色譜聯(lián)用技術-教學教材

色譜聯(lián)用技術-20162.實現(xiàn)在線聯(lián)用的關鍵

硬件接口（hardwareinterface）

用于協(xié)調(diào)聯(lián)用的兩種儀器的輸出和輸入之間的矛盾，使兩種儀器連接成一個整體。3.色譜聯(lián)用技術發(fā)展現(xiàn)狀色譜：分離光譜：結(jié)構(gòu)鑒定兩者聯(lián)用，不僅可以對混合物中的各未知組分進行定性，也可用于定量分析。GC-MS,GC-FTIR,LC-MS,LC-FTIR,LC-NMR,LC-ICP-AES…7.2氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用

GC-MS

1.氣相色譜與“四譜”工作條件的適應性2、氣質(zhì)聯(lián)用接口（協(xié)調(diào)輸出/輸入的矛盾）工作氣壓不匹配是實現(xiàn)GC－MS聯(lián)用的主要困難。GC柱的輸出為100kPa，而MS離子源在小于10－3Pa的條件下工作。接口的作用是將GC流出的載氣氣壓降低到MS能夠接受的程度，并將樣品送入MS離子源接口的類型噴射式分子分離器，早期，適合于填充柱；通過傳輸線直接連接，適合于毛細管柱。噴射式分子分離器的結(jié)構(gòu)作用：①降低氣壓；②濃縮樣品。出口氣相色譜高真空泵傳輸線化學工作站軟件（計算機）離子源質(zhì)量分析器機械泵檢測器質(zhì)譜3.儀器結(jié)構(gòu)GC-MS組成：

GC：低流失毛細管柱載氣必須用>99.999%的氦氣

離子源：電子轟擊源、化學電離源

MS：四極桿質(zhì)譜儀、離子阱、飛行時間質(zhì)譜儀

接口：細口徑毛細管柱——通過傳輸線直接連接粗口徑——分流

數(shù)據(jù)系統(tǒng)：計算機數(shù)據(jù)庫

真空系統(tǒng)：分子渦輪泵4、質(zhì)量分析器四極桿質(zhì)量分析器飛行時間質(zhì)量分析器離子阱質(zhì)量分析器磁質(zhì)量分析器傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)量分析器多個質(zhì)量分析器的串聯(lián)（串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用）1.四極桿質(zhì)量分析器

（QuadrupoleMassFilter）+ElectronBeamABCSampleinIonBeam對于給定的直流DC和射頻電壓RF

，特定質(zhì)荷比的離子在軸向穩(wěn)定運動，其他質(zhì)荷比的離子則與電極碰撞湮滅。將DC和RF以固定的斜率變化，實現(xiàn)質(zhì)譜掃描功能。

特點：

（1）結(jié)構(gòu)簡單，體積小，價格便宜

（2）掃描速度快，與色譜出峰速度匹配，適合聯(lián)用

（3）可串聯(lián)使用

（4）無需狹縫分離，靈敏度高

（5）質(zhì)量分辨率不高(小數(shù)點后1位）

（6）檢測的m/z范圍小2.離子阱質(zhì)量分析器(iontrap)特定m/z離子在阱內(nèi)一定軌道上穩(wěn)定旋轉(zhuǎn)，改變端電極電壓，不同m/z離子飛出阱到達檢測器；特點：

（1）結(jié)構(gòu)簡單，體積小，價格低

（2）掃描速度快，與色譜出峰速度匹配，適合聯(lián)用

（3）自身可做多級，有利于定性

（4）質(zhì)量分辨率6000-9000（5）檢測的m/z范圍小3.飛行時間質(zhì)量分析器(TOF)具有相同動能、不同質(zhì)量的離子，其飛行速度不同而分離。如果固定離子飛行距離，則不同質(zhì)量離子的飛行時間不同，質(zhì)量小的離子飛行時間短而首先到達檢測器。特點：

