第十五章色譜法導(dǎo)論

周口師范學(xué)院·化學(xué)系授課老師：劉增臣AnalyticalChemistry分析化學(xué)（儀器分析）1課程內(nèi)容解析第一章緒論第三章光學(xué)分析法導(dǎo)論第四章原子發(fā)射光譜法第五章原子吸收與原子熒光光譜法第六章分子發(fā)光分析法第七章紫外-可見吸收光譜法第八章紅外吸收光譜法第九章核磁共振波譜法第十章質(zhì)譜分析法第十一章電分析化學(xué)導(dǎo)論第十二章電位分析法第十三章電解及庫侖分析法第十四章極譜法與伏安法第十五章色譜法導(dǎo)論第十六章氣相色譜法第十七章高效液相色譜法第十八章其它儀器分析方法

光學(xué)分析電學(xué)分析分離分析其他分析

質(zhì)譜分析（其他分析）2第十五章色譜法導(dǎo)論第一節(jié)色譜基本概念第二節(jié)色譜理論基礎(chǔ)第三節(jié)色譜定性定量分析3概述

色譜法又稱色層法或?qū)游龇?，是一種比萃取、蒸餾等更高效、應(yīng)用更廣泛的分析技術(shù)。

色譜法早在1906年由俄國植物學(xué)家Tswett分離植物色素時采用。

他在研究植物葉的色素成分時，將植物葉子的萃取物倒入填有碳酸鈣的直立玻璃管內(nèi)，然后加入石油醚使其自由流下，結(jié)果色素中各組分互相分離形成各種不同顏色的譜帶。這種方法因此得名為色譜法。以后此法逐漸應(yīng)用于無色物質(zhì)的分離，“色譜”二字雖已失去原來的含義，但仍被人們沿用至今。4

在色譜法中，將填入玻璃管或不銹鋼管內(nèi)靜止不動的一相（固體或液體）稱為固定相

；

自上而下淋洗運動的一相（一般是氣體或液體）稱為流動相

；

裝有固定相的管子（玻璃管或不銹鋼管）稱為色譜柱。5ts6色譜法的實質(zhì)色譜法的實質(zhì)是一種物理化學(xué)分離分析方法?；诨旌衔镏懈鹘M分在互不相容的兩相中，具有不同的分配系數(shù)，當(dāng)兩相做相對運動時，混合物各組分在兩相間進行反復(fù)多次的分配。這樣就使得那些分配系數(shù)只有微小差別的組分在移動速率上產(chǎn)生差別，從而得到分離。7色譜法的分類1.按兩相物理狀態(tài)分類

氣固色譜(GSC)、氣液色譜(GLC)、液固色譜(LSC)、液液色譜(LLC)2.按固定相的固定方式狀態(tài)分類

(1)柱色譜：填充柱色譜和毛細管柱色譜--固定相安裝在柱內(nèi)或柱壁上。(2)薄層色譜：將固定相涂在玻璃板或塑料板上。

(3)紙色譜：用濾紙做固定相或固定相載體。

83.按分離機理分類(1)吸附色譜：利用吸附劑對不同組分的吸附性能的差別而進行分離(2)分配色譜：利用不同組分在兩相間的分配系數(shù)的差別而進行分離(3)其他：離子交換色譜，凝膠色譜，離子對色譜，配合色譜，親和色譜。4.其它色譜類型

基于色譜過程的特殊物化原理或特殊的操作方式等，色譜法還有其他一些特殊類型，如化學(xué)鍵合色譜、制備色譜、裂解色譜、二維色譜等。9色譜的發(fā)展從Tewett建立色譜法至今，色譜法已成為專門的學(xué)科。1952

