微生物細(xì)胞破碎

微生物細(xì)胞破碎第一頁，共三十三頁，2022年，8月28日幾種由大腸桿菌表達(dá)的胞內(nèi)重組藥物藥物名宿主用途胰島素大腸桿菌治療糖尿病人生長激素大腸桿菌治療侏儒癥干擾素大腸桿菌治療毛狀細(xì)胞白血病和卡波濟肉瘤第二頁，共三十三頁，2022年，8月28日§3、1細(xì)胞壁的組成與結(jié)構(gòu)第三頁，共三十三頁，2022年，8月28日

脂蛋白脂多糖脂質(zhì)雙層形態(tài)與結(jié)構(gòu)細(xì)胞壁特殊組分：外膜第四頁，共三十三頁，2022年，8月28日一、細(xì)菌肽聚糖：N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰胞壁酸、半乳糖胺氨基酸：D-丙氨酸、L-丙氨酸、D-谷氨酸、L-賴氨酸磷壁質(zhì)糖脂質(zhì)第五頁，共三十三頁，2022年，8月28日G+

菌肽聚糖結(jié)構(gòu):五肽交聯(lián)橋五個甘氨酸四肽側(cè)鏈L-丙、D-谷、L-賴、D-丙聚糖骨架G：N-乙酰葡萄胺M：N-乙酰胞壁酸第六頁，共三十三頁，2022年，8月28日聚糖骨架：同G+

菌四肽側(cè)鏈：

L-丙、D-谷

DAP、D-丙G-菌肽聚糖結(jié)構(gòu):第七頁，共三十三頁，2022年，8月28日細(xì)胞壁革蘭陽性菌革蘭陽性菌強度較堅韌較疏松厚度20-80nm10-15nm肽聚糖層數(shù)可多達(dá)560層1-2層肽聚糖含量占細(xì)胞壁干重50%-80%占細(xì)胞壁干重5%-20%磷壁酸有無外膜無有細(xì)胞壁G+菌與G-菌細(xì)胞壁的比較第八頁，共三十三頁，2022年，8月28日項目革蘭陽性菌革蘭陰性菌細(xì)胞壁的關(guān)系染色性紫色紅色細(xì)胞壁對酒精的通透性抗原性主要為磷壁酸主要為外膜細(xì)胞壁的化學(xué)組成不同毒性無內(nèi)毒素有內(nèi)毒素內(nèi)毒素為陰性菌細(xì)胞壁成分

脂多糖對青霉素的作用有效無效青霉素作用部位為肽聚糖五肽交聯(lián)橋?qū)θ芫傅淖饔糜行o效溶菌酶作用部位為肽聚糖

聚糖骨架細(xì)胞壁G+菌與G-菌的差別及與細(xì)胞壁的關(guān)系第九頁，共三十三頁，2022年，8月28日細(xì)胞膜位于細(xì)胞壁內(nèi)緊包細(xì)胞質(zhì)，結(jié)構(gòu)與真核細(xì)胞基本相同。功能細(xì)胞膜電鏡照片分泌呼吸載體蛋白脂質(zhì)雙層細(xì)胞膜模式結(jié)構(gòu)圖物質(zhì)轉(zhuǎn)運生物合成第十頁，共三十三頁，2022年，8月28日特殊結(jié)構(gòu)莢膜化學(xué)組成：功能：肺炎鏈球菌肺炎鏈球菌Capsule多糖或多肽抗吞噬作用粘附作用抗有害物質(zhì)損傷作用產(chǎn)汽莢膜桿菌第十一頁，共三十三頁，2022年，8月28日二、真菌和酵母糖及其氨基衍生物氨基酸脂質(zhì)三、藻類

第十二頁，共三十三頁，2022年，8月28日四、細(xì)胞結(jié)構(gòu)與細(xì)胞破碎細(xì)胞聲波攪拌液壓冷凍壓力動物細(xì)胞7777G-芽孢桿菌和球菌6566G+芽孢桿菌5（4）54酵母3.5342.5G+球菌3.5(2)325孢子2(1)21菌絲16(1)5細(xì)胞對破碎的敏感度第十三頁，共三十三頁，2022年，8月28日§3、2細(xì)胞壁的破碎一、破碎率的評價破碎率：被破碎細(xì)胞的數(shù)量占原始細(xì)胞數(shù)量的百分比數(shù)，即：1、直接計數(shù)法平板計數(shù)法血球細(xì)胞計數(shù)器2、間接計數(shù)法產(chǎn)物測定法電導(dǎo)法