（1）結(jié)構(gòu)簡單，體積較大，價格略貴

（2）掃描速度快，與色譜出峰速度匹配，適合聯(lián)用

（3）靈敏度高（4）質(zhì)量分辨率高（5）檢測質(zhì)量無上限氣相色譜-四極桿質(zhì)譜儀4.氣質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)提供的信息GC-MS-Computer的工作過程：GC：各組分被色譜柱分離，隨時間變化依次從柱子流出，通過接口進入MS。MS：連續(xù)掃描MS圖，每掃描一張MS圖需花費約零點幾到幾秒鐘?？倰呙钑r間＝(掃一張圖譜的時間)×掃描次數(shù)計算機：將得到的所有MS數(shù)據(jù)存儲起來，供下一步的處理和輸出。(1)總離子流圖（TIC）質(zhì)譜儀檢測到的所有離子信號（不分其質(zhì)荷比）的總和對時間t作圖相當于氣相色譜圖。沒有組分通過時為基線；當組分流出時，即出現(xiàn)峰。記錄方法：TIC檢測器；計算機采集和存儲連續(xù)、重復掃描的信息，然后進行數(shù)據(jù)處理。TIC圖中的每一個峰代表一個組分；峰的位置就是該組分的色譜保留時間；峰面積與組分的相對含量有關。某種天然蠟質(zhì)衍生物的GC－MS總離子流圖(2)每個組分的質(zhì)譜圖可從質(zhì)譜圖獲得組分的分子量和分子結(jié)構(gòu)信息。譜庫檢索根據(jù)NIST，INCOS，PBM三種算法，將未知物圖譜與譜庫中的標準圖譜比較，匹配度越高，可信度越高88101396序號 化合物名稱 序號 化合物名

1 十六碳酸 12 二十九碳烷

29,12-十八碳二烯酸 13 三十碳烷

3 十八碳酸 14 二十六醇乙酸酯

4 二十四碳烷 15 三十一碳烷

5 二十醇乙酸酯 16 結(jié)構(gòu)未定*

6 二十五碳烷 17 三十二碳烷

7 二十六碳烷 18 二十八醇乙酸酯

8 二十二醇乙酸酯 19結(jié)構(gòu)未定*

9 二十七碳烷 20 三十四碳烷 10 二十八碳烷 21 三十醇乙酸酯 11 二十四醇乙酸酯 22～25 結(jié)構(gòu)未定* 由GC－MS確定的某天然蠟衍生物的成分(3)質(zhì)量色譜圖（提取離子流圖）以指定質(zhì)荷比的離子強度（而不是總的離子流強度）對時間t（或掃描號）作圖。是計算機進行數(shù)據(jù)處理得到的圖。優(yōu)點：可在復雜混合物的TIC圖中,迅速找到所需檢測的化合物或同系物。某天然蠟衍生物的總離子流圖和質(zhì)量色譜圖（用于尋找一類成分）1.02.03.04.001020304050607080901001.02.03.04.05.06.00102030405060708090100質(zhì)量色譜圖總離子流圖（用于尋找微量成分）5.GC-MS的應用

凡是能用氣相色譜分析的試樣，均適合于GC-MS分析，如環(huán)境污染物的分析香精、香料的成分分析和質(zhì)量評價中草藥的揮發(fā)性成分鑒定藥物及其他化工產(chǎn)品的分析毒物、毒品及違禁藥物的鑒定和檢測等等。（1）GC-MS定性分析分析條件的設定

GC條件：同普通CGCMS條件：掃描方式，掃描范圍，掃描速度,燈絲電流，倍增器電壓等定性分析

進樣，電離，質(zhì)譜數(shù)據(jù)的采集，譜圖檢索GC-MS定量分析依據(jù)用總離子色譜圖定量用質(zhì)量色譜圖（提取離子色譜圖）定量用選擇離子色譜圖定量（SIM，選擇離子監(jiān)測）

對串聯(lián)質(zhì)譜還可以用MRM（SRM，反應離子監(jiān)測）定量優(yōu)缺點…GC-MS定量分析方法：內(nèi)標法，外標法，歸一化

（2）GC-MS定量分析有機氯農(nóng)藥的GC-MS總離子流圖7.3液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術

