色譜、質(zhì)譜、聯(lián)用

液相色譜、質(zhì)譜、聯(lián)用儀的發(fā)展及應(yīng)用主要內(nèi)容色譜法的發(fā)展質(zhì)譜法的發(fā)展液相色譜法及液質(zhì)聯(lián)用化學(xué)學(xué)科合成化學(xué)分析化學(xué)理論與計算化學(xué)儀器分析現(xiàn)代分離方法電化學(xué)分析光譜分析CE(毛細管電泳分離）LCGC經(jīng)典色譜法Chromatography1905年俄國植物學(xué)家M.G.茨維特柱色譜紙色譜薄層色譜一、色譜法的發(fā)展MichaelTswett(1872-1919),aRussianbotanist,discoveredthebasicprinciplesofcolumnchromatography.Heseparatedplantpigmentsbyelutingamixtureofthepigmentsonacolumnofcalciumcarbonate.Thevariouspigmentsseparatedintocoloredbands;hencethenamechromatography.

石油醚現(xiàn)代色譜法1952年氣相色譜分析法NationalInstituteforMedicalResearchLondon,UnitedKingdomMartinAJPRowettResearchInstitute

Bucksburn(Scotland),UnitedKingdomSyngeRLM色譜法的發(fā)展歷史年代發(fā)明者發(fā)明的色譜方法或重要應(yīng)用1906Tswett用碳酸鈣作吸附劑分離植物色素。最先提出色譜概念1931Kuhn,Lederer用氧化鋁和碳酸鈣分離a-、b-和g-胡蘿卜素1938Izmailov,Shraiber最先使用薄層色譜法1938Taylor,Uray用離子交換色譜法分離了鋰和鉀的同位素1941Martin,Synge提出色譜塔板理論；發(fā)明液-液分配色譜；預(yù)言了氣體可作為流動相（即氣相色譜）1944Consden等發(fā)明了紙色譜1949Macllean氧化鋁中加淀粉黏合劑制作薄層板使薄層色譜進入實用階段1952Martin,James從理論和實踐方面完善了氣-液分配色譜法1956VanDeemter等提出色譜速率理論，并應(yīng)用于氣相色譜1957

基于離子交換色譜的氨基酸分析專用儀器問世1958Golay發(fā)明毛細管柱氣相色譜1959Porath,Flodin發(fā)表凝膠過濾色譜的報告1964Moore發(fā)明凝膠滲透色譜1965Giddings發(fā)展了色譜理論，為色譜學(xué)的發(fā)展奠定了理論基礎(chǔ)1975Small發(fā)明了以離子交換劑為固定相、強電解質(zhì)為流動相，采用抑制型電導(dǎo)檢測的新型離子色譜法1981Jorgenson等創(chuàng)立了毛細管電泳法色譜法起過關(guān)鍵作用的諾貝爾獎研究工作年代獲獎學(xué)科獲獎研究工作1937化學(xué)類胡蘿卜素化學(xué)，維生素A和B1938化學(xué)類胡蘿卜素化學(xué)1939化學(xué)聚甲烯和高萜烯化學(xué)1950生理學(xué)、醫(yī)學(xué)性激素化學(xué)及其分離、腎皮素化學(xué)及其分離1951化學(xué)超鈾元素的發(fā)現(xiàn)1955化學(xué)腦下腺激素的研究和第一次合成聚肽激素1958化學(xué)胰島素的結(jié)構(gòu)1961化學(xué)光合作用時發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)的確認1970生理學(xué)、醫(yī)學(xué)關(guān)于神經(jīng)元觸處遷移物質(zhì)的研究1970化學(xué)糖核苷酸的發(fā)現(xiàn)及其在生物合成碳水化合物中的作用1972化學(xué)核糖核酸化學(xué)酶結(jié)構(gòu)的研究1972生理學(xué)、醫(yī)學(xué)抗體結(jié)構(gòu)的研究色譜法分類按固定相的形態(tài)分類柱色譜：填充柱、整體柱、毛細管或開管柱平面色譜：薄層色譜和紙色譜按色譜動力學(xué)過程分類淋洗色譜法置換色譜法:一種非線性色譜技術(shù)，是指樣品輸入色譜柱后，用一種與固定相作用力極強的置換劑通入色譜柱，去替代結(jié)合在固定相表面的溶質(zhì)分子。樣品在置換劑的推動下沿色譜柱前進，使樣品中各組分按作用力強弱的次序，形成一系列前后相鄰的譜帶，并在置換劑的推動下流出色譜柱。迎頭色譜法:將試樣連續(xù)地通過色譜柱，吸附或溶解最弱的組分，首先以純物質(zhì)狀態(tài)流出色譜柱，然后順次流出的是次弱組分和第一流出組分的混合物，依次類推，從而實現(xiàn)混合物分離的色譜法。按兩相的物理形態(tài)、分離機理等分類色譜法分類色譜法特點及與其它分離分析方法比較分離效率高；分析速度快；檢測靈敏度高；樣品用量少；選擇性好；多組分同時分析；易于自動化；定性能力較差。色譜法的優(yōu)缺點：與化學(xué)分析比較（1）不受化學(xué)性質(zhì)限制，是一種分離分析方法。（2）化學(xué)分析本身不具備分離功能。（3）化學(xué)分析一般不適用于分析多組分的混合物。（4）化學(xué)分析定量方法簡易；色譜法定量測定較復(fù)雜。

色譜法特點及與其他分離分析方法比較（1）色譜、精餾與萃?。浩胶夥蛛x方法。（2）色譜法與精餾、萃取比較：速度快、效率、選擇性高。（3）精餾不能分離沸點相同的組分，萃取不能分離在溶劑中溶解度相同的組分；色譜法可分離沸點、溶解度相同的組分，可分離物理、化學(xué)性質(zhì)相近、其他分離方法不能或難以分離的組分。