James和Martin發(fā)展了氣相色譜；是色譜法的革命性進展。1967

Kirkland等研制高效液相色譜法；再一次推動了色譜法的發(fā)展。10色譜法的特點1.分離效率高，可用于分離復(fù)雜化合物2.靈敏度高，可以檢測到ug/g至ng/g級的物質(zhì)含量。3.分析速度快4.應(yīng)用范圍廣：氣相色譜--沸點低于400度；液相色譜--高沸點、熱不穩(wěn)定、生物試樣。5.不足：被分離組分的定性問題11第一節(jié)色譜基本概念一、色譜分離過程AB兩組分吸附能力和分配系數(shù)的差別，導(dǎo)致兩組分在柱中移動速率不同，經(jīng)過數(shù)次吸附(分配)，組分逐漸分開，先后進入檢測器檢測。12

13二、色譜常用術(shù)語1.色譜圖

色譜柱中的流出物通過檢測器產(chǎn)生的信號對時間（或流動相體積）的曲線在適當(dāng)?shù)纳V條件下，每個組分對應(yīng)的色譜峰一般呈正態(tài)分布，色譜圖是定性、定量和評價色譜分離情況的基本依據(jù)。142.基線

色譜柱中只有載氣無樣品通過時，檢測器響應(yīng)信號反應(yīng)的是系統(tǒng)噪音隨時間變化的線稱為基線。在實驗條件穩(wěn)定時，基線是一條直線。3.峰高

色譜峰最高點與基線之間的距離4.區(qū)域?qū)挾?/p>

色譜峰的區(qū)域?qū)挾仁巧V流出曲線的重要參數(shù)之一，用于衡量柱效率及反映色譜操作條件的動力學(xué)因素。表示色譜峰區(qū)域?qū)挾韧ǔＳ腥N方法。信號進樣空氣峰ha色譜流出曲線色譜峰151.標(biāo)準(zhǔn)偏差---即0.607倍峰高處色譜峰寬的一半(高斯曲線)。2.半峰寬Y1/2---即峰高一半處對應(yīng)的峰寬。它與標(biāo)準(zhǔn)偏差的關(guān)系為

Y1/2=2.3543.峰底寬度Y---即色譜峰兩側(cè)拐點上的切線在基線上截距間的距離。它與標(biāo)準(zhǔn)偏差的關(guān)系是

Y=4165.保留值試樣各組分在色譜柱中保留行為的量度，反映了組分與固定相間作用力大小，通常用保留時間和保留體積表示?？梢越沂旧V過程的作用機理和分子的結(jié)構(gòu)特征。(1)保留時間tR

試樣從進樣到柱后出現(xiàn)峰極大點時所經(jīng)過的時間，稱為保留時間，是色譜定性的依據(jù)。信號進樣tR17(2)死時間t0

不被固定相吸附或溶解的物質(zhì)進入色譜柱時，從進樣到出現(xiàn)峰極大值所需的時間稱為死時間，它正比于色譜柱的空隙體積，如下圖。信號進樣tM(3)調(diào)整保留時間tR′

某組分的保留時間扣除死時間后，稱為該組分的調(diào)整保留時間，即組分在固定相中停留的時間。即tR′=tRt0

18(4)保留體積VR

指從進樣開始到被測組分在柱后出現(xiàn)濃度極大點時所通過的流動相的體積。保留時間與保留體積關(guān)系：

VR=tR

qo(色譜柱出口的載氣流量)(5)死體積V0

指色譜柱在填充后，柱管內(nèi)固定相顆粒間所剩留的空間、色譜儀中管路和連接頭間的空間以及檢測器的空間的總和。當(dāng)后兩項很小可忽略不計時，死體積可由死時間與色譜柱出口的載氣流速qo（cm3·min-1）計算。(6)調(diào)整保留體積VR

某組分的保留體積扣除死體積后，稱為該組分的調(diào)整保留體積。

VR=VR

V0=tR

qo

19(7)相對保留值r2,1(選擇性因子α)

某組分2的調(diào)整保留值與組分1的調(diào)整保留值之比，稱為相對保留值。

r2,1=tR2/tR1′=VR2/VR1

由于相對保留值只與柱溫及固定相性質(zhì)有關(guān)，而與柱徑、柱長、填充情況及流動相流速無關(guān)，因此，它在色譜法中，特別是在氣相色譜法中，廣泛用作定性的依據(jù)。(8)保留指數(shù)Ix

