基因工程知識(shí)點(diǎn)總結(jié)歸納

基因工程緒論1、克隆clon：作名詞：含有目的基因的重組DNA性生殖。作動(dòng)詞：基因的分別和重組的過程。2基因工程〔geneengineerin：體外將目的基因插入病毒、質(zhì)粒、或其他載內(nèi)，且能穩(wěn)定的遺傳。供體、受體和載體是基因工程的三大要素。3、基因工程誕生的根底的雙螺旋構(gòu)造和半保存復(fù)制機(jī)理；60年月確定遺傳信息的遺傳方式。以密碼方式每三個(gè)核苷酸組成一個(gè)密碼子代表一個(gè)氨基酸。三大技術(shù)根底：限制性內(nèi)切酶的覺察；DNA連接酶的覺察；載體的覺察DNA片段進(jìn)出受體細(xì)胞；選：選擇基因；表達(dá)：目的基因的表達(dá)；基因工程的工具酶1、限制性內(nèi)切酶〔restrictionenzyme是一類能識(shí)別雙鏈DNA分子中某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶。2、限制酶的命名：屬名〔斜體〕+種名+株系+序數(shù)3、II型限制性內(nèi)切酶識(shí)別特定序列并在特定位點(diǎn)切割4、同裂酶：來源不同，其識(shí)別位點(diǎn)與切割位點(diǎn)均一樣的限制酶。5、同尾酶：來源不同，識(shí)別的靶序列不同，但產(chǎn)生一樣的黏性末端的酶形成的位點(diǎn)不能被原來的酶識(shí)別。6、限制性內(nèi)切酶的活性：在適當(dāng)反響條件下，1小時(shí)內(nèi)完全酶解1ug特定的DNA底物，所需要的限制性內(nèi)切酶的量為1個(gè)酶活力單位。7、星號活性：轉(zhuǎn)變反響條件，導(dǎo)致限制酶的專一性和酶活力的轉(zhuǎn)變。8、DNADNA分子或閉合單9、S1核酸酶：特異性降解單鏈DNA或RNA。鏈的合成。11、DNA聚合酶：5’—3’聚合：除去3’端突起。補(bǔ)齊5’端突起。合成cDNA其次鏈。切口移位探針的制備。用途:用同位素標(biāo)記具5’端突起的DNA5’粘性末端。DNA序列測定。合成cDNA其次鏈。要用于PCR。12、主要修飾酶：堿性磷酸酶：除去核酸分子3’和5’端的磷酸基團(tuán)。T多聚核苷酸磷酸激酶：催化AT中的γ位的磷酸基轉(zhuǎn)移5-OH(3)末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶：在3’端高效添加脫氧核苷酸。分子克隆載體DNA片段插入并攜帶重組分子進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)展擴(kuò)增或表達(dá)的DNA分子。2、分子克隆載體的功能：為外源基因供給進(jìn)入受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)移力量為外源基因供給在受體細(xì)胞中復(fù)制或整合的力量3、載體的分類：按用途分：克隆載體、表達(dá)載體、整合載體λM13cosmid載體、phagemid載體；真核病毒載體4、載體的特點(diǎn)：至少有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，因而至少可在一個(gè)生物體中自主復(fù)制至少有一個(gè)克隆位點(diǎn)，可供外源DNA插入至少有一個(gè)標(biāo)記基因，以學(xué)問載體或重組DNA分子是否進(jìn)入受體細(xì)胞具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)入宿主細(xì)胞6、標(biāo)記基因的種類：抗性標(biāo)記基因；養(yǎng)分標(biāo)記基因；生化標(biāo)記基因；噬菌斑7、常用的遺傳標(biāo)記基因：四環(huán)素抗性基因〔T；氨芐青霉素抗性基因〔Ap；Cm〔Kan〔Neo〔葡萄糖苷酸酶基因〔Gu；熒光素酶基因；發(fā)光蛋白質(zhì)基因。