微生物的生長(zhǎng)繁殖與生長(zhǎng)因子

微生物的生長(zhǎng)繁殖與生長(zhǎng)因子第一頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日理解微生物的連續(xù)培養(yǎng)掌握單細(xì)胞微生物的生長(zhǎng)曲線和在污水處理中的應(yīng)用理解溫度和pH對(duì)微生物的影響理解溶解氧對(duì)微生物的影響理解有機(jī)物及抗生素對(duì)微生物的影響理解高溫對(duì)微生物的影響了解微生物與微生物的一般關(guān)系掌握互生和共生關(guān)系了解菌種的退化和復(fù)壯理解菌種的保藏方法重點(diǎn)：微生物的生長(zhǎng)繁殖規(guī)律和生長(zhǎng)影響因子，難點(diǎn)：?jiǎn)渭?xì)胞微生物的生長(zhǎng)曲線第二頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日第一節(jié)微生物的生長(zhǎng)繁殖第三頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日一、微生物生長(zhǎng)繁殖的概念細(xì)菌兩次細(xì)胞分裂之間的時(shí)間稱為世代時(shí)間（代時(shí)）。在一定培養(yǎng)條件下，世代時(shí)間是一定的。如果營(yíng)養(yǎng)成分不同，世代時(shí)間不同。不同種的微生物，世代時(shí)間不同。原核微生物的繁殖速度比真核快，專性厭氧菌的世代時(shí)間多數(shù)比好氧菌的長(zhǎng)。生長(zhǎng)——微生物細(xì)胞吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)行新陳代謝，當(dāng)同化作用>異化作用時(shí)，生命個(gè)體的重量和體積不斷增大的過程。繁殖——生命個(gè)體生長(zhǎng)到一定階段，通過特定方式產(chǎn)生新的生命個(gè)體，即引起生命個(gè)體數(shù)量增加的生物學(xué)過程。發(fā)育——從生長(zhǎng)到繁殖，是生物的構(gòu)造和機(jī)能從簡(jiǎn)單到復(fù)雜、從量變到質(zhì)變的發(fā)展變化過程，這一過程稱為發(fā)育。第四頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日一些細(xì)菌的代時(shí)菌名 培養(yǎng)基 培養(yǎng)溫度 代時(shí)E.coli（大腸桿菌） 肉湯 37℃ 17minE.coli 牛奶 37 12.5 Enterobacteraerogenes（產(chǎn)氣腸細(xì)菌） 肉湯或牛奶37 16~18 E.aerogenes 組合 37 29~44B. Cereus（蠟狀芽孢桿菌） 肉湯 30 18B.thermophilus（嗜熱芽孢桿菌） 肉湯 55 18.3Lactobacillusacidophilus（嗜酸乳桿菌） 牛奶 37 66~87Streptococcuslactis（乳酸鏈球菌） 牛奶 37 26S.lactis 乳糖肉湯 37 48Salmonellatyphi（傷寒沙門氏菌） 肉湯 37 23.5Azotobacterchroococcum（褐球固氮菌） 葡萄糖 25 344~46 Mycobacteriumtuberculosis（結(jié)核分枝桿菌）組合 37 792~93 Nitrobacteragilis（活躍硝化桿菌） 組合 27 1200第五頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日二、研究微生物生長(zhǎng)的方法微生物生長(zhǎng)分個(gè)體生長(zhǎng)和群體生長(zhǎng)：個(gè)體生長(zhǎng)——微生物細(xì)胞個(gè)體吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)行新陳代謝，原生質(zhì)與細(xì)胞組分的增加為個(gè)體生長(zhǎng)。群體生長(zhǎng)——群體中個(gè)體數(shù)目的增加?？梢杂弥亓?、體積、密度或濃度來衡量。（由于微生物的個(gè)體極小，所以常用群體生長(zhǎng)來反映個(gè)體生長(zhǎng)的狀況）第六頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日培養(yǎng)方法有兩種，一種是分批培養(yǎng)（間歇式培養(yǎng)），另一種是連續(xù)培養(yǎng)。一般通過測(cè)定細(xì)菌重量或數(shù)量隨培養(yǎng)時(shí)間延續(xù)的曲線關(guān)系來考察細(xì)菌的生長(zhǎng)特性。第七頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日（一）分批培養(yǎng)分批培養(yǎng)是在一個(gè)封閉的、有一定體積的液體培養(yǎng)基的容器中接種一定量的微生物，在特定條件下進(jìn)行培養(yǎng),并定時(shí)取樣測(cè)定活微生物數(shù)目的變化。在分批培養(yǎng)中微生物只完成一次生長(zhǎng)循環(huán)。微生物生長(zhǎng)曲線：在分批培養(yǎng)過程中，微生物的數(shù)量由少變多，達(dá)到高峰后又由多變少，甚至死亡的變化規(guī)律。用坐標(biāo)法作圖,以時(shí)間為橫坐標(biāo),以單細(xì)胞微生物數(shù)量的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo),可以繪出一條有規(guī)律的曲線,稱為生長(zhǎng)曲線。第八頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日生長(zhǎng)曲線