1958年，Kovats提出用正構(gòu)烷烴系列作為度量被測物質(zhì)的相對保留值的標(biāo)準(zhǔn)，引進了保留指數(shù)的概念。是色譜定性的指標(biāo)。20

正構(gòu)烷烴的保留指數(shù)定義為100z，z為其碳數(shù)。在相同的色譜條件下測定被測組分及兩個相鄰(間隔)正構(gòu)烷烴的調(diào)整保留時間216.分配系數(shù)K

它（K）是指在一定溫度和壓力下，組分在固定相和流動相之間分配達平衡時的濃度之比值，即

K=溶質(zhì)在固定相中的濃度/溶質(zhì)在流動相中的濃度

=ρs/ρm

7.分配比k

分配比又稱容量因子，它是指在一定溫度和壓力下，組分在兩相間分配達平衡時，分配在固定相和流動相中的物質(zhì)的質(zhì)量之比。即

k=組分在固定相中的物質(zhì)的量/組分在流動相中的物質(zhì)的量

=ms/mm

22分配系數(shù)與分配比之間的關(guān)系K=ρs/ρm=

=k.

(相比)8.保留值與分配系數(shù)K及分配比k

的關(guān)系

保留體積與熱力學(xué)平衡常數(shù)之間K的關(guān)系VR=V0+KVsVR=V0（1+k）

tR=t0（1+k）

r2,1=tR2/tR1′=K2/K1=k2/k1

分配系數(shù)和分配比都與組分及固定液的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)，并隨柱溫、柱壓的變化而變化，分配系數(shù)與兩相體積無關(guān)，分配比則隨著固定液的量而變化，k值越大，組分在固定液中的量越多，相當(dāng)于柱的容量越大。23第二節(jié)色譜理論基礎(chǔ)色譜分離的條件：1.兩相鄰組分保留值存在一定差別，即洗出兩個色譜峰具有足夠的距離。受色譜熱力學(xué)控制(塔板理論)。2.色譜峰區(qū)域?qū)挾纫?。受色譜動力學(xué)控制(速率理論)。一、塔板理論最早由英國生物學(xué)家Martin提出。把色譜柱比作一個精餾塔，沿用精餾塔中塔板的概念來描述組分在兩相間的分配行為，同時引入理論塔板數(shù)作為衡量柱效率的指標(biāo)，即色譜柱是由一系列連續(xù)的、相等的水平塔板組成。每一塊塔板的高度用H表示，稱為塔板高度，簡稱板高。

2425塔板理論假設(shè)：1.在柱內(nèi)一小段長度H內(nèi)，組分可以在兩相間迅速達到平衡。

這一小段柱長稱為理論塔板高度H。2.以氣相色譜為例，載氣進入色譜柱不是連續(xù)進行的，而是脈動式，每次進氣為一個塔板體積（ΔVm）。3.所有組分開始時存在于第0號塔板上，而且試樣沿軸（縱）向擴散可忽略。4.分配系數(shù)在所有塔板上是常數(shù)，與組分在某一塔板上的量無關(guān)。

簡單地認為：在每一塊塔板上，溶質(zhì)在兩相間很快達到分配平衡，然后隨著流動相按一個一個塔板的方式向前移動。對于一根長為L的色譜柱，溶質(zhì)平衡的次數(shù)應(yīng)為：

n=L/H

n稱為理論塔板數(shù)。與精餾塔一樣，色譜柱的柱效隨理論塔板數(shù)n的增加而增加，隨板高H的增大而減小。26n與半峰寬及峰底寬的關(guān)系式為：

n=5.54(tR/W1/2)2=16(tR/Wb)2

組分的保留時間越長，峰形越窄，則理論塔板數(shù)n越大，色譜柱效能越高。

計算出來的的n和H值有時并不能充分地反映色譜柱的分離效能，因為采用tR計算時，沒有扣除死時間tM，所以常用有效塔板數(shù)n有效表示柱效：

n有效=5.54(tR/W1/2)2=16(tR/Wb)2

有效板高：H有效=L/n有效

27例：已知某組分峰的峰底寬為40s，保留時間為400s，計算此色譜柱的理論塔板數(shù)。解：n=16(tR/Y)2=16（400/40）2

=1600塊28

塔板理論是一種半經(jīng)驗性理論。它用熱力學(xué)的觀點定量說明了溶質(zhì)在色譜柱中移動的速率，解釋了流出曲線的形狀，并提出了計算和評價柱效高低的參數(shù)。