8、按復(fù)制起點(diǎn)劃分克隆載體：質(zhì)粒復(fù)制型—復(fù)制起點(diǎn)來自質(zhì)?；蚓€粒體和葉綠體〔有低拷貝和高拷貝〕ARS復(fù)制型—染色體復(fù)制型〔一般拷貝數(shù)比較高〕RNA必需反轉(zhuǎn)錄為cDNA〔高拷貝〕混合復(fù)制型：不同種生物復(fù)制起點(diǎn)混合〔穿梭載體〕9、依據(jù)載體的分子生物學(xué)特性劃分：質(zhì)粒載體、病毒型載體、混合型載體10、依據(jù)載體功能分類：1〕一般型載體：至少有一個(gè)以上的克隆位點(diǎn)和兩個(gè)標(biāo)記基因。如PBR322和pUC載體2〕3類：Ⅰ型：轉(zhuǎn)錄起始區(qū)〔調(diào)控序列+啟動(dòng)子〕+終止子；Ⅱ型：轉(zhuǎn)錄起始區(qū)+翻譯起始區(qū)〔核糖體結(jié)合序列和起始密碼子〕+終止子；Ⅲ型:轉(zhuǎn)錄起始區(qū)+翻譯起始區(qū)+信號肽鏈編碼區(qū)+〔常稱之為表達(dá)分泌型載體〕失控型質(zhì)粒載體(Run-awayplasmidvector)：是一些低拷貝質(zhì)粒，其復(fù)制顯著變化。探針型載體：該類載體主要特點(diǎn)是含有一些特別的DNA序列，用于特定的爭論目的，如分別基因啟動(dòng)子、終止子、DNA復(fù)制起點(diǎn)等。定序型載體：主要用于核苷酸的序列測定整合型載體：主要用于基因治療，穩(wěn)定表達(dá)外源基因。9、標(biāo)記基因與拷貝的關(guān)系：假設(shè)標(biāo)記基因的表達(dá)效率較高，宿主細(xì)胞可能不大量基因，可降低該基因的表達(dá)效率。大腸桿菌分子克隆載體1、E.coli隆載體的種類質(zhì)粒載體—復(fù)制起點(diǎn)來自一些自然質(zhì)粒。噬菌體載體—λ，P1和M13、fd載體，復(fù)制起點(diǎn)來自噬菌體。COS質(zhì)粒載體—質(zhì)粒載體中插入λcos片段，以利于體外包裝噬粒載體〔phagemid〕—有質(zhì)粒和M13、fd的復(fù)制起點(diǎn)，以質(zhì)?；蚴删w方式復(fù)制。2、質(zhì)粒的特點(diǎn)：質(zhì)粒DNA的復(fù)制與染色體復(fù)制無關(guān)質(zhì)粒DNA以超螺旋形式存在質(zhì)粒DNA可以結(jié)合轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的不相容性和不相容群質(zhì)粒DNA的消退質(zhì)粒的整合3、大腸桿菌質(zhì)粒的復(fù)制：以RNAⅡ?yàn)橐锖铣桑琑NAⅠ與RNAⅡ結(jié)合可削減質(zhì)RNAⅠ復(fù)制起點(diǎn)上游一個(gè)核苷酸處G突變?yōu)門，使得拷貝數(shù)增多。4互干擾造成。：線性雙鏈DNA病毒，具有末端互補(bǔ)的12個(gè)核苷酸，感染細(xì)菌后粘端互補(bǔ)成雙鏈環(huán)狀。全長48.5kb。6、熱誘導(dǎo)表達(dá)：λclts857，可作為組件插入質(zhì)粒DNA內(nèi)。目的基因插在λclts8574230℃不表達(dá)。7、λ噬菌體載體的缺點(diǎn)：基因組太大；酶切點(diǎn)太多；野生型只能接納肯定長度的DNA。8、λ噬菌體載體的改造：切去非必需片段，加載目的基因增加標(biāo)記基因、COSλ的cos位點(diǎn)片段，雙cos載體比單cos載體易于重組。10、COSDNA分子可進(jìn)展體外包裝，并能感染大腸桿菌細(xì)胞；操作簡潔，易于轉(zhuǎn)化細(xì)胞；對重組DNA分子長度具有選擇性包裝。1〔phagemidM13或fd方向打算在噬菌體顆粒中形成正鏈還是負(fù)鏈?