（4）色譜法每次處理樣品量少。與精餾、萃取比較與光譜、質(zhì)譜方法比較（1）光譜、質(zhì)譜用于物質(zhì)定性鑒定，色譜法定性功能差。（2）色譜法最主要特點是適于多組分復(fù)雜混合物分離分析。（3）色譜儀價格比分子光譜、質(zhì)譜儀低得多，適用范圍廣。（4）色譜檢測器比分子光譜法靈敏度更高，比質(zhì)譜靈敏度低。

現(xiàn)代分離方法兩重含義樣品前處理方法：各種提取、分離技術(shù)

液液提取LLE、液相微萃取LLME

固相萃取SPE、固相微萃取SPME

微波輔助溶劑提取、加速溶劑提取超聲輔助溶劑提取……現(xiàn)代分離分析方法:

氣相色譜GC、高效液相色譜H(U)PLC、毛細管電泳CE、超臨界流體色譜SFC……復(fù)雜樣品分析思路獲取樣品中所有或大多數(shù)組分的信息

基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)、中藥分析等獲取樣品中一個或多個組分的信息

環(huán)境污染物分析、食品中農(nóng)藥獸藥分析、體液中藥物分析、材料分析等1918年J.J.Thomson發(fā)明了第一臺質(zhì)譜；1966年Munson和Field提出了CI電離技術(shù)；1981年出現(xiàn)了快原子轟擊（FAB）電離技術(shù)；隨后出現(xiàn)了各種軟電離技術(shù)：如基質(zhì)輔助激光解吸電離源（MALDI）；電噴霧電離源（ESI）；大氣壓化學(xué)電離源（APCI）；感應(yīng)耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS）；富立葉變換質(zhì)譜儀（FT-ICRMS）；

……

二、質(zhì)譜法的發(fā)展質(zhì)譜原理質(zhì)譜分析是先將物質(zhì)離子化，按離子的質(zhì)荷比分離，然后測量各種離子譜峰的強度而實現(xiàn)分析目的的一種分析方法。以檢測器檢測到的離子信號強度為縱坐標，離子質(zhì)荷比為橫坐標所作的條狀圖就是我們常見的質(zhì)譜圖。1.唯一可以確定分子量的方法，特別是現(xiàn)代生物質(zhì)譜適用于生物大分子分子量（數(shù)十萬）定；2.極高靈敏度，檢測限達10-14g；質(zhì)譜法特點常見術(shù)語:質(zhì)荷比:

離子質(zhì)量(以相對原子量單位計)與它所帶電荷(以電子電量為單位計)的比值,寫作m/Z.峰:

質(zhì)譜圖中的離子信號通常稱為離子峰或簡稱峰.離子豐度:

檢測器檢測到的離子信號強度.基峰:

在質(zhì)譜圖中，指定質(zhì)荷比范圍內(nèi)強度最大的離子峰稱作基峰.總離子流圖:在選定的質(zhì)量范圍內(nèi)，所有離子強度的總和對時間或掃描次數(shù)所作的圖,也稱TIC圖。質(zhì)量色譜圖指定某一質(zhì)量(或質(zhì)荷比)的離子其強度對時間所作的圖.利用質(zhì)量色譜圖來確定特征離子，在復(fù)雜混合物分析及痕量分析時是LC/MS測定中最有用的方式。當樣品濃度很低時LC/MS的TIC上往往看不到峰，此時，根據(jù)得到的分子量信息，輸入M+1或M+23等數(shù)值，觀察提取離子的質(zhì)量色譜圖，檢驗直接進樣得到的信息是否在LC/MS上都能反映出來，確定LC條件是否合適。準分子離子:指與分子存在簡單關(guān)系的離子，通過它可以確定分子量，液質(zhì)中最常見的準分子離子峰是[M+H]+或[M-H]-

。在ESI中,往往生成質(zhì)量大于分子量的離子如M+1,M+23,M+39,M+18......稱準分子離子,表示為:[M+H]+,[M+Na]+等碎片離子：準分子離子經(jīng)過一級或多級裂解生成的產(chǎn)物離子。碎片峰的數(shù)目及其豐度則與分子結(jié)構(gòu)有關(guān)，數(shù)目多表示該分子較容易斷裂，豐度高的碎片峰表示該離子較穩(wěn)定,也表示分子比較容易斷裂生成該離子。Ephedrine,MW=165多電荷離子：指帶有2個或更多電荷的離子,常見于蛋白質(zhì)或多肽等離子。有機質(zhì)譜中,單電荷離子是絕大多數(shù),只有那些不容易碎裂的基團或分子結(jié)構(gòu)-如共軛體系結(jié)構(gòu)-才會形成多電荷離子。它的存在說明樣品是較穩(wěn)定的。采用電噴霧的離子化技術(shù),

可產(chǎn)生帶很多電荷的離子,最后經(jīng)計算機自動換算成單質(zhì)/荷比離子。同位素離子由元素的同位素構(gòu)成的離子稱為同位素離子。各種元素的同位素,基本上按照其在自然界的豐度比出現(xiàn)在質(zhì)譜中,這對于利用質(zhì)譜確定化合物及碎片的元素組成有很大方便,還可利用穩(wěn)定同位素合成標記化合物,如:氘等標記化合物,再用質(zhì)譜法檢出這些化合物,在質(zhì)譜圖外貌上無變化,只是質(zhì)量數(shù)的位移,從而說明化合物結(jié)構(gòu),反應(yīng)歷程等。MS電子轟擊（EI）磁分析器化學(xué)電離（CI）飛行時間分析器（TOF）大氣壓電離（API）ESI+APCI四極濾質(zhì)器

(QuadrupoleMassFilter)基質(zhì)輔助激光解析質(zhì)譜

（MALDI）離子阱檢測器快原子轟擊（FAB）離子回旋共振分析器

（ICR）按檢測器分類按離子源分類EI源應(yīng)用最為廣泛，特別是氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀中應(yīng)用最多的離子源，它主要用于揮發(fā)性樣品的電離。原理：由進樣系統(tǒng)進入的氣體樣品到達離子源，與燈絲發(fā)出的電子發(fā)生碰撞使樣品分子電離。1.