但是，色譜過程不僅受熱力學(xué)因素的影響，而且還與分子的擴散、傳質(zhì)等動力學(xué)因素有關(guān)，因此塔板理論只能定性地給出板高的概念，卻不能解釋板高受哪些因素影響；也不能說明為什么在不同的流速下，可以測得不同的理論塔板數(shù)，因而限制了它的應(yīng)用。29二、速率理論

1956年荷蘭學(xué)者vanDeemter（范第姆特）等在研究氣液色譜時，提出了色譜過程動力學(xué)理論——速率理論。他們吸收了塔板理論中板高的概念，并充分考慮了組分在兩相間的擴散和傳質(zhì)過程，從而在動力學(xué)基礎(chǔ)上較好地解釋了影響板高的各種因素。該理論模型對氣相、液相色譜都適用。vanDeemter方程的數(shù)學(xué)簡化式為

H=A+B/u+Cu式中u為流動相的線速度；A、B、C、為常數(shù)，分別代表渦流擴散系數(shù)、分子擴散項系數(shù)、傳質(zhì)阻力項系數(shù)。301.渦流擴散項A

在填充色譜柱中，當(dāng)組分隨流動相向柱出口遷移時，流動相由于受到固定相顆粒障礙，不斷改變流動方向，使組分分子在前進中形成紊亂的類似渦流的流動，故稱渦流擴散。31由于填充物顆粒大小的不同及填充物的不均勻性，使組分在色譜柱中路徑長短不一，因而同時進色譜柱的相同組分到達柱口時間并不一致，引起了色譜峰的變寬。色譜峰變寬的程度由下式?jīng)Q定：

A=2λdp

上式表明，A與填充物的平均直徑dp的大小和填充不規(guī)則因子λ有關(guān)，與流動相的性質(zhì)、線速度和組分性質(zhì)無關(guān)。為了減少渦流擴散，提高柱效，使用細而均勻的顆粒，并且填充均勻是十分必要的。對于空心毛細管，不存在渦流擴散，因此A=0。322.縱向擴散項B/u（分子擴散項）

縱向分子擴散是由濃度梯度造成的。組分從柱入口加入，其濃度分布的構(gòu)型呈“塞子”狀。它隨著流動相向前推進，由于存在濃度梯度，“塞子”必然自發(fā)的向前和向后擴散，造成譜帶展寬。分子擴散項系數(shù)為

B=2γDm式中：γ——彎曲因子，填充柱γ

空心柱γ=1Dm——組分在流動相中的擴散系數(shù)γ是填充柱內(nèi)流動相擴散路徑彎曲的因素，也稱彎曲因子(阻礙因子)，它反映了固定相顆粒的幾何形狀對自由分子擴散的阻礙情況。Dm為組分在流動相中擴散系數(shù)（cm3·s-1）,分子擴散項與組分在流動相中擴散系數(shù)Dm成正比.33Dm與流動相及組分性質(zhì)有關(guān)：

(a)相對分子質(zhì)量大的組分Dm小，Dm反比于流動

相相對分子質(zhì)量的平方根，所以采用相對分子

質(zhì)量較大的流動相，可使B項降低；

(b)Dm隨柱溫增高而增加，但反比于柱壓。

另外縱向擴散與組分在色譜柱內(nèi)停留時間有關(guān)，流動相流速小，組分停留時間長，縱向擴散就大。因此為了降低縱向擴散影響，要加大流動相速度。對于液相色譜，組分在流動相中縱向擴散可以忽略。343.傳質(zhì)阻力項Cu