；虿僮鞯闹饕夹g(shù)原理1、核酸分別提取的原則：保證核算的一級構(gòu)造的完整性；排解其他分子的污染2、質(zhì)粒載體分別的關(guān)鍵：如何使質(zhì)粒與DNA與宿主染色體DNA分開DNA比染色體DNADNA體斷裂成片段，而質(zhì)粒DNA仍保持超螺旋構(gòu)型3、變性法提取質(zhì)粒DNA的原理：在變性條件〔堿性或高溫)下，線狀染色體DNA變性成為單鏈而完全分開，而cccDNA雖然互補(bǔ)鏈之間的氫鍵斷裂，但雙螺旋主鏈骨架仍彼此纏繞在一起。當(dāng)變性條件恢復(fù)時(shí)，質(zhì)粒DNA快速復(fù)性恢復(fù)自然構(gòu)型，染色體DNA難以復(fù)性，交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀構(gòu)造，與變性的蛋白質(zhì)和RNA纏繞在一起，通過離心沉淀下來，而質(zhì)粒DNA存在于上清液中。4、RNA分別純化的關(guān)鍵：防止內(nèi)外源RNase的作用的特點(diǎn)：抗酸抗堿；抗高溫嚴(yán)寒；抗變性劑，酶活性不需要關(guān)心因子，劑等。6、核酸的濃縮：沉淀法：可以除去溶液中某些可溶的鹽離子和雜質(zhì)。7、核酸凝膠電泳的根本原理：核酸分子中的磷酸基團(tuán)帶負(fù)電荷，在電場中將向量小的DNA，具有較嚴(yán)密的構(gòu)型，在凝膠中移動(dòng)快；反之，分子量大的DNA移動(dòng)慢。8、核酸凝膠電泳常使用溴酚藍(lán)作為指示劑、溴化乙錠作為染色劑9、脈沖場凝膠電泳原理：加在凝膠上至少有兩個(gè)電場方向，使得DNA分子要不DNA分子用于轉(zhuǎn)變泳動(dòng)方向的時(shí)間不同，則可以得到分別10、雙脫氧核苷酸終止法的原理：雙脫氧〔2”，3”〕2”脫氧核苷酸那樣直接摻入合成的A3OA鏈合成至此中斷。由于雙脫氧核苷酸在每個(gè)DNADNA片段測定出核苷酸序列每個(gè)體系中參加dNTP和一種雙脫氧核苷酸，DNA聚合酶定序反響，反響產(chǎn)物變性后電泳，凝膠枯燥，放射自顯影，依據(jù)條帶讀出堿基序列，再依據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則寫出DNA鏈的序列〔留意：要自己寫一個(gè)序列，然后寫上每個(gè)體系中消滅片段的序列，然后依據(jù)序列畫出電泳圖，考試考的可能性大，書上有步驟〕12、MaxamGilbert化學(xué)法原理：DNA鏈上的不同堿基可以和堿基修飾劑發(fā)生反響在堿性環(huán)境下硫酸二甲酯能使堿基GAGC和TC生1~2DNA分子經(jīng)凝膠電泳就可確定其核苷酸序列13、化學(xué)法測序的優(yōu)點(diǎn)、不需要模板、引物和DNA聚合酶。1Southern雜交SouthernblotDNA在原位變性，并從待測樣品中是否存在互補(bǔ)的核酸序列Southern雜交的一般步驟：DNA的制備→DNA酶切→電泳〔瓊脂糖凝膠電泳〕→DNA原位轉(zhuǎn)膜→探針雜交→放射自顯影→結(jié)果分析15、Northern雜交檢測的是RNA。步驟與southern類似，不需要酶切。16、Western蛋白質(zhì)SDS中轉(zhuǎn)移到一固檢測。主要用于基因表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)的檢測?！鶶DS-→電轉(zhuǎn)移至膜上→一抗的制備→一抗與膜結(jié)合〔1h〕→洗膜〔30min〕→二抗與膜的結(jié)合→洗膜→顯色反響→結(jié)果分析17、PCR反響體系：模板、引物、dNTP、buffer、taq酶、超純水。、引物設(shè)計(jì)的一般原則：引物的長度常為17至30個(gè)堿基；GC含量為40%至60%；Tm值高于55；兩條引物之間配對堿基數(shù)小于5；引物自身配對的堿基數(shù)小于3?；蛭膸斓慕?、基因組文庫：含有某種生物全部遺傳信息的重組DNA分子的克隆總和。2、建立基因組文庫的一般程序:載體DNA片段的制備：DNA分別，限制酶切割，脫磷酸化反響供體DNADNADNA片段。