穩(wěn)定期

衰亡期

細(xì)胞數(shù)目的對(duì)數(shù)值

0時(shí)間t微生物的數(shù)量很大，都是10的n次方，取對(duì)數(shù)作圖時(shí)方便?？偧?xì)胞數(shù)活細(xì)胞數(shù)為什么微生物數(shù)目用對(duì)數(shù)值作圖？

緩

慢

期對(duì)數(shù)期第九頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日1、停滯期（延遲期或適應(yīng)期）（lagphase）:

當(dāng)細(xì)菌被接種到新鮮培養(yǎng)基中，開始一段時(shí)間內(nèi)，通常不立即進(jìn)行細(xì)胞分裂、增殖，生長(zhǎng)速率近于零，細(xì)胞數(shù)目幾乎保持不變，甚至稍有減少，這段時(shí)間被稱為停滯期。第十頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日特點(diǎn)：生長(zhǎng)速率=0細(xì)胞形態(tài)變大或增長(zhǎng)細(xì)胞內(nèi)RNA特別是rRNA含量增高合成代謝活躍（核糖體、酶類、ATP合成加快），易產(chǎn)生誘導(dǎo)酶對(duì)外界不良條件敏感，（如氯化鈉濃度、溫度、抗生素等化學(xué)藥物）原因：適應(yīng)新的環(huán)境條件，合成新的酶，積累必要的中間產(chǎn)物第十一頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日菌種：繁殖速度較快(世代時(shí)間短)的菌種的延遲期一般較短；接種物菌齡：用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌種接種時(shí)，其延遲期較短，甚至檢查不到延遲期；接種量：一般來說，接種量增大可縮短甚至消除延遲期（發(fā)酵工業(yè)上一般采用1/10的接種量）；營(yíng)養(yǎng)：培養(yǎng)基成分

在營(yíng)養(yǎng)成分豐富的天然培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的延滯期比在合成培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)短；

接種后培養(yǎng)基成分有較大變化時(shí)，會(huì)使延滯期加長(zhǎng)，所以發(fā)酵工業(yè)上盡量使發(fā)酵培養(yǎng)基的成分與種子培養(yǎng)基接近。影響停滯期長(zhǎng)短的因素第十二頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日認(rèn)識(shí)停滯期的特點(diǎn)及形成原因?qū)?shí)踐的指導(dǎo)意義：在工業(yè)上需設(shè)法盡量縮短延遲期，采取的縮短lagphase的措施有：①增加接種量；（群體優(yōu)勢(shì)----適應(yīng)性增強(qiáng)）②采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的健壯菌種；③調(diào)整培養(yǎng)基的成分，在種子基中加入發(fā)酵培養(yǎng)基的某些成分；④選用繁殖快的菌種。第十三頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日2、對(duì)數(shù)期（指數(shù)期）logarithmicphase

細(xì)菌生長(zhǎng)速度達(dá)到最大，細(xì)胞數(shù)目以幾何級(jí)數(shù)增加，其對(duì)數(shù)與時(shí)間呈直線關(guān)系。特點(diǎn)：（1）細(xì)菌迅速分裂，菌數(shù)按幾何級(jí)數(shù)增加；（2）世代時(shí)間最短，而且恒定；（3）生長(zhǎng)速度最高而且恒定；（4）代謝活力強(qiáng)無死亡；（5）菌體整齊，體積恢復(fù)到原來大??；（6）對(duì)環(huán)境敏感，生理性狀及菌體成分較一致第十四頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日細(xì)菌代時(shí)(generationtime;G)的計(jì)算細(xì)菌的代時(shí)即世代時(shí)間，或稱倍增時(shí)間是指細(xì)菌繁殖一代即個(gè)體數(shù)目增加一倍的時(shí)間。細(xì)菌代時(shí)的測(cè)定必須以對(duì)數(shù)期的生長(zhǎng)細(xì)胞作為對(duì)象。第十五頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日世代時(shí)間的計(jì)算(P167)：