由于氣相色譜以氣體為流動相，液相色譜以液體為流動相，它們的傳質(zhì)過程不完全相同。（1）氣液色譜

傳質(zhì)阻力系數(shù)C包括氣相(流動相)傳質(zhì)阻力系數(shù)Cm和液相(固定相)傳質(zhì)阻力系數(shù)Cs兩項，即

C=Cm+Cs

氣相傳質(zhì)過程是指試樣組分從氣相移動到固定相表面的過程。這一過程中試樣組分將在兩相間進行質(zhì)量交換，即進行濃度分配。有的分子還來不及進入兩相界面，就被氣相帶走；有的則進入兩相界面又來不及返回氣相。這樣使得試樣在兩相界面上不能瞬間達到分配平衡，引起滯后現(xiàn)象，從而使色譜峰變寬。35對于填充柱，氣相傳質(zhì)阻力系數(shù)Cm為：

式中k為容量因子。由上式看出，氣相傳質(zhì)阻力與填充物粒度dp的平方成正比，與組分在載氣流中的擴散系數(shù)Dm成反比。因此，采用粒度小的填充物和相對分子質(zhì)量小的氣體（如氫氣）做載氣，可使Cm減小，提高柱效。36

液相傳質(zhì)過程是指試樣組分從固定相的氣/液界面移動到液相內(nèi)部，并發(fā)生質(zhì)量交換，達到分配平衡，然后又返回氣/液界面的傳質(zhì)過程。這個過程也需要一定的時間，此時，氣相中組分的其它分子仍隨載氣不斷向柱口運動，于是造成峰形擴張。

由上式看出，固定相的液膜厚度df薄，組分在液相的擴散系數(shù)Ds大，則液相傳質(zhì)阻力就小。降低固定液的含量，可以降低液膜厚度，但k值隨之變小，又會使Cs增大。

374.載氣流速u對理論塔板高度H的影響uuopt理論踏板高度最小，柱效能最高，對應(yīng)最佳流速HminH38分子擴散項和傳質(zhì)阻力項對板高的貢獻較低線速時，分子擴散項B/u起主要作用；應(yīng)采用分子質(zhì)量較大的載氣，以使組分在氣相中有較小的擴散系數(shù)。較高線速時，傳質(zhì)阻力Cu項起主要作用；其中流動相傳質(zhì)阻力項對板高的貢獻幾乎是一個定值。宜采用低分子質(zhì)量的載氣，以減小氣相傳質(zhì)阻力，提高效能。39

根據(jù)速率理論，將上面各式總結(jié)，即可得氣液色譜速率板高方程，即著名的vanDeemter方程，亦稱速率方程。對色譜分離條件的選擇有指導(dǎo)意義。

它指出了色譜柱填充的均勻程度，填料顆粒的大小，流動相的種類及流速，固定相的液膜厚度等對柱效的影響。

40三、分離度要實現(xiàn)色譜的分離：首先兩峰之間的距離要大，即兩組分的保留時間有足夠大的差值，其次峰形要陡。41分離度R是一個綜合性指標(biāo)。

分離度是既能反映柱效率又能反映選擇性的指標(biāo)，稱總分離效能指標(biāo)。分離度又叫分辨率，它定義為相鄰兩組分色譜峰保留值之差與兩組分色譜峰底寬總和之半的比值，即

R=2(tR2-tR1)/W1+W2

R值越大，表明相鄰兩組分分離越好。一般說，當(dāng)R<1時，兩峰有部分重疊；當(dāng)R=1時，分離程度可達98%；當(dāng)R=1.5時，分離程度可達99.7%。

