒、細(xì)菌、毒素與相應(yīng)抗體特異結(jié)合后，喪失生物活性。用途：1.用已知血清鑒定病毒、細(xì)菌、毒素、獸藥殘留等。2.用已知病毒、細(xì)菌檢測(cè)血清抗體——測(cè)定抗體免疫血清效價(jià)（中和價(jià)）。中和試驗(yàn)（病毒、毒素）二、免疫細(xì)胞的檢測(cè)

檢測(cè)各群體淋巴細(xì)胞的數(shù)量與功能是觀察機(jī)體免疫狀態(tài)的重要手段。外周血是病人主要的檢測(cè)標(biāo)本，但僅代表再循環(huán)的淋巴細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物還可取胸腺、脾、淋巴結(jié)等作為標(biāo)本進(jìn)行檢查。（一）淋巴細(xì)胞及亞群的分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的分離：葡聚糖－泛影葡胺（即淋巴細(xì)胞分離液）密度梯度離心法包含淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞樹(shù)突狀細(xì)胞和其它少量細(xì)胞（造血干細(xì)胞等）。

密度梯度離心法原理：外周血各種血細(xì)胞的密度不盡相同，利用淋巴細(xì)胞分層液（Ficoll）作密度梯度離心，使一定比重的細(xì)胞群按相應(yīng)密度梯度分布，從而將各種血細(xì)胞加以分離。為此利用一種密度介于1.075～1.092之間而近于等滲的溶液（分層液）做密度梯度離心，使一定密度的細(xì)胞按相應(yīng)密度梯度分布，從而將各種血細(xì)胞加以分離。常用的分層液有Ficoll和Percoll兩種。(1)抗凝靜脈血(2)加等量NS(4)密度梯度離心血漿分離液RBCPBMCPMN(3)混勻后，緩慢加于分離液上外周血紅細(xì)胞粒細(xì)胞單個(gè)核細(xì)胞血小板淋巴細(xì)胞單核細(xì)胞1.0931.030~1.0351.075~1.090Ficoll：1.077±0.001

1.092密度分類(lèi)（PBMC）淋巴細(xì)胞亞群的分離

淋巴細(xì)胞為不均一的群體，可借助其表面標(biāo)志及功能差異而分為不同的群和亞群。

1．尼龍棉分離法

2．E花環(huán)分離法

3．洗淘法

4．流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry，F(xiàn)CM)

5．磁珠分離技術(shù)(1)E花環(huán)分離法原理：人類(lèi)T細(xì)胞表面上有能與綿羊紅細(xì)胞相結(jié)合的受體（E受體，CD2）,能與經(jīng)溴化二氨基異硫基異硫脲氰化物（AET）處理的綿羊紅細(xì)胞結(jié)合，形成穩(wěn)定的、細(xì)胞體積和比重較大的E花環(huán)。方法：淋巴細(xì)胞+SRBC懸液→加入分層液→T細(xì)胞形成E花環(huán)而沉于管底→懸液中為B細(xì)胞。E花環(huán)E花環(huán)實(shí)驗(yàn)（2）尼龍纖維分離法原理：B細(xì)胞在37℃時(shí)易粘附于尼龍棉（聚酰胺）纖維上，而T細(xì)胞不具此能力。方法：淋巴細(xì)胞→通過(guò)聚酰胺纖維管→洗脫下來(lái)的是T細(xì)胞。（3）流式細(xì)胞術(shù)又叫熒光激活細(xì)胞分離儀(nuorescenceactivatedcellsorter,FACS)法

原理：

細(xì)胞經(jīng)熒光染色后，通過(guò)高速流動(dòng)系統(tǒng)，細(xì)胞排成單行，逐個(gè)流經(jīng)檢測(cè)區(qū)進(jìn)行測(cè)定。當(dāng)細(xì)胞從流動(dòng)室噴嘴處流出時(shí)，超聲振蕩動(dòng)液流，使液流斷裂成一連串的均勻小滴(4000個(gè)/s)，每小滴內(nèi)最多含一個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞經(jīng)激光束照射產(chǎn)生熒光和散射光，由光電倍增管接收，轉(zhuǎn)換成脈沖信號(hào)，數(shù)據(jù)經(jīng)電腦處理，分辨細(xì)胞的類(lèi)型。

激發(fā)系統(tǒng)細(xì)胞分選系統(tǒng)熒光激活細(xì)胞分離儀分離法

檢測(cè)與訊號(hào)處理系統(tǒng)細(xì)胞流動(dòng)系統(tǒng)及氣壓流速控制系統(tǒng)流式細(xì)胞分析儀通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)：檢測(cè)T細(xì)胞總數(shù):抗CD3檢測(cè)CD4+/CD8+T細(xì)胞:抗CD4/CD8檢測(cè)B細(xì)胞:抗SmIg（4）磁珠分離術(shù)