LC-MS一、實現(xiàn)LC-MS的困難

1.LC流動相對MS工作條件的影響1ml溶劑氣化生成500-1300ml的蒸氣，而質(zhì)譜儀只能接受10ml/min氣體流量。有時流動相中含難以揮發(fā)的緩沖鹽2.質(zhì)譜離子源溫度、電離方式不適宜液相色譜所分析的樣品。二、接口系統(tǒng)1.脫溶劑2.使被測物電離1.粒子束接口（Particle-Beam,PB）根據(jù)流體力學原理，利用樣品與溶劑動量的不同將它們分開形成氣溶膠→脫溶劑→動量分離得到的譜圖與電子轟擊質(zhì)譜圖非常相似，可利用標準譜圖檢索現(xiàn)少使用EIPB2.電噴霧電離（ESI，接口+軟電離技術）RayleighLimitReached++++++++++-----++++++++++-----++++++--++++++--Evaporation++ChargedDroplets試樣離子準分子離子AnalyteIonsSolventIonClustersSalts/IonpairsNeutrals++++++++--其他離子電噴霧電離，Electrospray流出液在高電場下形成帶電噴霧，在電場力作用下穿過氣簾。氣簾的作用：霧化；蒸發(fā)溶劑；阻止中性溶劑分子特點：是LC-MS的基本配置接口是一種軟電離方式，適合穩(wěn)定性差、極性大、分子量大的物質(zhì)的電離。主要生成準分子離子（[M+H]+、[M-H]-、[M+Na]+等），生物大分析產(chǎn)生多電荷離子。靈敏度高不能進行譜庫檢索不適用于非極性化合物的分析對于大分子化合物，電噴霧產(chǎn)生多電荷離子，相對分子質(zhì)量Mr計算方法如下：選相鄰峰，電荷n，n+1m1=(Mr+n+1)/(n+1)m2=(Mr+n)/n分子量約為12200的細胞色素的ESI質(zhì)譜圖3.大氣壓化學電離(AtmosphericPressureChemicalIonization,APCI)電離主要生成溶劑離子樣品分子與溶劑離子反應生成離子簇離子去簇后送到質(zhì)譜計中MS放電針噴霧LC熱噴霧(100-120C)，化學電離;適用于弱極性和熱穩(wěn)定化合物分析.特點：化學電離，軟電離技術，產(chǎn)生的碎片很少適用于弱極性、分子量小（<2000Da）和熱穩(wěn)定化合物分析靈敏度高

ESI的補充技術ESIAPCI硬件毛細管有幾千伏高壓放電針

電離液滴中的離子蒸發(fā)類似于化學電離原理屬于液相電離屬于氣相電離應用*適合的LC流速為

0.2～2ml/min0.2～0.3ml/min*極性和離子化合物極性較小的化合物*可產(chǎn)生多電荷離子產(chǎn)生單電荷離子

LC-MS(四極桿)聯(lián)用儀器結(jié)構(gòu)示意圖LC-MS(離子阱)聯(lián)用儀器結(jié)構(gòu)示意圖醫(yī)藥、臨床：藥物代謝、藥物動力學、雜質(zhì)分析、天然產(chǎn)物分析、疾病診斷生物化學：肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸、糖環(huán)境化學：農(nóng)藥和農(nóng)殘分析、有機污染物、土壤/食品/水分析食品科學：香料、添加物、包裝物、蛋白質(zhì)、致癌物化學：有機合成物三、液質(zhì)聯(lián)用的應用%%MultiView--?1996,SCIEX,adivisionofMDSHealthGroup.%%Originalconcept:%Dr.RonBonner%Dr.LyleBurton%%Development:%Dr.LyleBurton%YvesLegault%ShengpingMa%%Withthehelpof:%Dr.VictoriaBarclay%ScottChamp%RobMcDermid%%%MultiView--?1996,SCIEX,adivisionofMDSHealthGroup.%%Originalconcept:%Dr.RonBonner%Dr.LyleBurton%%Development:%Dr.LyleBurton%YvesLegault%ShengpingMa%%Withthehelpof:%Dr.VictoriaBarclay%ScottChamp%RobMcDermid%%%MultiView--?1996,SCIEX,adivisionofMDSHealthGroup.%%Originalconcept:%Dr.RonBonner%Dr.LyleBurton%%Development:%Dr.LyleBurton%YvesLegault%ShengpingMa%%Withthehelpof:%Dr.VictoriaBarclay%ScottChamp%RobMcDermid%.2468101214Time,min200400600800100012001400160018002000220024002600Intensity,cpstanshinoneItanshinoneIIAcryptotanshinonedihydrotanshinoneTICSpectrumofFourDiterpenoidsofRadixSalviaeMiltiorrhizae丹參中四種丹參酮的lc-ms-ms測定LC-MS-MSMRMChromatogramsofRadixSalviaeMiltoirrhizaeSample反應離子監(jiān)測7.4高效液相色譜-核磁共振聯(lián)用技術LC-NMR一、HPLC與NMR的比較及聯(lián)用的困難