供體和載體DNA的連接:要留意混合的比率和濃度重組DNA分子的轉(zhuǎn)移和基因組文庫的擴(kuò)增基因組文庫質(zhì)量的評價(jià)：文庫規(guī)模、重組頻率3、利用λ載體構(gòu)建基因組文庫:載體DNA片段的制備的方法：左右臂DNA片段的獲得供體DNA片段的制備：限制酶局部酶切，機(jī)械剪切法重組DNA分子的形成：掌握混合的比率重組DNA分子的包裝：制備包裝物，然后進(jìn)展包裝基因組文庫的擴(kuò)增4、為提高文庫的質(zhì)量，實(shí)行以下措施:雙酶切載體產(chǎn)生不同末端以避開其自身形成串狀體供體DNA脫磷酸化以避開供體DNA間的連接導(dǎo)致重排載體和供體DNA末端修飾以避開上述兩種情形發(fā)生:載體補(bǔ)CT，供體補(bǔ)GA承受文庫快速構(gòu)建法以避開擴(kuò)增文庫時(shí)DNA喪失5、基因組文庫的載體可載入DNA大?。?〕質(zhì)粒最大15kb適合構(gòu)建cDNA文庫；亞克隆2〕噬菌體最大25kbcDNA文庫3〕COS質(zhì)粒30-45kb基因組文庫4〕噬粒最大12kbcDNA文庫5〕P170-90kb基因組文庫6〕BAC100-500kb基因組文庫7〕YAC250-1000kb基因組文庫DNA有效的篩選程序從眾多克隆中分別出含有目的基因的重組子，進(jìn)而獲得目的基因。鳥槍法適用于原核細(xì)菌目的基因的克隆分別。選含有目的基因的目的重組子。8、鳥槍法的改進(jìn):目的基因的酶切圖譜；在連接前將DNA片段進(jìn)展分級分別9、鳥槍法克隆基因的局限性：工作量較大，需要了解目的基因的背景學(xué)問不能獲得最小長度的目的基因不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子結(jié)果、cDNAmRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成cDNA后再重組和增值所產(chǎn)生的無性生殖系的總和。、cDNAcDNA均可獲得表達(dá)12、建立cDNA文庫的一般程序載體DNA片段的制備〔A〕RNA的分別制備雙鏈cDNA的合成：反轉(zhuǎn)錄法合成單鏈cDNA，堿解或酶解除去RNA合成其次鏈ds-cDNA與載體DNA相連：人工接頭、同聚物加尾、cDNA的定向插入染13、其次鏈合成的方法：自身引導(dǎo)法、置換合成法、引導(dǎo)合成法。前兩者5’端會(huì)有幾個(gè)堿基缺失。目的基因的分別和鑒定1、獲得基因的一般方法：化學(xué)合成法:主要用于較小基因的合成或需要轉(zhuǎn)變堿基半化學(xué)合成法：mRNA cDNA 加人工接頭或合成一段DNA 與載體相連、篩選法：用各種方法從基因文庫或cDNA文庫中選擇目的基因2、基因篩選的方法:1)遺傳互補(bǔ)法原理：當(dāng)一外源DNA片段引入一受體細(xì)胞后，假設(shè)受體細(xì)胞獲得某轉(zhuǎn)入外源DNA片段之后，涂布在合成培育基上可以生長；無某種表型的細(xì)胞會(huì)有性狀；某些產(chǎn)酶細(xì)胞則可能過量產(chǎn)酶。釀酒酵母MFα基因的篩選：基因組文庫DNA轉(zhuǎn)化釀酒酵母細(xì)胞在缺乏亮氨酸的培育基上培育能生長的重組子即含合成亮氨酸的基因分別目的基因。分別步驟：基因(基因組或cDNA)文庫→制備DNA樣品膜→與標(biāo)記探針雜交→DNA進(jìn)一步證明和鑒定：核酸序列分析，與蛋白質(zhì)一級3〕免疫法原理:外源DNA引入宿主細(xì)胞后表達(dá)出蛋白質(zhì)，以此蛋白質(zhì)為抗原與相基因。分別步驟:基因文庫→蛋白質(zhì)樣品膜制備→免疫法篩選→〔陽性克隆〕→進(jìn)一步證明：分別陽性克隆無細(xì)胞抽提物，作斑點(diǎn)印跡，western印跡免疫分析；分別重組DNA，檢測插入片段大小，測序等。染色體巡查法蛋白質(zhì)-DNA雜交法蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合法，即酵母雙雜交法原理：利用釀酒酵母的GAL4蛋白質(zhì)NUAS〔上游激活序列〕報(bào)告基因表達(dá)篩選目的基因的方法。