革蘭氏染色及鏡檢操作規(guī)范培訓(xùn)

關(guān)于革蘭氏染色及鏡檢操作規(guī)范培訓(xùn)第一頁，共二十九頁，2022年，8月28日一、革蘭氏染色法革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法，1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立。

第二頁，共二十九頁，2022年，8月28日細(xì)菌先經(jīng)堿性染料結(jié)晶染色，而經(jīng)碘液媒染后，用酒精脫色，革蘭氏陽性菌（G+）不被脫去，革蘭氏陰性菌（G-）可被脫去。為觀察方便，脫色后再用一種紅色染料如堿性蕃紅等進(jìn)行復(fù)染。陽性菌仍帶紫色，陰性菌則被染上紅色。第三頁，共二十九頁，2022年，8月28日有芽胞的桿菌和絕大多數(shù)的球菌，以及所有的放線菌和真菌都呈革蘭氏陽性反應(yīng)；弧菌，螺旋體和大多數(shù)致病性的無芽胞桿菌都呈現(xiàn)陰性反應(yīng)。

第四頁，共二十九頁，2022年，8月28日G+和G-生物學(xué)特性的差異

比較項(xiàng)目G+細(xì)菌G-細(xì)菌革蘭氏染色反應(yīng)能阻留結(jié)晶紫而染成紫色可經(jīng)脫色而復(fù)染成紅色肽聚糖厚，層次多薄，一般單層磷壁酸多數(shù)含有無外膜無有脂多糖（LPS）無有類脂和脂蛋白含量低（僅抗酸性細(xì)菌含有類脂）高鞭毛結(jié)構(gòu)基體上著生2個(gè)環(huán)基體上著生4個(gè)環(huán)產(chǎn)毒素以外毒素為主以內(nèi)毒素為主對(duì)機(jī)械力的抗性強(qiáng)弱第五頁，共二十九頁，2022年，8月28日陰性菌陽性菌第六頁，共二十九頁，2022年，8月28日二、革蘭氏染色原理G+菌由于其細(xì)胞壁較厚，肽聚糖網(wǎng)層次多且交聯(lián)程度大，故經(jīng)酒精脫色，失水而使網(wǎng)孔縮小，再加上它不含類脂，故酒精處理，能把結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物牢牢留在壁內(nèi)，使其保持紫色。第七頁，共二十九頁，2022年，8月28日G-菌因其細(xì)胞壁薄，外膜層類脂含量高，肽聚糖層薄且交聯(lián)程度低（松疏），經(jīng)酒精脫色后，以類脂為主的外膜迅速溶解，這時(shí)薄而松散的肽聚糖網(wǎng)不能阻擋結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物的溶出，因此細(xì)胞退成無色，再經(jīng)沙黃等紅色染料復(fù)染，就使G-菌呈紅色。第八頁，共二十九頁，2022年，8月28日三、儀器設(shè)備、試劑生物顯微鏡載玻片草酸銨結(jié)晶紫染色液革蘭氏碘液沙黃復(fù)染液或番紅染色液95%乙醇第九頁，共二十九頁，2022年，8月28日5、革蘭氏染色液配制5.1草酸銨結(jié)晶紫染液A液：結(jié)晶紫2g

，95%乙醇20mL。B液：草酸銨0.8g，

蒸餾水80mL

混合A液及B液，靜置48h后使用。第十頁，共二十九頁，2022年，8月28日5.2碘液配制

碘片1g，

碘化鉀2g

，蒸餾水300mL

配制方法：先將碘化鉀溶解在少量水中，再將碘片溶解在碘化鉀溶液中，待碘全溶后，加夠蒸餾水即可。第十一頁，共二十九頁，2022年，8月28日5.3番紅復(fù)染液配制番紅2.5g，