x2=x1·2n以對(duì)數(shù)表示：lgx2=lgx1+nlg2生長(zhǎng)速率常數(shù)平均世代時(shí)間第十六頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日影響因素：（1）溫度。在適溫范圍內(nèi)，每增加10℃，生長(zhǎng)速度提高1倍；第十七頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日（2）營(yíng)養(yǎng)；（3）氧氣。好氧菌若能供給充足的氧，可能使對(duì)數(shù)期延長(zhǎng)。第十八頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日延長(zhǎng)措施：定時(shí)定量加入營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)排出代謝產(chǎn)物，或使用連續(xù)培養(yǎng)。應(yīng)用意義：①由于此時(shí)期的菌種比較健壯，生產(chǎn)上用作接種的最佳菌齡和增殖噬菌體的最適宿主菌齡；②發(fā)酵工業(yè)上盡量延長(zhǎng)該期，以達(dá)到較高的菌體密度;③食品工業(yè)上盡量使有害微生物不能進(jìn)入此期;④是生理代謝及遺傳研究或進(jìn)行染色、形態(tài)觀察等的良好材料。第十九頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日3、靜止期stationaryphase又稱：穩(wěn)定期或最高生長(zhǎng)期。由于營(yíng)養(yǎng)消耗，供應(yīng)不足及代謝產(chǎn)物的積累，這時(shí)一部分菌死亡，細(xì)菌進(jìn)入靜止期。第二十頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日特點(diǎn)：①新增殖的細(xì)胞數(shù)與老細(xì)胞的死亡數(shù)幾乎相等，微生物的生長(zhǎng)速率處于動(dòng)態(tài)平衡，培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)目達(dá)到最高值。②細(xì)胞分裂速度下降，開始積累內(nèi)含物，產(chǎn)芽孢的細(xì)菌開始產(chǎn)芽孢。③此時(shí)期的微生物開始合成次生代謝產(chǎn)物，對(duì)于發(fā)酵生產(chǎn)來說，一般在穩(wěn)定期的后期產(chǎn)物積累達(dá)到高峰，是最佳的收獲時(shí)期。若目標(biāo)是菌體，則在靜止期初期就要及時(shí)收獲菌體。第二十一頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日產(chǎn)生原因：1）營(yíng)養(yǎng)物尤其是生長(zhǎng)限制因子的耗盡；2）營(yíng)養(yǎng)物的比例失調(diào)，例如C／N比值不合適等；3）酸、醇、毒素或H2O2等有害代謝產(chǎn)物的累積；4）pH、氧化還原勢(shì)等物化條件越來越不適宜；5）溶解氧供應(yīng)不足。第二十二頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日應(yīng)用意義：

發(fā)酵生產(chǎn)形成的重要時(shí)期（抗生素、氨基酸等），生產(chǎn)上應(yīng)盡量延長(zhǎng)此期，提高產(chǎn)量。措施如下：

補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（補(bǔ)料）調(diào)pH調(diào)整溫度

第二十三頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日4、衰亡期declinephase由于營(yíng)養(yǎng)缺乏和代謝產(chǎn)物積累造成自身中毒，細(xì)胞生長(zhǎng)受阻，時(shí)間和菌數(shù)對(duì)數(shù)呈反比，生長(zhǎng)曲線直線下降。第二十四頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日特點(diǎn)：①細(xì)胞死亡數(shù)增加，死亡數(shù)大大超過新增殖的細(xì)胞數(shù)，群體中的活菌數(shù)目急劇下降，出現(xiàn)“負(fù)生長(zhǎng)”。②細(xì)胞進(jìn)行內(nèi)源性呼吸（因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)缺乏），出現(xiàn)多形態(tài)、畸形或衰退形，芽孢開始釋放。③因菌體本身產(chǎn)生的酶及代謝產(chǎn)物的作用，使菌體死亡。衰亡期比其他各時(shí)期時(shí)間長(zhǎng)，它的長(zhǎng)短也與菌種和環(huán)境條件有關(guān)。產(chǎn)生原因：

生長(zhǎng)條件的進(jìn)一步惡化，使細(xì)胞內(nèi)的分解代謝大大超過合成代謝，繼而導(dǎo)致菌體的死亡第二十五頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日（二）連續(xù)培養(yǎng)（continuousculture）連續(xù)培養(yǎng)：在微生物培養(yǎng)的過程中，不斷地供給新鮮的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)排除含菌體及代謝產(chǎn)物的發(fā)酵液，讓培養(yǎng)的微生物長(zhǎng)時(shí)間地處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以利于微生物的增殖速度和代謝活性處于某種穩(wěn)定狀態(tài)。第二十六頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日