電子轟擊源

(electron-impactsources,EI)硬電離

一般有機化合物的電離電位為7～15eV，被具有電子能量70eV的加速電子轟擊后，除了失去或得到一個電子形成分子離子以外，處于激發(fā)態(tài)的分子離子進一步裂解形成碎片離子和游離基，也可能失去一個中性分子。即70eV能量時，得到豐富的指紋圖譜，靈敏度最大。適當降低電離能，可得到較強的分子離子信號，有助于確定分子量。EI電離：將具有一定能量的電子直接作用于樣品分子，使其電離，且效率高，有助于質(zhì)譜儀獲得高靈敏度和高分辨率。EI圖譜特征：燈絲電子束試樣高溫氣化EI離子源EI源：可變的離子化能量

(10~70eV)電子能量電子能量分子離子增加碎片離子增加標準質(zhì)譜圖基本都是采用EI源(70eV)獲得EI適用于Mr＜103的易揮發(fā)有機物EI優(yōu)點：靈敏度高，適用性強，圖譜重現(xiàn)性好，有標準圖譜對照。

缺陷：氣化時造成分子熱裂解，圖譜復(fù)雜，分子離子峰難尋找。（1）分子離子(Molecularion)EI源離子類型分子離子中性分子確定分子量和分子式（2）同位素離子(isotopicion)根據(jù)質(zhì)譜圖上同位素離子峰與分子離子峰的相對強度，可以推測化合物的分子式(Beynon表)。同位素離子峰鑒定分子中氯、溴、硫原子：

(a+b)nC6H13Br,Mr=164■含硫的樣品

32S:33S:34S=100:0.8:4.4（3）碎片離子(fragmention)1)

α斷裂帶有電荷的官能團與相連的α碳原子之間的斷裂斷裂方式均裂：X—Y=X·+Y·異裂：X—Y=X++Y-半異裂：X+?Y=X++Y·含飽和雜原子+CH3CH2—I·CH3CH2·+I+均裂異裂CH3CH2++I·α-C烯烴(烯丙斷裂)烷基苯(芐基斷裂)2)

β斷裂α碳原子和β碳原子之間的鍵的斷裂3)

σ斷裂較易發(fā)生（4）重排離子(rearrangemention)麥氏(Mclafferty)重排R1=H、R、OH、OR、NR2（5）亞穩(wěn)離子(metastableion):m*離子源內(nèi)亞穩(wěn)離子（m1速度，

m2質(zhì)量）m1m2m*m/z離子源后飛行中特點：強度低、寬、跨幾個質(zhì)量數(shù)，m/z非整數(shù)，易辨認用處：證明m1→m2裂解過程CI源原理：利用反應(yīng)氣體的離子和樣品分子發(fā)生分子-離子反應(yīng)而生成樣品分子離子。特點：譜圖簡單，最強峰為分子離子峰和準分子離子峰，碎片離子峰很少?？捎糜谪撾x子質(zhì)譜，多數(shù)有機化合物的負離子CI質(zhì)譜圖靈敏度要比其正離子的CI質(zhì)譜圖高2-3個數(shù)量級。不適合難揮發(fā)試樣。2.

化學(xué)電離源

(chemicalionizationsources,CI)軟電離CI電離規(guī)律：CI電離與樣品化合物類型及反應(yīng)氣體有關(guān)：（1）反應(yīng)氣體影響：甲烷：有[M+H]+、[M-H]-、[M+C2H5]+或[M+C3H5]+

異丁烷：有[M+H]+、[M+C4H9]+

氨：有[M+H]+、[M+NH4]+

（2）化合物結(jié)構(gòu)影響：電負性強的元素電子捕獲（或再分解）生成負離子：有

[M]-、[M-H]-及其分解離子。CI源會產(chǎn)生一些碎片離子，碎片會進一步離子-分子反應(yīng)CI源特點：解釋CI譜時，要綜合分析CI譜、EI譜和所用的反應(yīng)氣，推斷出準分子離子峰。優(yōu)點：圖譜簡單，易測得分子量（主要任務(wù)），正、負離子模式靈敏度相當。適用于易汽化的樣品。缺點：

不適于難揮發(fā)成分的分析，沒有標準譜庫。M=390COOC8H17COOC8H173.電噴霧電離源

(ElectrosprayIonizaton，

ESI)軟電離樣品從具有霧化氣套管的毛細管端流出時在電場和霧化氣的吹帶作用下噴成無數(shù)的帶電微液滴，一定溫度下，液滴中的溶劑快速蒸發(fā)，液滴直徑不斷變小，表面電荷密度不斷增大。最終使溶劑和樣品離子從液滴中被排擠出，樣品離子進入分析器被檢測。ESI源原理：流出液在高電場下形成帶電噴霧，在電場力作用下穿過氣簾；從而霧化、蒸發(fā)溶劑、阻止中性溶劑分子進入后端檢測。特點：1.是一種軟電離方式，適于分析極性強的有機化合物;2.容易形成多電荷離子，可以測量大分子量的蛋白質(zhì);3.主要應(yīng)用于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀。高電場強靜電場（3-5KV），形成高度荷電霧狀小液滴，經(jīng)過反復(fù)的溶劑揮發(fā)-液滴裂分后，產(chǎn)生單電荷或多電荷離子。ESI離子源ESI特點：最軟電離技術(shù)單電荷或多電荷離子

利于極性強、不穩(wěn)定的生物大分子的測定東莨菪堿ESIMS圖譜ESI源離子類型有機小分子（1000Da以下）：一級質(zhì)譜（MS）：單電荷準分子離子，很少碎片（1）分子離子峰：[M]+或[M]-（2）準分子離子峰（加合離子）：和溶液組成有關(guān)

