轉(zhuǎn)錄組測序原理說課講解

轉(zhuǎn)錄組測序原理主要內(nèi)容樣品檢測文庫制備ClusterStationIlluminaSequencing生物信息分析TotalRNA樣品檢測

Agilent2100檢測OD260/280:1.8~2.2RNA28S:18S≥1.0;RIN≥7

檢測報(bào)告-合格樣品檢測報(bào)告-不合格樣品主要內(nèi)容樣品檢測文庫制備ClusterStationIlluminaSequencing生物信息分析第一天消化DNAmRNA的分離mRNA的打斷cDNA的合成↓↓第二天末端修復(fù)↓↓加接頭膠回收3’端加A第三天PCRPCR膠回收↓↓文庫制備↓↓真核mRNA的純化mRNA的純化主要通過磁珠吸附原理從而分離純化Oligo（dT）25磁珠純化原理主要是mRNA的3′的polyA與磁珠在bindingbuffer的作用下相結(jié)合。磁珠通過MPC（磁分離器）從溶液中分離出來。mRNA與磁珠結(jié)合后，再用Tris-HCL在加熱條件下解離洗脫到溶液中。原核mRNA的純化AmbionMICROExpressKitmRNA反轉(zhuǎn)錄純化過的mRNA樣品加入1μl的fragmentbuffer70℃作用1.5min。加入1μl的stopbuffer終止反應(yīng)。加入沉淀劑（NaAc糖原無水乙醇）沉淀酶切產(chǎn)物。末端修復(fù)cDNA3′末端加AAdapter連接不同方法比較主要內(nèi)容樣品檢測文庫制備ClusterStationIlluminaSequencing生物信息分析主要內(nèi)容樣品檢測文庫制備ClusterStationIlluminaSequencing生物信息分析新一代測序技術(shù)ReadLengthRunTimeOutput1×35bp~1.5days26-35Gb2×35bp~4days75-100Gb2×100bp~8days150-200GbThroughput:upto25GbperdayCTAGCTA5’-3’-…-5’GT

合成第一個(gè)堿基Cycle1:按順序加入反應(yīng)試劑

清除未反應(yīng)的堿基和試劑

激發(fā)堿基熒光并收集熒光信號去除阻斷基團(tuán)和熒光基團(tuán)Cycle2-n: 重復(fù)前面的步驟GTCTAGTCTGCTAGA基于SBS測序技術(shù)OHFlowCell接頭diol

P7

P5

dioldiol模板雜交dioldiol延長dioldiol

變性堿基片段雜交Clusterstation剩下的復(fù)制鏈其一端“固定”在芯片上，另外一端隨機(jī)和附近的另外一個(gè)引物互補(bǔ)，被“固定”住，形成“橋”(bridge)。形成的單鏈橋，以周圍的引物為擴(kuò)增引物，在芯片表面進(jìn)行擴(kuò)增，形成雙鏈。雙鏈經(jīng)變性成單鏈，再次形成橋，并作為下一輪擴(kuò)增的模板繼續(xù)擴(kuò)增反應(yīng)。反復(fù)若干輪擴(kuò)增，每個(gè)單分子得到了大量擴(kuò)增，成為單克隆“DNA簇群”。主要內(nèi)容樣品檢測文庫制備ClusterStationIlluminaSequencing生物信息分析生物信息分析基本信息分析數(shù)據(jù)量產(chǎn)出：>2Gbpersample測序策略：HiSeq2000,PE91

or101插入片段大?。?00bps

測序質(zhì)量控制：Q20%>80有參考基因組序列生物信息分析基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化鑒定基因可變剪接預(yù)測新轉(zhuǎn)錄本SNP分析基因融合鑒定有參考基因組序列信息分析流程Reads在基因組上的分布基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化(Nagalakshmi,U.etal.,2008)通過轉(zhuǎn)錄組測序鑒定出酵母3’和5’UTR區(qū)域

鑒定基因可變剪接exon1exon2exon3exon1exon2exon3exon1exon3commonreadsjunctionreadsmRNA鑒定融合基因新轉(zhuǎn)錄本預(yù)測GenomicintergenicregionReadsclusterPairedReadsdistributionPaired-End(PE)ReadsNEngJMed2009SNP分析DeepRNAsequencingatsinglebase-pairresolution

revealshighcomplexityofthericetranscriptomeGenomeRes2010RiceTranscriptomeMaterial

callus

rootatseedlingstage（14d）

shootatseedlingstage（14d）

flagleaves（2stages）

panicle（3stages）Methods

RNASeq（paired-end&singleend）

DGE

smallRNA（18-30nt）基因功能注釋基因結(jié)構(gòu)分析鑒定出大量新轉(zhuǎn)錄本可變剪接鑒定基因融合鑒定無參考基因組生物信息分析Unigene功能注釋Unigene的GO分類Unigene代謝通路分析預(yù)測編碼蛋白框（CDS）Unigene表達(dá)差異分析Unigene在樣品間的差異GO分類和Pathway富集性分析Denovoreads組裝流程UnigeneGO分類UnigeneCOG功能分類基因表達(dá)差異分析N1:totaltagNumberinsampleAN2:totaltagNumberinsampleBX:GeneexpressionlevelinsampleAy:GeneexpressionlevelinsampleBReference:AudicS.etal.Thesignificanceofdigitalgeneexp