恒化培養(yǎng)器

恒濁培養(yǎng)器

新鮮培養(yǎng)基

新鮮培養(yǎng)基

光電池

光源

流速控制閥

流速控制閥

流出物

連續(xù)培養(yǎng)與間歇培養(yǎng)不同，它的特點(diǎn)是一方面連續(xù)進(jìn)料，另一方面又連續(xù)出料。它又分為兩種：恒濁連續(xù)培養(yǎng)和恒化連續(xù)培養(yǎng)。第二十七頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日原理：當(dāng)微生物在單批培養(yǎng)方式下生長(zhǎng)達(dá)到對(duì)數(shù)期后期時(shí)，一方面以一定的速度流進(jìn)新鮮培養(yǎng)基并攪拌，另一方面以溢流方式流出培養(yǎng)液，使培養(yǎng)物達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，其中的微生物就能長(zhǎng)期保持對(duì)數(shù)期的平衡生長(zhǎng)狀態(tài)和穩(wěn)定的生長(zhǎng)速率。單批培養(yǎng)恒濁法恒化法單批培養(yǎng) 連續(xù)培養(yǎng) 時(shí)間連續(xù)流入新鮮培養(yǎng)液lg細(xì)胞數(shù)（個(gè)/ml）連續(xù)培養(yǎng)（1）連續(xù)培養(yǎng)原理第二十八頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日1、恒濁連續(xù)培養(yǎng)概念：調(diào)節(jié)培養(yǎng)基流速，使培養(yǎng)液濁度保持恒定的連續(xù)培養(yǎng)方法。原理：通過調(diào)節(jié)新鮮培養(yǎng)基流入的速度和培養(yǎng)物流出的速度來維持菌濃度不變,即濁度不變。主要采用恒濁器，當(dāng)濁度高時(shí)，使新鮮培養(yǎng)基的流速加快，濁度降低，則減慢培養(yǎng)基的流速。特點(diǎn)：基質(zhì)過量，微生物始終以最高速率進(jìn)行生長(zhǎng)，并可在允許范圍內(nèi)控制不同的菌體密度；但工藝復(fù)雜，煩瑣。使用范圍：用于生產(chǎn)大量菌體、生產(chǎn)與菌體生長(zhǎng)相平行的某些代謝產(chǎn)物，如乳酸、乙醇等。第二十九頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日2、恒化連續(xù)培養(yǎng)概念：以恒定流速使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)濃度恒定而保持細(xì)菌生長(zhǎng)速率恒定的方法。原理：通過控制某一種營(yíng)養(yǎng)物濃度（如碳、氮源、生長(zhǎng)因子等），使其始終成為生長(zhǎng)限制因子，而達(dá)到控制培養(yǎng)液流速保持不變，并使微生物始終在低于其最高生長(zhǎng)速率條件下進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖。特點(diǎn)：維持營(yíng)養(yǎng)成分的亞適量，控制微生物生長(zhǎng)速率。菌體生長(zhǎng)速率恒定，菌體均一、密度穩(wěn)定，產(chǎn)量低于最高菌體產(chǎn)量。應(yīng)用范圍：實(shí)驗(yàn)室科學(xué)研究及污水生物處理。常用的限制性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有作為N源的氨、氨基酸；作為C源的葡萄糖、麥芽糖、乳酸；生長(zhǎng)因子、無機(jī)鹽等。第三十頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日恒化器Chemostat或bactogen第三十一頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日

稀釋率/稀釋度（D）：新鮮培養(yǎng)基流入的速度為f，培養(yǎng)器中培養(yǎng)液體積為V，稀釋度為D=f/V，表示單位時(shí)間內(nèi)，新加入的培養(yǎng)基體積與培養(yǎng)器內(nèi)培養(yǎng)基總體積之比。隨著D增大，細(xì)菌濃度先升后降，但在相當(dāng)大范圍內(nèi)這種變化不明顯。當(dāng)稀釋度增大到最大比生長(zhǎng)速率時(shí)，微生物的增長(zhǎng)速率趕不上流出速率，結(jié)果必然是到某一時(shí)刻，微生物濃度降到維持生長(zhǎng)所必需的最低濃度（臨界濃度）之下，這時(shí)培養(yǎng)器內(nèi)微生物濃度趨于零。這時(shí)的D為臨界稀釋度。第三十二頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日裝置控制對(duì)象培養(yǎng)基培養(yǎng)基流速生長(zhǎng)速率產(chǎn)物應(yīng)用范圍恒濁器菌體密度（內(nèi)控制）無限制生長(zhǎng)因子不恒定最高大量菌體或與菌體形成相平行的產(chǎn)物生產(chǎn)為主恒化器培養(yǎng)基流速（外控制）有限制生長(zhǎng)因子恒定低于最高不同生長(zhǎng)速率的菌體實(shí)驗(yàn)室為主恒濁器與恒化器的比較第三十三頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日三、細(xì)菌生長(zhǎng)曲線在廢水處理中的應(yīng)用