[M+H]+、[M-H]-、[M+Na]+、[M+K]+、[M+NH4]+……

堿性化合物易生成質(zhì)子化的分子[M+H]+；酸性化合物，易生成去質(zhì)子化離子[M-H]-。

（3）聚合離子：[2M+H]+、[2M+Na]+、[2M-H]-、[3M+H]+……二級質(zhì)譜及多級質(zhì)譜（MS/MS）：

裂解規(guī)律同EI相似，但主要丟失為中性分子，很少丟失自由基。生物大分子：一級質(zhì)譜（MS）為多電荷多離子，計算擬合獲得分子量；二級質(zhì)譜及多級質(zhì)譜（MS/MS）產(chǎn)生特征碎片離子。圖1馬心肌紅蛋白的ESI質(zhì)譜圖圖2溶菌酶樣品的ESI質(zhì)譜圖4.大氣壓化學(xué)電離

(Atomsphericpressurechemistryionization,

APCI)

APCI結(jié)構(gòu)與電噴霧源大致相同，不同之處在于APCI噴咀的下游放置一個針狀放電電極，通過放電電極的高壓放電，使空氣中某些中性分子電離，產(chǎn)生H3O+，N2+，O2+和O+等離子，溶劑分子也會被電離，這些離子與分析物分子進行離子-分子反應(yīng)，使分析物分子離子化。特點：屬于“軟”電離方式，適于分子質(zhì)量數(shù)小于2000u的弱極性小分子化合物。只產(chǎn)生單電荷離子，主要是準分子離子，很少有碎片離子。主要應(yīng)用于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀。

APCI電離機理：質(zhì)子轉(zhuǎn)移和電荷交換產(chǎn)生正離子；質(zhì)子脫離和電子捕獲產(chǎn)生負離子等。APCI示意圖APCI應(yīng)用特點：（1）主要用來分析中等、弱極性小分子化合物。（2）有些分析物由于結(jié)構(gòu)和極性方面的原因，ESI不能產(chǎn)生足夠強的離子，可采用APCI方式增加離子產(chǎn)率，APCI是ESI的補充。（3）與CI不同，APCI無須加熱樣品使之汽化，因而應(yīng)用范圍更廣。APCI電離特征：

主要產(chǎn)生的是單電荷離子[M+H]+或[M-H]-，分析的化合物分子量一般小于1000Da，很少有碎片離子，主要是準分子離子。銀杏葉中聚戊烯醇化合物APCI-MS[M-CH2OH]ˉ5.基質(zhì)輔助激光解析質(zhì)譜

（Matrix-assistedLaserDesorptionIonization，MALDI）

用小分子有機物作基質(zhì)，將樣品溶液和基質(zhì)混合均勻，干燥成為晶體或半晶體后送入離子源內(nèi)。用一定波長的脈沖式激光照射，基質(zhì)分子能有效地吸收激光能量，瞬間由固態(tài)轉(zhuǎn)化為氣態(tài)，基質(zhì)離子與樣品相互碰撞使樣品離子化，而得以進行質(zhì)譜分析。MALDI示意圖MALDI源原理：待測物質(zhì)的溶液與基質(zhì)的溶液混合后蒸發(fā)，使分析物與基質(zhì)成為晶體或半晶體，用一定波長的脈沖式激光進行照射時，基質(zhì)分子能有效的吸收激光的能量，使基質(zhì)分子和樣品分子進入氣相并得到電離MALDI適用于生物大分子，如多肽，核酸類化合物?？傻玫綔史肿与x子峰，碎片離子和多電荷離子較少。常用基質(zhì)：2,5-二羥基苯甲酸、芥子酸、煙酸、2-氰基4-羥基肉桂酸等MALDI特點：

準分子離子峰很強，碎片離子峰很少，能直接測定難于電離的樣品，特別是生物大分子物質(zhì)如多肽、核酸、蛋白等。

適于結(jié)構(gòu)復(fù)雜、不易氣化的大分子，并引入輔助基質(zhì)減少過分碎裂。一般采用固體基質(zhì)，基質(zhì)樣品比為10000/1。根據(jù)分析目的不同使用不同的基質(zhì)和波長。6.快原子轟擊（fastatombombardment,FAB）FAB電離原理：樣品溶液與甘油、硫代甘油、3-硝基芐醇等高沸點的溶劑混合滴加于樣品靶上。由銫槍（或Ar、Xe）產(chǎn)生的高能快原子轟擊到樣品靶上時，部分能量導(dǎo)致樣品氣化和電離。生成的離子束由一加速電壓（數(shù)kV）引出，進入質(zhì)量分析器，按不同的質(zhì)荷比（m/z）被分開，并檢測器檢出。FAB電離特點：（1）準分子離子為主，少許碎片離子；（2）常見的離子有[M+H]+、[M-H]-；（3）加合離子有[M+Na]+、[M+K]+，樣品滴在Ag靶上時，會出現(xiàn)[M+Ag]+，用甘油作為基質(zhì)，生成的離子中還會有樣品分子和甘油生成的加合離子。（4）既可以得到正離子，也可以得到負離子。（5）在基質(zhì)中加入不同的添加劑，會影響離子的強度。加入乙酸，三氟乙酸等會使正離子增強，加入NH4OH會使負離子增強。FAB應(yīng)用特點：

FAB是一種軟電離技術(shù)，被分析樣品不須經(jīng)過氣化而直接電離，故常用于分析極性強、不易氣化和熱穩(wěn)定性差的樣品，如氨基酸、多肽、糖類、維生素、抗菌素等。苯芴醇FAB-MS分子式：C30H32Cl3NO

分子量：528.94

質(zhì)譜法的應(yīng)用定性分析標準譜圖檢索定性：EI(70eV)標準譜庫：書庫、數(shù)據(jù)庫、網(wǎng)絡(luò)檢索相對分子質(zhì)量測定：根據(jù)電離方式、測試條件和化合物分子結(jié)構(gòu)特點，獲得分子量未知化合物的結(jié)構(gòu)分析分子量的確定：分子離子峰的識別分子式的確定：高分辨質(zhì)譜法和同位素豐度法