磁珠分離術(shù)是將磁性材料顆粒表面進(jìn)行外理，微球的核心為小金屬顆粒，核心處包裹高分子材料（聚苯乙烯），可結(jié)合不同的生物大分子物質(zhì)（抗原、抗體、核酸等），若微球表面包被有免疫物質(zhì)則稱(chēng)為免疫磁珠，其兼有免疫配基的性質(zhì)和磁響應(yīng)性質(zhì)，即在磁場(chǎng)中顯示磁性，移出磁場(chǎng)時(shí)磁性消除。

目前商品出售的磁珠有直徑為1～5um等不同的規(guī)格，表面活性基團(tuán)有氨基（－NH2）、羧基（－COOH）和羥基（－OH）等。

包被的免疫物質(zhì)有：一抗、二抗等。方法：

將包被有關(guān)抗體的磁珠與待分離細(xì)胞充分作用，這樣借助于抗體磁珠，將與相應(yīng)的細(xì)胞結(jié)合成：細(xì)胞－抗體－磁珠復(fù)合物，該細(xì)胞在磁場(chǎng)中運(yùn)動(dòng)與其他細(xì)胞產(chǎn)生明顯差別。

如采用層析的方法，將層析柱放于強(qiáng)磁場(chǎng)中，與磁珠結(jié)合的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)將受限，而未與磁珠結(jié)合的細(xì)胞將先被洗脫下出來(lái)。

再將該柱移出磁場(chǎng)，與磁珠結(jié)合的細(xì)胞也將被洗脫下來(lái)，達(dá)到分離目的。單克隆抗體CD3羊抗鼠修飾磁球Biomag抗CD3磁球磁球結(jié)合T細(xì)胞加入B和T細(xì)胞中負(fù)向選擇正向選擇磁架進(jìn)行分離直接法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分類(lèi)間接法對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行分離免疫磁珠法細(xì)胞分選過(guò)程免疫磁珠細(xì)胞分選裝置（5）親和板結(jié)合分離法原理：各種淋巴細(xì)胞亞群具有不同的抗性。①分離CD4+或CD8+細(xì)胞，可用抗CD4或CD8單克隆抗體吸附。②分離B細(xì)胞用抗Ig抗體。③分離有C3受體的細(xì)胞用活化的C3包被。將相應(yīng)抗體結(jié)合于塑料平板上抗原陽(yáng)性的細(xì)胞與相應(yīng)抗體結(jié)合二、免疫細(xì)胞功能的測(cè)定

（一）T細(xì)胞功能測(cè)定：1.細(xì)胞增殖(轉(zhuǎn)化)試驗(yàn)：

可分為非特異性絲裂原和特異性抗原兩類(lèi)。*絲裂原主要有PHA、ConA和PWM；*抗原刺激物有破傷風(fēng)類(lèi)毒素、PPD和白色念珠菌等；淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)（形態(tài)學(xué)示意圖）原理：人T細(xì)胞表面有PHA或ConA受體，T細(xì)胞在體外受PHA或ConA的刺激后能轉(zhuǎn)化為體積較大、代謝旺盛、且能進(jìn)行分裂的淋巴細(xì)胞，以此測(cè)定T細(xì)胞的功能。

PHA刺激48-72小時(shí)淋巴細(xì)胞增殖—3H-TdR摻入法原理：將單個(gè)核細(xì)胞中加入PHA共同培養(yǎng)，在終止培養(yǎng)前8~15小時(shí)加入氚標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷（3H-TdR),經(jīng)β-液體閃爍儀檢測(cè)淋巴細(xì)胞DNA的3H-TdR摻入量，推測(cè)淋巴細(xì)胞增殖的程度。MTT(四甲基偶氮唑鹽）法原理：在細(xì)胞培養(yǎng)終止前數(shù)小時(shí)加入MTT，活細(xì)胞內(nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶分解MTT產(chǎn)生藍(lán)色甲攢（Formazan)沉積于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞周?chē)纬杉讛€的量與細(xì)胞增殖程度成正相關(guān)。(2)T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)：CTLTc和NK對(duì)其靶細(xì)胞有直接的細(xì)胞毒作用。方法：51Cr(鉻)釋放法乳酸脫氫酶釋放法凋亡細(xì)胞檢測(cè)法

(1)B細(xì)胞增殖(轉(zhuǎn)化)試驗(yàn)

(2)溶血空斑形成試驗(yàn)(3)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(ELISPOT):

（二）B細(xì)胞功能測(cè)定1.B細(xì)胞增殖試驗(yàn)

B細(xì)胞受有絲分裂原刺激后分裂增殖，溫育一定時(shí)間后檢查抗體形成細(xì)胞的數(shù)目。小鼠B細(xì)胞可用細(xì)菌脂多糖為刺激物，人B細(xì)胞則用