在廢水生物處理時(shí)，可利用不同生長(zhǎng)階段的微生物處理廢水：常規(guī)活性污泥法：減速期，靜止期生物吸附法：生長(zhǎng)下降階段（靜止期）高負(fù)荷活性污泥法：對(duì)數(shù)期、減速期延時(shí)曝氣法：衰亡期利用對(duì)數(shù)期進(jìn)行廢水生物處理，雖然反應(yīng)速率快，但想取得穩(wěn)定的出水及較高的處理效果亦比較困難。故一般在廢水生物處理工程中，常利用減速生長(zhǎng)期或內(nèi)源呼吸初期的微生物的生長(zhǎng)、活動(dòng)，使廢水中的有機(jī)物穩(wěn)定化，并取得較好的處理效果。第三十四頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日四、微生物生長(zhǎng)量的測(cè)定方法可根據(jù)菌體細(xì)胞量、菌體體積、重量直接測(cè)定，也可以根據(jù)某種細(xì)胞物質(zhì)的含量或某個(gè)代謝活動(dòng)速度間接測(cè)定（比濁法，碳、氮含量法，DNA測(cè)定法等）。微生物生長(zhǎng)測(cè)量方法個(gè)體計(jì)數(shù)法重量法生理指標(biāo)法第三十五頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日1.血球計(jì)數(shù)板法第三十六頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日原理：將1mm2×0.02mm的薄層空間劃分為400小格，從中均勻分布地選取80小格，計(jì)數(shù)其中的細(xì)胞數(shù)目，換算成單位體積中的細(xì)胞數(shù)。適用范圍：個(gè)體較大細(xì)胞或顆粒，如血球、酵母菌等。不適用于細(xì)菌等個(gè)體較小的細(xì)胞，因?yàn)椋?）細(xì)菌細(xì)胞太小，不易沉降；（2）在油鏡下看不清網(wǎng)格線，超出油鏡工作距離。特點(diǎn)：快速，準(zhǔn)確，對(duì)酵母菌可同時(shí)測(cè)定出芽率，或在菌懸液中加入少量美藍(lán)可以區(qū)分死活細(xì)胞。第三十七頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日2.涂片染色法應(yīng)用：可同時(shí)計(jì)數(shù)不同微生物的菌數(shù)，適于土壤、牛奶中細(xì)菌計(jì)數(shù)。方法：用鏡臺(tái)測(cè)微尺計(jì)算出視野面積；取0.1ml菌液涂于1cm2面積上，計(jì)數(shù)后代入公式：每ml原菌液含菌數(shù)=視野中平均菌數(shù)×涂布面積/視野面積×10×稀釋倍數(shù)第三十八頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日3.平板菌落計(jì)數(shù)法第三十九頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日★技術(shù)要求：樣品充分混勻，操作熟練快速（15~20min完成操作），嚴(yán)格無菌操作；★注意事項(xiàng)：每一支吸管只能用于一個(gè)稀釋度，樣品混勻處理，傾注平板時(shí)的培養(yǎng)基溫度；★適用范圍：中溫、好氧和兼性厭氧、能在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上生長(zhǎng)的微生物，★誤差：多次稀釋造成的誤差是主要來源，其次還有由于樣品內(nèi)菌體分布不均勻、以及不當(dāng)操作第四十頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日4、薄膜過濾計(jì)數(shù)法常用該法測(cè)定含菌量較少的空氣和水中的微生物數(shù)目。將定量的樣品通過薄膜（硝化纖維素薄膜、醋酸纖維薄膜）過濾，菌體被阻留在濾膜上，取下濾膜進(jìn)行培養(yǎng)，然后計(jì)算菌落數(shù)，可求出樣品中所含菌數(shù)。第四十一頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日5.干重法

將一定量的菌液中的菌體通過離心或過濾分離出來,然后烘干(干燥溫度可采用105℃、100℃或80℃)、稱重。一般干重為濕重的10%-20%，而一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞一般重約10-12-10-13g。該法適合菌濃度較高的樣品。舉例：大腸桿菌一個(gè)細(xì)胞一般重約10–12-10–13g，液體培養(yǎng)物中細(xì)胞濃度達(dá)到2×109個(gè)/ml時(shí)，100ml培養(yǎng)物可得10-90mg干重的細(xì)胞。第四十二頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日6.比濁法原理：是在一定范圍內(nèi)，菌懸液中的細(xì)胞濃度與混濁度成正比，即與光密度成正比，菌數(shù)越多，光密度越大。因此，借助于分光光度計(jì)，在一定波長(zhǎng)下測(cè)定菌懸液的光密度，就可反應(yīng)出菌液的濃度。特點(diǎn)：快速、簡(jiǎn)便；但易受干擾。第四十三頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日7.生理指標(biāo)法測(cè)含氮量蛋白質(zhì)是細(xì)胞的主要物質(zhì)，含量穩(wěn)定，而氮是蛋白質(zhì)的主要成分，通過測(cè)含氮量就可推知微生物的濃度。一般細(xì)菌含氮量為干重的12.5%，酵母菌為7.5%，霉菌為6.0%，根據(jù)一定體積培養(yǎng)液中的含氮量再乘以6.25，就可測(cè)得粗蛋白的含量。其他方法含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量、產(chǎn)二氧化碳、產(chǎn)酸、產(chǎn)熱、粘度等，都可用于生長(zhǎng)量的測(cè)定。第四十四頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日五、獲得純培養(yǎng)的方法純培養(yǎng)(pureculture)微生物學(xué)中把從一個(gè)細(xì)胞或一群相同的細(xì)胞經(jīng)過培養(yǎng)繁殖而得到的后代,稱純培養(yǎng).（1）液體稀釋法（2）平板劃線分離法（StreakPlate）（3）平板涂布分離法（SpreadPlate）（4）選擇性培養(yǎng)分離法（5）單細(xì)胞（單孢子）分離法第四十五頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日首先將待分離的樣品進(jìn)行連續(xù)稀釋,目的是得到高度稀釋的效果,使一支試管中分配不到一個(gè)微生物.如果經(jīng)過稀釋后的大多數(shù)試管中沒有微生物生長(zhǎng),那么有微生物生長(zhǎng)的試管得到的培養(yǎng)物可能就是由一個(gè)微生物個(gè)體繁殖而來的純培養(yǎng)物.這種方法適合于細(xì)胞較大的微生物.（1）液體稀釋法第四十六頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日（2）平板劃線分離法（StreakPlate）特點(diǎn)：快速、方便。