分子結(jié)構(gòu)的確定：計算不飽和度，特征離子和特征碎片丟失定量分析質(zhì)譜直接定量分析：應(yīng)用少復(fù)雜混合物定量分析：GC-MS、LC-MS、CE-MS…….1、高效液相色譜法（HPLC）高壓泵流動相溶劑廢液色譜柱檢測器WatersUPLC超高效液相色譜儀經(jīng)典LCHPLC固定相粒徑流動相驅(qū)動方式流動相流速150-200μm重力或低壓泵很慢3-10μm高壓泵快(1～10mL/min)20世紀60年代末70年代初發(fā)展起來三、液相色譜法及液質(zhì)聯(lián)用基本理論塔板理論速率理論A渦流擴散項B/u分子擴散項（忽略）Cu傳質(zhì)阻力項分離模式吸附色譜法（液固吸附色譜LSC）分配色譜法（液-液分配色譜LLC+鍵合相色譜）離子交換色譜法（IEC）化學(xué)鍵合相色譜尺寸排阻（凝膠）色譜法SEC、GPC親和色譜HPLC特點高效液相色譜法的優(yōu)點（與經(jīng)典液相色譜法與氣相色譜法比較）

（1）分離效能高

（2）選擇性高

（3）檢測靈敏度高

（4）分析速度快（5）應(yīng)用廣泛，適于沸點高、熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)（占70-80%），特別是蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、多糖類、植物色素、高聚物、染料及藥物等物質(zhì)的分離和分析。Highperformanceliquidchromatography,

HPLC方法特點（1）分離分析同時完成：融分離和檢測于一體，可以實現(xiàn)復(fù)雜混合物的多組分同時分析。（2）多種檢測器，適用對象廣：

紫外UV、二極管陣列PAD、熒光、化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)、質(zhì)譜MS等。（3）儀器聯(lián)用，多重信息，定性能力強：LC-MS(NMR、IR…)

保留時間定性、光譜定性、質(zhì)譜及串聯(lián)質(zhì)譜定性等。（4）儀器聯(lián)用，靈敏度高，專屬性好：強大的分離功能和質(zhì)譜的高靈敏度、高專屬性。（5）分離模式多，適用范圍廣：生物、藥物、食品、環(huán)境、材料、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)等。①根據(jù)被分析樣品的特性選擇適用于樣品分析的一種高效液相色譜分析方法。②選擇一根適用的色譜柱，確定柱的規(guī)格（柱內(nèi)徑及柱長）和選用固定相（粒徑及孔徑）。③選擇適當?shù)幕騼?yōu)化的分離操作條件，確定流動相的組成、流速及洗脫方式。④由獲得的色譜圖進行定性分析和定量分析。建立HPLC分析方法的步驟分析方法定性分析對照定性：純物質(zhì)色譜保留對照定性經(jīng)驗規(guī)律和文獻值定性聯(lián)機定性定量分析歸一化法外標法(校準曲線法)內(nèi)標法主要應(yīng)用定性分析已知化合物鑒定：合成產(chǎn)物、天然化合物成分分析質(zhì)量標準：中藥、食品標準指紋圖譜定量分析復(fù)雜樣品目標化合物定量分析：眾多國家和國際標準方法，如食品、藥品、環(huán)境、衛(wèi)生、工業(yè)等理論研究化學(xué)平衡性質(zhì)：保留時間→溶解熱、熵變及焓變動力學(xué)過程：峰擴寬程度→擴散系數(shù)、反應(yīng)速率常數(shù)物化性質(zhì)：保留體積或峰面積→相對分子質(zhì)量、表面積、孔率分布及液膜厚度LC-MS（MSn）特點靈敏度高選擇性好專屬性好快速SIM、SRM等測試模式靈活多樣MSn豐富的分子結(jié)構(gòu)信息，無對照品，也能定性分析圖譜直觀樣品前處理簡單多組分同時定性或定量測定多電荷離子的產(chǎn)生適合于分析大分子…2、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

（liquidchromatography-massspectrometry,LC-MS）色譜質(zhì)譜聯(lián)用的接口接口:是將色譜儀與質(zhì)譜儀直接聯(lián)接起來的裝置。作用：將通過色譜儀分離開的各種組分逐一送入質(zhì)譜儀進行分析。接口要協(xié)調(diào)前后兩種儀器的輸出和輸入間的矛盾。將兩種儀器的分析方法結(jié)合起來，協(xié)同作用，取長補短，獲得單獨使用時所不具備的功能。因此，接口是色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)中的關(guān)鍵裝置。色譜質(zhì)譜聯(lián)用的分類氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用：開發(fā)最早的色譜聯(lián)用儀器，適宜分析小分子、易揮發(fā)、熱穩(wěn)定、能氣化的化合物。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用：液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的接口問題得到解決，近年有了飛速發(fā)展。適宜分析大分子（包括蛋白，多肽多聚物等）、不揮發(fā)。熱不穩(wěn)定、極性的化合物。毛細管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用：近年發(fā)展迅速，特別對生物大分子的分類分析十分有用。液質(zhì)聯(lián)用與氣質(zhì)聯(lián)用的區(qū)別:

氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC-MS)是最早商品化的聯(lián)用儀器，適宜分析小分子、易揮發(fā)、熱穩(wěn)定、能氣化的化合物；用電子轟擊方式（EI）得到的譜圖，可與標準譜庫對比。

液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)主要可解決如下幾方面的問題：不揮發(fā)性化合物分析測定；極性化合物的分析測定；熱不穩(wěn)定化合物的分析測定；大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析測定；沒有商品化的譜庫可對比查詢，只能自己建庫或自己解析譜圖。

現(xiàn)代有機和生物質(zhì)譜進展

在20世紀80及90年代，質(zhì)譜法經(jīng)歷了兩次飛躍。在此之前，質(zhì)譜法通常只能測定分子量500以下的小分子化合物。20世紀70年代，出現(xiàn)了場解吸（FD）離子化技術(shù)，能夠測定分子量高達1500~2000的非揮發(fā)性化合物，但重復(fù)性差。20世紀80年代初發(fā)明了快原子質(zhì)譜法（FAB-MS），能夠分析分子量達數(shù)千的多肽。隨著生命科學(xué)的發(fā)展，欲分析的樣品更加復(fù)雜，分子量范圍也更大，因此，電噴霧離子化質(zhì)譜法（ESI-MS）和基質(zhì)輔助激光解吸離子化質(zhì)譜法（MALDI-MS）應(yīng)運而生。儀器硬件概覽儀器結(jié)構(gòu)典型的配置圖2.質(zhì)譜儀質(zhì)譜儀包括真空系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、離子源、質(zhì)量分析器、檢測器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。2.1真空系統(tǒng)