95%乙醇100mL

取上述配好的番紅乙醇溶液10mL與80mL蒸餾水混勻既成。第十二頁，共二十九頁，2022年，8月28日四、操作方法1、制片在干凈的載玻片上滴上一滴蒸餾水。用接種環(huán)進(jìn)行無菌操作，挑取培養(yǎng)物少許，置載玻片的水滴中，與水混合做成懸液并涂成直徑約1厘米的薄層。第十三頁，共二十九頁，2022年，8月28日為避免因菌數(shù)過多聚成團(tuán)，不利觀察個(gè)體形態(tài)，可在載玻片之一側(cè)再加一滴水，從已涂布的菌液中再取一環(huán)于此水滴中進(jìn)行稀釋，涂布成薄層。若材料為液體培養(yǎng)物或固體培養(yǎng)物沖洗下制備的菌液，則直接涂布于載玻片上即可第十四頁，共二十九頁，2022年，8月28日2、自然干燥涂片最好在室溫下使其自然干燥。有時(shí)為了使之干得更快些，可將標(biāo)本面向上，手持載玻片一端的兩側(cè)，小心地在酒精燈上高處微微加熱，使水分蒸發(fā)，但切勿緊靠火焰或加熱時(shí)間過長(zhǎng)，以防標(biāo)本烤枯而變形。第十五頁，共二十九頁，2022年，8月28日3、固定標(biāo)本干燥后即進(jìn)行固定，固定的目的：１）殺死微生物，固定細(xì)胞結(jié)構(gòu)。２）保證菌體能更牢的粘附在載玻片上，防止標(biāo)本被水沖洗掉。３）改變?nèi)玖蠈?duì)細(xì)胞的通透性，因?yàn)樗赖脑|(zhì)比活的原生質(zhì)易于染色。第十六頁，共二十九頁，2022年，8月28日手執(zhí)載玻片的一端（涂有標(biāo)本的遠(yuǎn)端），標(biāo)本向上。在酒精燈外焰盡快的來回通過3—4次，共約2—3秒鐘，并不時(shí)以載玻片背面加熱觸及皮膚，不覺過燙為宜（不超過60℃）,放置待冷后，進(jìn)行染色。第十七頁，共二十九頁，2022年，8月28日4、初染滴草酸銨結(jié)晶紫染1分鐘蒸餾水沖洗。第十八頁，共二十九頁，2022年，8月28日5、媒染加革蘭氏碘液染1分鐘蒸餾水沖洗，用吸水紙吸去水分。第十九頁，共二十九頁，2022年，8月28日6、脫色加95%酒精數(shù)滴，并輕輕搖動(dòng)進(jìn)行脫色，30秒后立即用蒸餾水沖洗。用吸水紙吸去水分。第二十頁，共二十九頁，2022年，8月28日7、復(fù)染蕃紅染色液（?。ɑ蛏滁S）復(fù)染液染1分鐘后，用蒸餾水沖洗，并自然干燥。鏡檢。

第二十一頁，共二十九頁，2022年，8月28日五、鏡檢及結(jié)果判定接通顯微鏡的電源，調(diào)節(jié)光線的強(qiáng)度。將載玻片放在載物臺(tái)上，調(diào)節(jié)鏡頭至油鏡鏡頭處，調(diào)節(jié)粗準(zhǔn)焦螺旋和細(xì)準(zhǔn)焦螺旋至清晰為止。觀察菌落形態(tài)及菌體的顏色。革蘭氏陽性菌染色呈紫色，革蘭氏陰性菌染色呈紅色。

第二十二頁，共二十九頁，2022年，8月28日六、革蘭氏染色圖片第二十三頁，共二十九頁，2022年，8月28日革蘭氏染色的大腸桿菌革蘭氏染色的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌第二十四頁，共二十九頁，2022年，8月28日革蘭染色的傷寒沙門菌革蘭染色的福氏志賀菌第二十五頁，共二十九頁，2022年，8月28日七、革蘭氏染色注意事項(xiàng)標(biāo)本涂片不能太厚，若涂片較厚，應(yīng)延長(zhǎng)脫色時(shí)間，直至不在出現(xiàn)紫色為止。染色過程中勿使染色液干涸。用水沖洗后，應(yīng)吸去玻片上的殘水。第二十六頁，共二十九頁，2022年，8月28日選用培養(yǎng)物時(shí)，G+菌培養(yǎng)12h-16h，G-培養(yǎng)24h。菌齡太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉(zhuǎn)呈陰性反應(yīng)。第二十七頁，共二十九頁，2022年，8月28日革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是脫色時(shí)間。如脫色過度，革