GAL4蛋白質(zhì)基因是一個(gè)調(diào)控基因，掌握半乳糖利用酶類基因的表達(dá)，其5’端存在UAS。GAL端具有UAS-DNA結(jié)合域BC端具有轉(zhuǎn)錄激活構(gòu)造域A，這兩個(gè)構(gòu)造域可以單獨(dú)起作用。分別與兩個(gè)基因編碼序列融合，且兩種蛋白質(zhì)能相互作用，就可導(dǎo)致GAL-LacZ基因的表達(dá)。與BD融合的基因稱為釣餌基因，與AD融合的基因稱為目的基因。3、用于基因分別和鑒定的關(guān)心方法：抑制消減雜交法；差異雜交法；阻斷翻譯法；釋放翻譯雜交法植物基因工程1、植物組織培育技術(shù)：愈傷組織培育、細(xì)胞懸浮培育、原生質(zhì)體、植株再生注射法3〔kaHyBa〔BtGuGF、啟動(dòng)子〔CaMA)4、Ti質(zhì)粒有六個(gè)功能區(qū)：致瘤區(qū)：合成植物生長素和細(xì)胞分裂素冠癭堿合成區(qū)：參與冠癭堿合成冠癭堿分解區(qū)：參與冠癭堿分解Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移區(qū)(tra)：參與在不同農(nóng)桿菌中的接合轉(zhuǎn)移毒性區(qū)r：直接參與的轉(zhuǎn)移和插入植物染色體A復(fù)制區(qū)〔：參與i質(zhì)粒A復(fù)制5、將致瘤區(qū)替換成目的基因即可取出冠癭6、根瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的一般步驟：葉盤法：從植物葉片上用打孔器取假設(shè)干葉片→制備含有目的基因的Ti質(zhì)?！?4小時(shí)→將葉片轉(zhuǎn)移至篩選培育基上→誘導(dǎo)愈傷組織→誘導(dǎo)生根→移栽作物品種8、轉(zhuǎn)基因植物的問題：轉(zhuǎn)基因沉默：位置效應(yīng)、轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默、轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默。選擇基因安全性問題；對生態(tài)環(huán)境的影響動(dòng)物基因工程1、從遺傳學(xué)角度劃分：遺傳性動(dòng)物基因工程、非遺傳性動(dòng)物基因工程2、動(dòng)物基因工程載體具備的功能：為外源基因供給進(jìn)入受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)移力量為外源基因供給在受體細(xì)胞中復(fù)制或整合的力量為外源基因供給在受體細(xì)胞中擴(kuò)增和表達(dá)的力量3、動(dòng)物基因工程載體：質(zhì)粒型載體、病毒型載體、定向打靶載體〔基因敲除、基因下調(diào)〕4、哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞常見的遺傳選擇標(biāo)記：遺傳標(biāo)記編碼產(chǎn)物篩選藥物作用機(jī)理APH-氨基糖苷磷酸G418APH滅活G418轉(zhuǎn)移酶DHFR二氫葉酸復(fù)原氨甲喋呤DHFR突變體抗酶氨甲喋呤HPH-潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶潮霉素BHPH滅活潮霉素BTK-胸腺嘧啶核苷氨基喋呤TK合成TMP激酶XGPRT-黃嘌呤鳥嘌呤霉酚酸XGPRT 合成磷酸核糖轉(zhuǎn)移GMP酶ADA-ADA-腺嘌呤核苷脫腺嘌呤木酮ADA滅活Xyl-A氨酶糖苷5、基因轉(zhuǎn)移技術(shù)：物理轉(zhuǎn)染法：電擊法、顯微注射法、基因槍法、超聲波法化學(xué)轉(zhuǎn)染法：磷酸鈣法、脂質(zhì)體法、原生質(zhì)體法生物法：病毒感染法6、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備