質(zhì)譜儀的離子源、質(zhì)量分析器和檢測器必須在高真空狀態(tài)下工作，以減少本底的干擾，避免發(fā)生不必要的離子-分子反應(yīng)。所以質(zhì)譜反應(yīng)屬于單分子分解反應(yīng)。利用這個特點，我們用液質(zhì)聯(lián)用的軟電離方式可以得到化合物的準分子離子，從而得到分子量。由機械真空泵(前極低真空泵)，擴散泵或分子泵(高真空泵)組成真空機組，抽取離子源和分析器部分的真空。只有在足夠高的真空下，離子才能從離子源到達接收器，真空度不夠則靈敏度低。2.2進樣系統(tǒng)進樣系統(tǒng)是將分析樣品引入到離子源的裝置。進樣方式：（1）.直接進樣（2）.儀器聯(lián)用的進樣（GC、LC、CE)色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的接口和色譜儀組成了質(zhì)譜的進樣系統(tǒng)。接口應(yīng)滿足：（1）.接口的存在既不破壞離子源的高真空，也不影響色譜柱的分離柱效；（2）.接口應(yīng)能使色譜分離后的各組分盡可能多的進入質(zhì)譜儀的離子源，同時使色譜流動相盡可能的不進入質(zhì)譜的離子源；（3）.接口的存在不改變色譜分離后各組分的組成和結(jié)構(gòu)。離子源將欲分析樣品的原子或分子電離，得到帶電離子，并對離子進行加速使其進入質(zhì)量分析器。根據(jù)電離方式的不同，常用的有：EI(ElectronImpactIonization):電子轟擊電離—硬電離。CI(ChemicalIonization):化學(xué)電離—核心是質(zhì)子轉(zhuǎn)移。FD(FieldDesorption):場解吸—目前基本被FAB取代。FAB(FastAtomBombardment):快原子轟擊—或者銫離子(LSIMS,液體二次離子質(zhì)譜)。

離子源ESI(ElectrosprayIonization):電噴霧電離—屬最軟的電離方式。適宜極性分子的分析，能分析小分子及大分子(如蛋白質(zhì)分子多肽等)

APCI(AtmosphericPressureChemicalIonization):大氣壓化學(xué)電離—同上，更適宜做弱極性小分子。APPI(AtmosphericPressurePhotoSprayIonization):大氣壓光噴霧電離—同上，更適宜做非極性分子。

MALDI(MatrixAssistedLaserDesorption):基體輔助激光解吸電離。通常用于飛行時間質(zhì)譜和FT-MS，特別適合蛋白質(zhì)，多肽等大分子。2.4質(zhì)量分析器質(zhì)量分析器是質(zhì)譜儀的核心，質(zhì)量分析器的作用是將離子源產(chǎn)生的離子按m/z順序進行分離并排列。常用的質(zhì)量分析器有：磁質(zhì)量分析器四級桿質(zhì)量分析器飛行時間質(zhì)量分析器離子阱質(zhì)量分析器2.5檢測器質(zhì)譜儀常用的檢測器有：直接電檢測器、電子倍增器、閃爍檢測器和微通道板等。電子倍增器運用質(zhì)量分析器出來的離子轟擊電子倍增管的陰極表面，使其發(fā)射出二次電子，再用二次電子依次轟擊一系列電極，使二次電子獲得不斷倍增，最后由陽極接受電子流，使離子束信號得到放大。

離子源：產(chǎn)生離子化，并將產(chǎn)生的離子在電場的作用下進去毛細管。3.系統(tǒng)結(jié)構(gòu)圖毛細管：離子導(dǎo)入通道，將離子源產(chǎn)生的離子傳輸進入質(zhì)譜。同時，隔離外部的常壓與質(zhì)譜內(nèi)部的高真空離子光學(xué)組件：包括Skimmer1，八級桿以及Lens1和Lens2.進一步除去溶劑和中性分子，高效的離子傳輸組件，并聚焦隨機運動的離子進去四級桿。離子束整形器：將隨機運動的離子壓縮為一個薄層，進入脈沖發(fā)生器。減少離子在縱向的擴散，提高分辨率。脈沖發(fā)生器：以一定的頻率在縱向施加高壓，將從離子束整形器過來的離子快速拋入飛行器。飛行器：離子在飛行管內(nèi)縱向飛行，不同質(zhì)荷比離子通過飛行管的時間不同。檢測器：包括微通板、閃爍器和光電倍增管。高增益、壽命長、線性范圍寬施加到離子的電勢能轉(zhuǎn)化為動能：zV=1/2mv2（1）

m：離子的質(zhì)量；z為離子所帶的電荷數(shù)目；

V為施加到離子的電勢，它對于所有質(zhì)量的離子是相同的；v為離子的飛行線速度，離子質(zhì)量越大，飛行速度就越慢。離子飛行的線速度v等于飛行距離L除以飛行時間t:v=L/t（2）

L為由儀器的飛行管所決定的常數(shù)聯(lián)立公式（1）和（2），得到zV=1/2m（L/t)2

因而離子質(zhì)荷比正比于飛行時間的平方m/z=2Vt2/L2基本原理1ESI源-大氣壓電噴霧離子源霧化器的噴霧針被帶了高電壓的半圓柱形電極環(huán)繞，帶有被測物質(zhì)離子的流動相，在霧化針尖端發(fā)生霧化。在半圓形電極和毛細管間的電壓不同，產(chǎn)生一個電場，使液滴表面富集帶同種電荷的離子，而內(nèi)部帶相反電荷聚集，形成帶電液滴細的噴霧，液滴在電場的作用下，飛向毛細管。加熱的氮氣干燥氣體反向流動，帶走液滴中的中性的溶劑分子，從而收縮液滴，直到排斥的靜電力超過液滴表面張力，從而庫倫爆炸。這個過程不斷重復(fù)，直到待分析物離子最終變成氣態(tài)進去毛細管。本院儀器離子源技術(shù)和原理ESI源