分區(qū)劃線（適用于濃度較大的樣品）

連續(xù)劃線（適用于濃度較小的樣品）第四十七頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日（3）平板涂布分離法（SpreadPlate）簡(jiǎn)單易行，但易造成機(jī)械損傷第四十八頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日（4）選擇性培養(yǎng)分離法為了從混雜的微生物群體中分離出某種微生物，可以根據(jù)該微生物的特點(diǎn)，包括營(yíng)養(yǎng)、生理、生長(zhǎng)條件等，采用選擇培養(yǎng)的方法進(jìn)行分離。＊利用選擇培養(yǎng)基進(jìn)行直接分離＊富集培養(yǎng)第四十九頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日（5）單細(xì)胞（單孢子）分離法采用顯微分離法從混雜群體中直接分離單個(gè)細(xì)胞或單個(gè)個(gè)體進(jìn)行培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng)的方法。該方法要在顯微鏡下進(jìn)行。毛細(xì)管法：用毛細(xì)管提取微生物個(gè)體，適合于較大微生物。顯微操作儀：用顯微針、鉤、環(huán)等挑取單個(gè)細(xì)胞或孢子以獲得純培養(yǎng)。小液滴法：將經(jīng)過適當(dāng)稀釋后的樣品制成小液滴，在顯微鏡下選取只含一個(gè)細(xì)胞的液滴來進(jìn)行純培養(yǎng)物的分離。第五十頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日第二節(jié)

微生物的生存因子第五十一頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日微生物與所處的環(huán)境之間具有復(fù)雜的相互影響和相互作用:一方面,各種各樣的環(huán)境因素對(duì)微生物的生長(zhǎng)和繁殖有影響,另一方面,微生物生長(zhǎng)繁殖也會(huì)影響和改變環(huán)境.研究環(huán)境因素與微生物之間的關(guān)系,可以通過控制環(huán)境條件來利用微生物有益的一面,同時(shí)防止它有害的一面。第五十二頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日溫度是影響微生物生長(zhǎng)的最重要因素之一。溫度對(duì)微生物的影響具體表現(xiàn)在：影響酶活性。溫度變化影響酶促反應(yīng)速率，最終影響細(xì)胞合成。影響細(xì)胞膜的流動(dòng)性。溫度高，流動(dòng)性大，有利于物質(zhì)的運(yùn)輸，溫度低，流動(dòng)性降低，不利于物質(zhì)運(yùn)輸，因此，溫度變化影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收與代謝產(chǎn)物的分泌。影響物質(zhì)的溶解度。對(duì)生長(zhǎng)有影響。一、溫度第五十三頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日最低生長(zhǎng)溫度:指微生物能進(jìn)行繁殖的最低溫度界限。最適生長(zhǎng)溫度：指使微生物迅速生長(zhǎng)的溫度。最高生長(zhǎng)溫度：指微生物生長(zhǎng)繁殖的最高溫度界限。處于最適生長(zhǎng)溫度時(shí)，生長(zhǎng)速度最快，代時(shí)最短。超過最低生長(zhǎng)溫度時(shí)，微生物不生長(zhǎng)，溫度過低，甚至?xí)劳觥３^最高生長(zhǎng)溫度時(shí)，微生物不生長(zhǎng)，溫度過高，甚至?xí)劳觥Ｎ⑸锏谖迨捻?yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日根據(jù)微生物的最適生長(zhǎng)溫度分類嗜冷微生物嗜溫微生物嗜熱微生物超嗜熱或嗜高溫微生物微生物類型最低溫度oC最適溫度oC最高溫度oC嗜冷微生物-5-05-1020-30嗜溫微生物5-1025-4045-50嗜熱微生物3050-6070-80超嗜熱或嗜高溫微生物>5570-105110-113第五十五頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日嗜冷微生物嗜冷機(jī)制：專性嗜冷菌：最適5-15℃，最低-12℃，兩極地區(qū)。兼性嗜冷菌：最適10-20℃，最低，-5-0℃，海水及冷藏食品嗜冷微生物能在低溫下生長(zhǎng)的機(jī)制在于：（1）酶在低溫下仍能有效地發(fā)揮作用（2）細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸含量較高，低溫下仍能保持流動(dòng)狀態(tài)。低溫致死的原因是細(xì)胞內(nèi)水分變成冰晶，造成細(xì)胞脫水，還造成細(xì)胞尤其是細(xì)胞膜的損傷。第五十六頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日嗜熱微生物嗜熱機(jī)制嗜熱機(jī)制：（1）酶以及核糖體有較強(qiáng)的抗熱性（2）產(chǎn)生多胺、熱亞胺和高溫精胺，可穩(wěn)定細(xì)胞中與蛋白質(zhì)合成有關(guān)的結(jié)構(gòu)和保護(hù)大分子免受高溫的損害（3）核酸具有較高的熱穩(wěn)定性（核酸中G+C含量高（tRNA），可提供形成氫鍵，增加熱穩(wěn)定性）。（4）細(xì)胞膜中含有較多的飽和脂肪酸和直鏈脂肪酸，較高溫度下能維持正常的液晶狀態(tài)。使膜具有熱穩(wěn)定性（5）生長(zhǎng)速率快，合成大分子迅速，可及時(shí)彌補(bǔ)由于熱所造成的大分子的破壞嗜熱菌：適于在45-50℃中生長(zhǎng)，主要分布在溫泉、堆肥和土壤中。

