NY/T 548-2002豬傳染性胃腸炎診斷技術(shù)

TCs.11.220NY中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T548－2002豬傳染性胃腸炎診斷技術(shù)Diagnostictechniquesfortransmissiblegastroenteritis2002-08-27發(fā)布2002-12-01實(shí)施中華人民共和國農(nóng)業(yè)部發(fā)布

NY/T548-2002豬傳染性胃腸炎（transmissiblegastroenteritis.簡稱TCE)是由冠狀病毒屬中的豬傳染性胃腸炎病毒導(dǎo)致的高度傳染性豬胃腸道病。以嘔吐、水樣腹瀉為臨床特征，不同年齡的豬都易感，但一周齡以內(nèi)的仔豬死亡率可達(dá)100%，隨著年齡的增大，死亡率逐漸下降。大多數(shù)養(yǎng)豬國家都有本病發(fā)生，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織World（rganizationforAnimalHealth（英）,（fficeintentionaldesEpizootie（法)，（)IE]將TGE定為B類傳染病，是我國法定檢疫的疫病。本標(biāo)準(zhǔn)主要參考了世界動(dòng)物衛(wèi)生組織《診斷試驗(yàn)和疫苗標(biāo)準(zhǔn)子冊》2000)及國內(nèi)外發(fā)表的同類研究試驗(yàn)報(bào)告。本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A為規(guī)范性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由農(nóng)業(yè)部備牧獸醫(yī)局提出。本標(biāo)準(zhǔn)由全國動(dòng)物檢疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸I。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱料醫(yī)研究所本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：馬思奇、王明、馮力、修有恩

NY/T548—2002豬傳染性胃腸炎診斷技術(shù)范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬傳染性胃腸炎的病毒分離鑒定與檢測病毒抗原的直接免疫熒光法、雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA)及檢測血清抗體的中和試驗(yàn)、間接ELISA試驗(yàn)技術(shù)。本標(biāo)準(zhǔn)適用于對(duì)豬傳染性胃腸炎的臨床診斷、產(chǎn)地檢疫及流行病學(xué)調(diào)查等。2材料準(zhǔn)備2.1器材倒置顯微鏡、冷凍離心機(jī)、微孔濾膜、濾器、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、蓋玻片、溫箱、熒光顯微鏡、冰凍切片機(jī)、載玻片、滴管、定量加液器、微量吸液器及配套吸頭、96孔或40孔聚乙烯微量反應(yīng)板、單通道、8通道微量吸液器及配套吸頭、二氧化碳培養(yǎng)箱、微量振蕩器及小培養(yǎng)瓶、酶標(biāo)測試儀等、2.2溶液的配制0.02mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液、細(xì)胞培養(yǎng)液、病毒培養(yǎng)液、HEPES液、0.1%伊文斯藍(lán)原液、磷酸鹽緩沖甘油、洗液、包被稀釋液、樣品稀釋液、酶標(biāo)抗體稀釋液、底物溶液、終止液，配制方法見附錄A。2.3試劑熒光抗體(FA),豬抗TGE-gG及豬抗「GE-IeG-HRP,病毒抗原和標(biāo)準(zhǔn)陰、陽性血清，抗原和酶標(biāo)抗體2.4細(xì)胞仔豬腎原代細(xì)胞或PK.、ST細(xì)胞系。細(xì)胞培養(yǎng)液，配制方法見附錄A.3病毒分離鑒定3.1病毒分離3.1.1病料采集采病仔豬空腸兩端扎住，取其內(nèi)容物及小腸用于分離病毒，樣品冷凍保存。3.1.2病料處理將采集的小段空腸剪碎及腸內(nèi)容物用含青霉素10000IU、鏈?zhǔn)⑺?0000e/mL的磷酸鹽緩沖液（PBS）液（見第A.1章)制成5倍懸液，在4C條件下3000r/min離心30mim,取上清液，經(jīng)0.22m微孔濾膜過濾，分裝，一20℃保在備用，3.1.3接種及觀察將過濾液(病毒培養(yǎng)液的10%）見第A.3章)接種細(xì)胞單層上,在37℃吸附1h后補(bǔ)加病毒培養(yǎng)液,遂日觀察細(xì)胞病變(CPE）,連續(xù)3d～4d.按CPE變化情況可盲傳2代～3代。3.2病毒鑒定（PE變化的特點(diǎn):細(xì)胞顆粒增多.圓縮，呈小堆狀或葡萄串樣均勾分布，細(xì)胞破損，脫落。對(duì)不同細(xì)胞培養(yǎng)物,CPE可能有些差異。分離病毒用細(xì)胞瓶中加蓋玻片培養(yǎng)，收毒時(shí)取出蓋玻片（包括接毒與不接毒對(duì)照片)用直接熒光法