加熱的氮氣干燥氣毛細管入口霧化氣溶劑噴霧電噴霧離子-4000V氣簾霧化器組件（nebulizer）是同軸套管大氣壓電噴霧電離過程Coulomb爆炸++++++++++-----++++++++++-----++++++--++++++--溶劑蒸發(fā)++帶電液滴分析離子溶劑離子簇分析離子

Rayleigh極限2APCI源-大氣壓化學(xué)電離離子源APCI的電離是在常壓下的氣態(tài)化學(xué)電離（CI）過程，是ESI電離的一種有效的補充。溶劑或反應(yīng)氣在電暈針的作用下先帶電，再把電荷轉(zhuǎn)移到化合物形成離子。一般只產(chǎn)生單電荷離子，且需要在高溫的離子化環(huán)境下操作。屬于質(zhì)量-流量敏感型離子化技術(shù)，樣品分子量越大，性能越高。適合分析中等極性到弱極性的化合物。[Solvent+H]++ASolvent+[A+H]+霧化蒸發(fā)液滴氣相電離APCI大氣壓化學(xué)電離Vcap電暈電流霧化氣壓力Fragmentor干燥氣溫度和流速蒸發(fā)室溫度電荷轉(zhuǎn)移至分析物分子蒸汽通過電暈針放電形成帶電荷的反應(yīng)劑離子溶劑在蒸發(fā)器中蒸發(fā)+含有氣溶膠的分析物分析物離子+++++++++++++++++++++++++++流動相分析物溶劑--------->[溶劑+H]+[溶劑+H]++M--------->溶劑+[M+H]+APCI電離過程離子化氣相

CI質(zhì)子化（例如，H3O+

）（堿）電荷交換去質(zhì)子化（酸）電子捕獲（鹵素，芳族化合物）蒸發(fā)室溫度較高溫度利于去溶劑化和氣化樣品。太高溫度導(dǎo)致樣品分解。通常：與電噴霧相比，APCI對于流動相、流速或添加劑依賴性較小。注意溶劑的選擇。甲醇是比乙腈好的選擇，減小碳化。APCI

ESI離子在溶液中以已生成化合物無需具有揮發(fā)性是分析熱不穩(wěn)定化合物的首選除了生成單電荷離子之外還可以生成多電荷離子

APCI離子在氣態(tài)條件中生成化合物需具有一定的揮發(fā)性化合物必需是熱穩(wěn)定的只生成單電荷離子離子源的選擇

ESI

雜質(zhì)：造成目標離子的響應(yīng)下降表面活性劑與待測離子競爭（注意液相瓶、樣品瓶、無紡布的清洗）正離子模式下：避免：磷酸和磷酸鹽、硫酸鹽、硼酸鹽（由于會形成強離子對）三氟乙酸屬于能形成強離子對的化合物負離子模式下：堿金屬鹽也抑制離子的形成三乙胺質(zhì)子親合力強，應(yīng)避免存在三乙胺，用甲酸流動相至少沖一周以上參比電噴霧與大氣壓化學(xué)電離的比較

電離機理：電噴霧采用離子蒸發(fā)，而APCI電離是高壓放電發(fā)生了質(zhì)子轉(zhuǎn)移而生成[M＋H]+或[M-H]-離子。樣品流速：APCI源可從0.2到2ml／min；而電噴霧源允許流量相對較小,一般為0.2-1ml／min.斷裂程度:APCI源的探頭處于高溫，對熱不穩(wěn)定的化合物就足以使其分解.靈敏度：通常認為電噴霧有利于分析極性大的小分子和生物大分子及其它分子量大的化合物，而APCI更適合于分析極性較小的化合物。多電荷：APCI源不能生成一系列多電荷離子。LC-MS分析條件的選擇和優(yōu)化1.接口的選擇：

ESI適合于中等極性到強極性的化合物分子，特別是那些在溶液中能預(yù)先形成離子的化合物和可以獲得多個質(zhì)子的大分子（如蛋白質(zhì)）

APCI不適合可帶多個電荷的大分子，其優(yōu)勢在于弱極性或中等極性的小分子的分析。2正、負離子模式的選擇：選擇的一般原則為：正離子模式：適合于堿性樣品，可用乙酸或甲酸對樣品加以酸化。樣品中含有仲氨或叔氨時可優(yōu)先考慮使用正離子模式。負離子模式：適合于酸性樣品，可用氨水或三乙胺對樣品進行堿化。樣品中含有較多的強伏電性基團，如含氯、含溴和多個羥基時可嘗試使用負離子模式。一般的商品儀器中,ESI和APCI接口都有正負離子測定模式可供選擇。根據(jù)樣品的性質(zhì)選擇，也可兩種模式同時進行。正離子ES模式：適合于堿性樣品，amines,amides,aminoacids,antibiotics等有雜原子，可接受質(zhì)子。如NH2、N、NH、CO、COOR酸性流動相加揮發(fā)性酸：甲酸、乙酸加鹽：甲酸銨乙酸銨負離子ES模式：適合于酸性樣品，acids,hydroxyls,phosphates,sulfates；含強負電性基團有雜原子，可失去質(zhì)子。如COOH、OH