第五十七頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日

菌名 生長(zhǎng)溫度 發(fā)酵溫度 累積產(chǎn)物溫度 （℃） （℃） （℃）Streptococcusthermophilus 37 47 37S.lactis 34 40 產(chǎn)細(xì)胞：25~30 產(chǎn)乳酸：30Streptomycesgriseus 37 28 _Corenybacteriumpekinense 32 33~35 _Clostridiumacetobutylicum 37 33 _Peniciliumchrysogenum 30 25 20以青霉素的生產(chǎn)為例：培養(yǎng)165小時(shí)采用分段控制溫度的方法，其青霉素產(chǎn)量比始終在30℃培養(yǎng)提高了14.7%。分段控制方式：0-5小時(shí)，30℃；5-40小時(shí)，25℃；40-125小時(shí)，20℃；125-165小時(shí)，25℃。不同生理生化過程的最適溫度微生物不同生理活動(dòng)要求不同溫度，所以最適生長(zhǎng)溫度≠發(fā)酵速度快、積累代謝產(chǎn)物多。第五十八頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日高溫與低溫對(duì)微生物的影響1、高溫對(duì)微生物的影響高溫下蛋白質(zhì)不可逆變性，膜受熱出現(xiàn)小孔，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)（溶菌）。用于滅菌。2、低溫對(duì)微生物的影響當(dāng)環(huán)境溫度低于微生物的最適生長(zhǎng)溫度時(shí)，微生物的生長(zhǎng)繁殖停止，用于保存食物和菌種。造成死亡的原因：①凍結(jié)時(shí)細(xì)胞水分變成冰晶，冰晶對(duì)細(xì)胞膜產(chǎn)生機(jī)械損傷，膜內(nèi)物質(zhì)外漏。②凍結(jié)過程造成細(xì)胞脫水第五十九頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日二、pHpH值對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響機(jī)制◆影響膜表面電荷的性質(zhì)及膜的通透性，進(jìn)而影響對(duì)物質(zhì)的吸收能力?！舾淖兠富?、酶促反應(yīng)的速率及代謝途徑：如：酵母菌在pH4.5-5產(chǎn)乙醇，在pH6.5以上產(chǎn)甘油、酸?！舡h(huán)境pH值還影響培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的離子化程度，從而影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收，或有毒物質(zhì)的毒性。第六十頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日不同微生物生長(zhǎng)所需的pH不同。大多數(shù)微生物最適pH6.5-7.5，適應(yīng)范圍在pH4-10之間。能在pH1-5范圍內(nèi)生長(zhǎng)的微生物稱為專性嗜酸微生物，如氧化硫硫桿菌、酸熱硫化葉菌；能在酸性條件下也能在中性條件下生長(zhǎng)的為兼性嗜酸微生物；能在高pH下生長(zhǎng)的為嗜堿性微生物，如巴氏芽孢桿菌能在pH11.2-11.6條件下生長(zhǎng)（最適pH9.6）。微生物最低pH最適pH最高pH細(xì)菌3-56.5-7.58-10酵母菌2-34.5-5.57-8霉菌1-34.5-5.57-8第六十一頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日在培養(yǎng)微生物的過程中，隨著微生物的生長(zhǎng)繁殖和代謝進(jìn)行，pH會(huì)變化：碳源：葡萄糖、乳糖→有機(jī)酸——pH下降氮源：蛋白質(zhì)、蛋白胨、氨基酸→氨、胺類——pH上升（NH4）2SO4→SO42-——pH下降Na2NO3→NO32-被吸收——pH上升尿素→氨——pH上升第六十二頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日同一種微生物在其不同的生長(zhǎng)階段和不同的生理生化過程中，對(duì)pH值的要求也不同。例如：黑曲霉（Aspergillusniger）在pH2-2.5范圍時(shí)有利于合成檸檬酸，當(dāng)在pH2.5~6.5范圍內(nèi)時(shí)以菌體生長(zhǎng)為主，而在pH7.0時(shí)，則以合成草酸為主。

微生物 生長(zhǎng)最適pH 合成抗生素最適pH灰色鏈霉菌 6.3~6.9 6.7~7.3紅霉素鏈霉菌 6.6~7.0 6.8~7.3產(chǎn)黃青霉 6.5~7.2 6.2~6.8金霉素鏈霉菌 6.1~6.6 5.9~6.3龜裂鏈霉菌 6.0~6.6 5.8~6.1灰黃青霉 6.4~7.0 6.2~6.5生長(zhǎng)的最適pH值與發(fā)酵的最適pH值第六十三頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日三、氧化還原電位（Eh）

指的是氧化體系供給電子（作為還原劑）或接受電子（作為氧化劑）的趨勢(shì)的度量，單位為V或mV。氧化環(huán)境有正電位，還原環(huán)境有負(fù)電位。