HPLCNMR分析對象

有機物樣品狀態(tài)

液態(tài)操作溫度

室溫掃描時間

大體相同操作方式連續(xù)流動間歇靈敏度

g～ngmg溶劑普通氘代溶劑二、問題的解決

主要取決于核磁共振技術的提高和發(fā)展（1）靈敏度儀器方面高頻儀器的使用：NMR的信噪比與磁場強度的平方成正比，800MHz(18.79T)與100MHz(2.35T)儀器相比，信噪比增大約64倍。用新技術提高信噪比：軟件濾波，消噪技術

操作參數(shù)的影響提高LC柱的負載量內(nèi)徑4.6mm色譜柱，合適的負載量為100g。采用停流技術增加檢測的有效時間（多次掃描累積）。把射頻線圈直接繞在流通池壁上，減少死體積。（2）溶劑使用氘代溶劑使用脈沖序列等溶劑抑制技術采用WET序列進行溶劑峰抑制的實例乙腈溶劑峰三、聯(lián)用方式實驗布局泵、注入閥、色譜柱和紫外檢測器組成的LC系統(tǒng)，通過一條2-2.5m的特制毛細管連接到NMR液相探頭上，探頭底部有閥控制NMR測定方式。

液相探頭帶有一個流動腔；射頻發(fā)射線圈垂直固定在流動腔的玻璃管上；接受線圈平行于玻璃管；流動腔不能旋轉(zhuǎn)，NMR測定分辨率較差。聯(lián)用模式

連續(xù)流動模式LC的載液帶著試樣組分連續(xù)不斷流入NMR的流動腔，NMR儀器用溶劑峰抑制技術采集NMR譜圖，得到化學位移－LC保留時間的假二維譜。得到的譜圖分辨率和信噪比差。停流技術（時間切割譜）當色譜峰的最高點到達流動腔的檢測位置時，關閉液相探頭底部的進口閥，同時LC的泵停止工作，NMR進行采樣直到獲得滿意的譜圖。

峰存儲模式(peakparking)

實際上是一種離線模式。由LC流出的峰存儲在毛細管回路中，然后通過適當?shù)拈y系統(tǒng)依次送入NMR探頭中進行NMR測定，LC分析過程不中斷。體系中有三個閥，12個存儲峰的毛細管回路，整個過程由計算機控制。

峰存儲模式三種聯(lián)用模式的比較流動模式：靈敏度和信噪比差，適合于測定富核，如1H、19F、31P和富集的13C、15N；對1H最小檢測量（16次累加）為10g（500MHz），30g（300MHz）；停流模式：有較好的靈敏度，可測1H、13C、15N等。最小檢測量1H為1g；峰存儲模式：與停流模式類似。應用實例耐哌地爾雜質(zhì)的檢測7.5色譜-傅立葉變換紅外光譜聯(lián)用(GC-FTIR)1.GC-FTIR聯(lián)用概述（1）GC-IR聯(lián)用的作用MS一般難于區(qū)分同分異構(gòu)體，IR是很好的補充。（2）實現(xiàn)GC-IR的困難

掃描速度、靈敏度、物理狀態(tài)均不匹配

（3）解決方法

FTIR：具有信噪比好、掃描速度快等優(yōu)點，與GC的匹配性大大提高。

物理狀態(tài)：測氣體紅外。2.GC-FTIR系統(tǒng)FT－IR光學臺數(shù)據(jù)系統(tǒng)GCMCT檢測器GC－FT系統(tǒng)的示意圖光管GC-FTIR接口示意圖接口--光管用硼硅玻璃制成；兩端裝有KBr鹽窗，紅外干涉光可以通過；內(nèi)壁鍍金，有高的反射率，紅外干涉光在其中多次反射，增加光程以提高靈敏度；可加熱，保證GC流出物不在此冷凝；適當?shù)娜莘e，以獲得最佳分辨率和靈敏度；尾吹裝置：用以解決毛細管GC柱與傳輸線（i.d.2mm）、光管(1mm)中線速變化的問題。即柱外效應的問題3.GC-FTIR提供的信息(1)三維實時顯示圖波數(shù)時間吸光度(2)化學圖（Chemigram）(官能團色