中性偏堿性流動相一般加氨水可正可負:比較靈敏度3流動相的選擇常用的流動相為甲醇、乙腈、水和它們不同比例的混合物以及一些易揮發(fā)鹽的緩沖液，如甲酸銨、乙酸銨等，還可以加入易揮發(fā)酸堿如甲酸、乙酸和氨水等調(diào)節(jié)pH值。LC／MS接口避免進入不揮發(fā)的緩沖液，避免含磷和氯的緩沖液，含鈉和鉀的成分必須＜lmmol/l。（鹽分太高會抑制離子源的信號和堵塞噴霧針及污染儀器）含甲酸（或乙酸）＜2％。含三氟乙酸≤0.5％。含三乙胺＜l％。含醋酸銨＜10一5mmol/l。送樣前一定要摸好LC條件，能夠基本分離，緩沖體系符合MS要求。4流量和色譜柱的選擇不加熱ESI的最佳流速是1—50ul／min，應(yīng)用4.6mm內(nèi)徑LC柱時要求柱后分流，目前大多采用l—2.1mm內(nèi)徑的微柱，TIS源最高允許lml／min，建議使用200—400ul／minAPCI的最佳流速～lml／min，常規(guī)的直徑4.6mm柱最合適。為了提高分析效率，常采用＜100mm的短柱（此時UV圖上并不能獲得完全分離，由于質(zhì)譜定量分析時使用MRM的功能，所以不要求各組分沒有完全分離）。這對于大批量定量分析可以節(jié)省大量的時間。5輔助氣體流量和溫度的選擇霧化氣對流出液形成噴霧有影響，干燥氣影響噴霧去溶劑效果。操作中溫度的選擇和優(yōu)化主要是指接口的干燥氣體而言，一般情況下選擇干燥氣溫度高于分析物的沸點20℃

左右即可。對熱不穩(wěn)定性化合物，要選用更低的溫度以避免顯著的分解。選用干燥氣溫度和流量大小時還要考慮流動相的組成，有機溶劑比例高時可采用適當?shù)偷臏囟群土髁啃∫稽c的。質(zhì)量分析器的分類：雙聚焦扇形磁場-電場串聯(lián)儀器(sector).四極質(zhì)譜儀(Q).飛行時間質(zhì)譜儀(TOF).離子阱質(zhì)譜儀（TRAP）付利葉變換-離子回旋共振質(zhì)譜儀(FT-ICRMS).┏四極+TOF（Q-TOF）串列式多級質(zhì)譜儀┫三重四極（QqQ）

(MS/MS) ┗TOF+TOF6.質(zhì)量分析器:是質(zhì)譜儀中將離子按質(zhì)荷比分開的部分,離子通過分析器后,按不同質(zhì)荷比(M/Z)分開,將相同的M/Z離子聚焦在一起,組成質(zhì)譜。如何看質(zhì)譜圖：1.基本信息(1)確定分子離子,即確定分子量氮規(guī)則：含偶數(shù)個氮原子的分子，其質(zhì)量數(shù)是偶數(shù)，含奇數(shù)個氮原子的分子，其質(zhì)量數(shù)是奇數(shù)。與高質(zhì)量碎片離子有合理的質(zhì)量差，凡質(zhì)量差在3~8和10~13，21~25之間均不可能，則說明是碎片或雜質(zhì)。(2)確定元素組成，即確定分子式或碎片化學(xué)式高分辨質(zhì)譜可以由分子量直接計算出化合物的元素組成從而推出分子式低分辨質(zhì)譜利用元素的同位素豐度，例:(3)峰強度與結(jié)構(gòu)的關(guān)系豐度大反映離子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定在元素周期表中自上而下，從右至左，雜原子外層未成鍵電子越易被電離，容納正電荷能力越強，含支鏈的地方易斷，這同有機化學(xué)基本一致，總是在分子最薄弱的地方斷裂。不同類型有機物有不同的裂解方式相同類型有機物有相同的裂解方式,只是質(zhì)量數(shù)的差異需要經(jīng)驗記憶。2.質(zhì)譜解析的一般步驟(適于低分辨小分子譜圖,若已經(jīng)是高分辨質(zhì)譜圖得到元素組成更好)(1)核對獲得的譜圖,扣除本底等因素引起的失真,考慮操作條件是否適當(2)綜合樣品其他知識：例如熔點，沸點，溶解性等理化性質(zhì)，樣品來源，光譜，波譜數(shù)據(jù)等.(3)盡可能判斷出分子離子。(4)假設(shè)和排列可能的結(jié)構(gòu)歸屬：高質(zhì)量離子所顯示的，在裂解中失去的中性碎片，如M-1，M-15，M-18，M-20，M-31......意味著失H，CH3，H2O，HF，OCH3......(5)假設(shè)一個分子結(jié)構(gòu)，與已知參考譜圖對照，或取類似的化合物，并作出它的質(zhì)譜進行對比。3.有機質(zhì)譜的特點優(yōu)點:(1)定分子量準確，其它技術(shù)無法比。(2)靈敏度高，常規(guī)10-7—10-8g,單離子檢測可達10-12g。(3)快速，幾分甚至幾秒。(4)便于混合物分析，LC/MS，MS/MS對于難分離的混合物特別有效,其它技術(shù)無法勝任。(5)多功能，廣泛適用于各類化合物。局限性:

(1)異構(gòu)體，立體化學(xué)方面區(qū)分能力差。(2)重復(fù)性稍差，要嚴格控制操作條件。所以不能象低場NMR，IR等自己動手，須專人操作。(3)有離子源產(chǎn)生的記憶效應(yīng)，污染等問題。(4)價格稍顯昂貴，操作有點復(fù)雜。具體應(yīng)用領(lǐng)域醫(yī)藥學(xué)：藥物代謝、藥物動力學(xué)、雜質(zhì)分析、天然產(chǎn)物分析生物化學(xué)：肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸、糖環(huán)境化學(xué)：農(nóng)藥和農(nóng)殘分析、有機污染物、土壤/食品/水分析臨床醫(yī)學(xué)：新生兒檢查、糖化血紅蛋白（糖尿?。?、血紅蛋白變異、膽酸食品科學(xué)：香料、添加物、包裝物、蛋白質(zhì)、致癌物法醫(yī)學(xué)：濫用藥物、爆炸物、興奮劑檢測獸醫(yī)學(xué)：興奮劑、磺胺類藥物、抗體合成化學(xué)：有機金屬化合物、有機合成物有機化學(xué)：表面活性劑、染料（1）藥物：藥物合成：反應(yīng)過程監(jiān)測、中間體、目標化合物及副反應(yīng)產(chǎn)物分析等。藥物篩選及極性優(yōu)化：藥物分