通常用R=1.5作為相鄰兩組分已完全分離的標(biāo)志。42

當(dāng)色譜峰峰形不對稱或相鄰兩峰間有重疊時，峰寬較難測量，可用半峰寬代替峰寬R=(tR2-tR1)/（W1/2,1+W1/2,2）將柱效、選擇性及分離度聯(lián)系起來，假設(shè)兩相鄰峰峰寬相等(W1=W2),得到柱效、選擇性及分離度之間的關(guān)系式：43第三節(jié)色譜定性定量分析一、定性分析確定各色譜峰代表的化合物。1、利用保留值定性(1)利用已知物保留值對照定性，色譜定性分析就是要確定各色譜峰所代表的化合物。由于各種物質(zhì)在一定的色譜條件下均有確定的保留值，因此保留值可作為一種定性指標(biāo)。目前各種色譜定性方法都是基于保留值的。44(2)相對保留值法

相對保留值γis是指組分i與基準(zhǔn)物質(zhì)s調(diào)整保留值的比值

γis=tri/trS′=Vri/Vrs

它僅隨固定液及柱溫變化而變化，與其它操作條件無關(guān)。45（3）雙柱保留法

保留值或相對保留值，在同一根色譜柱上不同的組分可能具有相同的數(shù)值。即使使用純物質(zhì)對照，也可能有誤差，需要采用雙柱法定性。利用兩根極性差別較大的色譜柱對混合物進行分離，然后用純物質(zhì)分別在兩根柱子上進行保留值對照定性，得到的結(jié)果一致，就可以確定該組分，結(jié)果比較可靠。

462.利用文獻保留數(shù)據(jù)定性

在所使用的柱溫與固定液相同的條件下，測定未知組分的保留指數(shù)，然后與文獻發(fā)表的Ix對照就可以定性測量。3.利用選擇性檢測器定性

火焰光度檢測器響應(yīng)---有機化合物電子捕獲器有響應(yīng)----含有鹵素、氧等電負性強的基團氮磷檢測器有響應(yīng)----含硫或磷

只能確定某一類化合物的存在，不能指出具體是哪一種組分。4.儀器聯(lián)用技術(shù)

47二、定量分析

定量分析的任務(wù)是求出混合樣品中各組分的百分含量。色譜定量的依據(jù)是，當(dāng)操作條件一致時，被測組分的質(zhì)量（或濃度）與檢測器給出的響應(yīng)信號成正比。即：

mi=fi

Ai

式中mi為被測組分i的質(zhì)量；Ai為被測組分i的峰面積；fi為被測組分i的校正因子。

48進行色譜定量分析時需要：（1）準(zhǔn)確測量檢測器的響應(yīng)信號—峰面積或峰高；（2）準(zhǔn)確求得比例常數(shù)—校正因子；（3）正確選擇合適的定量計算方法，將測得的峰面積或峰高換算為組分的百分含量。491、峰面積測量方法

峰面積是色譜圖提供的基本定量數(shù)據(jù)，峰面積測量的準(zhǔn)確與否直接影響定量結(jié)果。對于不同峰形的色譜峰采用不同的測量方法。（1）對稱形峰面積的測量——峰高乘以半峰寬法對稱峰的面積

A=1.065hY1/2

（2）不對稱形峰面積的測量——峰高乘平均峰寬法對于不對稱峰的測量如仍用峰高乘以半峰寬，誤差就較大，因此采用峰高乘平均峰寬法。

A=1/2h（Y0.15+Y0.85）式中Y0.15和Y0.85分別為峰高0.15倍和0.85倍處的峰寬。50（2）自動積分儀法2.定量校正因子

色譜定量分析的依據(jù)是被測組分的量與其峰面積成正比。但是峰面積的大小不僅取決于組分的質(zhì)量，而且還與它的性質(zhì)有關(guān)。即當(dāng)兩個質(zhì)量相同的不同組分在相同條件下使用同一檢測器進行測定時，所得的峰面積卻不相同。

因此，混合物中某一組分的百分含量并不等于該組分的峰面積在各組分峰面積總和中所占的百分率。這樣，就不能直接利用峰面積計算物質(zhì)的含量。為了使峰面積能真實反映出物質(zhì)的質(zhì)量，就要對峰面積進行校正，即在定量計算時引入校正因子。

51校正因子分為絕對校正因子和相對校正因子。