各種微生物需要的氧化還原電位不同：好氧微生物：>+0.1V最適+0.3~+0.4V厭氧微生物：<0.1V;第六十四頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日影響因素：1、氧分壓：分壓高，氧化還原電位高2、pH：pH低，氧化還原電位低3、微生物的生長(zhǎng)：對(duì)有機(jī)物的氧化可使氧化還原電位下降，在代謝過程所產(chǎn)生的H2、H2S也使氧化還原電位下降。加入還原劑可使氧化還原電位下降。要提高氧化還原電位，提高氧的通氣量。氧化還原電位影響微生物許多酶的活性，也影響細(xì)胞的呼吸作用。在某些條件下，如果保持低的氧化還原電位，則專性厭氧菌可不被氧殺死。所以有人認(rèn)為氧不是專性厭氧菌的致死原因，而是由于氧所形成的高氧化還原電位。第六十五頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日四、溶解氧微生物對(duì)氧的需要和耐受力在不同的類群中變化很大，根據(jù)微生物與氧的關(guān)系,可把它們分為幾種類群:

專性好氧菌:好氧菌微好氧菌：兼性厭氧菌耐氧厭氧菌：厭氧菌(專性)厭氧菌：第六十六頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日（一）好氧微生物與氧的關(guān)系大多數(shù)細(xì)菌、大多數(shù)放線菌、霉菌、原生動(dòng)物、微型后生動(dòng)物都屬于好氧性微生物。氧對(duì)好氧微生物的作用：1、作為微生物好氧呼吸中電子傳遞鏈的最終受體2、參與甾醇類和不飽和脂肪酸的生物合成在利用氧的過程中，氧可產(chǎn)生各種有毒的代謝產(chǎn)物如過氧化氫、羥自由基、超氧陰離子等，好氧微生物體內(nèi)具有SOD、過氧化物酶可清除之。第六十七頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日好氧微生物需要的是溶解氧。氧的溶解度與水溫、大氣壓有關(guān)。溫度低，溶解度大；壓力大，溶解度大。在純水中0℃時(shí)氧溶解度14mg/L；10℃-11.3mg/L；20℃-9.2mg/L；30℃-7.7mg/L。含有機(jī)物的污水溶解度很低。好氧微生物需要供給充足的氧氣。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)振蕩培養(yǎng)，工業(yè)生產(chǎn)上采用通入無菌空氣和攪拌等方法供氧。污水處理中利用各種充氧設(shè)備充氧，供給量根據(jù)微生物的數(shù)量、理化性質(zhì)、基質(zhì)性質(zhì)及濃度綜合考慮。一般來說，溶解氧質(zhì)量濃度維持在3-4mg/L，若供氧不足，廢水處理效果不好。第六十八頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日（二）兼性厭氧菌與氧的關(guān)系兼性厭氧菌既有脫氧酶又有氧化酶，因此既能在無氧條件下又能在有氧條件下生存。在有氧條件下，氧化酶活性強(qiáng)，可進(jìn)行氧化磷酸化；無氧時(shí)，細(xì)胞色素和電子傳遞體系的其他組分減少或喪失，但充氧后又可全部恢復(fù)。兼性微生物包括酵母菌、腸道細(xì)菌、硝酸鹽還原菌、人和動(dòng)物致病菌、某些原生動(dòng)物、微型后生動(dòng)物、個(gè)別真菌。

第六十九頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日酵母在有氧條件下進(jìn)行好氧呼吸，將有機(jī)物氧化成二氧化碳和水；無氧條件下，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生乙醇和二氧化碳。在發(fā)酵過程中通入氧，發(fā)酵速度下降，葡萄糖利用速度下降，氧對(duì)葡萄糖的利用有抑制作用——巴斯德效應(yīng)。原因在于有氧的情況下，氧化磷酸化使NADH的H+不再轉(zhuǎn)給丙酮酸生成乳酸而是傳給氧產(chǎn)生ATP，丙酮酸進(jìn)入TCA循環(huán)使檸檬酸濃度增加，高含量的ATP及檸檬酸抑制磷酸果糖激酶的活性，從而減慢糖酵解的速度。兼性厭氧菌在污水處理中有積極作用。在供氧不足的條件下，它們可對(duì)有機(jī)物進(jìn)行不徹底的氧化，將大分子的蛋白質(zhì)、脂肪、糖類分解成小分子的有機(jī)酸和醇。第七十頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日（三）厭氧微生物：專性厭氧微生物——梭菌屬、擬桿菌、產(chǎn)甲烷菌等。耐氧的厭氧微生物——氧的存在對(duì)它們無影響，不利用氧也不中毒。如乳酸菌。專性厭氧微生物的生存環(huán)境中絕對(duì)不能有氧，有氧存在時(shí)代謝產(chǎn)生的NADH2和O2反應(yīng)產(chǎn)生H2O2、NAD，還可產(chǎn)生超氧陰離子，而且專性厭氧微生物不具備SOD、H2O2酶。耐氧的厭氧微生物具有SOD，但缺乏H2O2酶，H2O2積累過多仍會(huì)被氧化。

第七十一頁(yè)，共七十八頁(yè)，2022年，8月28日厭氧微生物的培養(yǎng)：可用N2、H2、He驅(qū)趕氧；加入氧化還原顏料——甲基蘭或刃天青指示