第十四頁，共三十三頁，2022年，8月28日第十五頁，共三十三頁，2022年，8月28日二、細(xì)胞破碎方法的分類細(xì)胞破碎機械非機械液體剪切固體剪切超聲波：超聲波機械攪拌：振動器壓力：Chaikoff擠壓機研磨：研棒、研缽、珠磨壓力：X-壓濾機干燥溶胞物理：滲透沖擊化學(xué)：陰、陽離子洗滌劑酶：溶菌酶、酶噬菌體溶胞真空干燥空氣干燥冷凍干燥溶劑干燥第十六頁，共三十三頁，2022年，8月28日1、固體剪切方法（珠磨）原理：進入珠磨機的細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑（直徑小于1mm）一齊攪拌或研磨，研磨劑、珠子與細(xì)胞之間的相互剪切、碰撞，使細(xì)胞破碎，釋放出內(nèi)含物。在珠液分離器的協(xié)助下，珠子被留在破碎室內(nèi)，漿液流出從而實現(xiàn)連續(xù)操作。第十七頁，共三十三頁，2022年，8月28日設(shè)備第十八頁，共三十三頁，2022年，8月28日破碎率的動力學(xué)方程破碎作用遵循一級動力學(xué)定律：Rm能使放出的蛋白質(zhì)最大數(shù)量(mg/g)R為t時間內(nèi)釋放的蛋白質(zhì)數(shù)量(mg/g)k破碎的比速度第十九頁，共三十三頁，2022年，8月28日影響反應(yīng)常數(shù)K的因數(shù)：轉(zhuǎn)盤外緣速度細(xì)胞濃度珠粒大小溫度流量提高破碎率的方法：延長研磨時間增加珠體裝量提高攪拌速度提高操作溫度第二十頁，共三十三頁，2022年，8月28日2、液體剪切法（高壓勻漿法）原理：利用高壓使細(xì)胞破碎。不宜采用高壓勻漿的破碎的微生物細(xì)胞：已造成堵塞的團狀或絲狀真菌；較小的革蘭氏陽性菌；含有包含體的基因工程菌

高達(dá)20,000PSI(約138MPA)以上的壓縮氣體，可以有效的將細(xì)胞膜打破。第二十一頁，共三十三頁，2022年，8月28日包含體形成的可能性：可溶蛋白的集聚超過溶解度；蛋白合成太快，導(dǎo)致分子間疏水相互作用聚合而不溶；高表達(dá)的蛋白沒有形成正常的二硫鍵連接；蛋白的助溶物缺乏；包含體的形成與蛋白的穩(wěn)定性有關(guān)。包含體:蛋白相互交聯(lián)在一起形成不溶性的聚集物

第二十二頁，共三十三頁，2022年，8月28日外源蛋白在大腸桿菌中的積累蛋白產(chǎn)物占菌體總蛋白/%外源蛋白的積累人胰島素50%形成包含體-丙酰胺酶20%在細(xì)胞區(qū)間-人體干擾素25%形成包含體凝乳酶原形成包含體牛生長激素〉30%形成包含體-內(nèi)酰胺酶形成區(qū)間包含體人胰島素原6%~26%形成包含體第二十三頁，共三十三頁，2022年，8月28日破碎的動力學(xué)方程：R：蛋白質(zhì)釋放量；Rm：蛋白質(zhì)最大的釋放量；p：操作壓力；k：速率常數(shù)；：與微生物種類有關(guān)的常數(shù)第二十四頁，共三十三頁，2022年，8月28日Doulach理論：Z：常數(shù)P：破碎壓力P0：臨界壓力：細(xì)胞濃度參數(shù)第二十五頁，共三十三頁，2022年，8月28日3、超聲波破碎法（液相剪切的一種方法）原理：超聲波引起空穴，在相當(dāng)高的輸入聲能下，液體各部分會形成許多小氣泡，在聲波膨脹相中，這些氣泡會增大，而在壓縮相中氣泡會被壓縮，直到不能在壓縮時，氣泡破破裂，釋放出猛烈的陣。這種震波通過介質(zhì)傳播。在氣泡發(fā)生空穴現(xiàn)象的破碎期間，大量身能轉(zhuǎn)化成彈性形式的機械能，引起局部的剪切梯度使細(xì)胞破碎。第二十六頁，共三十三頁，2022年，8月28日蛋白釋放的動力學(xué)方程：蛋白釋放常數(shù)k取決于輸入的聲能。破碎效果:桿菌>球菌;革蘭氏陰性>革蘭氏陽性;細(xì)菌>酵母.第二十七頁，共三十三頁，2022年，8月28日超聲波破碎過程中的影響參數(shù)：振幅；細(xì)胞懸浮液的粘度；表面張力；被處理懸浮液的體積；探頭的形狀和材料；細(xì)胞懸浮液的流速；第二十八頁，共三十三頁，2022年，8月28日機械放破碎的缺點：需要高的能量并且生產(chǎn)高溫和高的剪切力，易使不穩(wěn)定產(chǎn)品變性失活；破碎非專一性；碎片尺寸分布廣泛。第二十九頁，共三十三頁，2022年，8月28日4、酶溶法原理：利用酶分解細(xì)胞壁上特殊的化學(xué)鍵使之破壁的一種方法。優(yōu)點：產(chǎn)品的選擇性高；抽提的速率和收率高；產(chǎn)品破壞最少；對pH和溫度等外界條件要求底；不留細(xì)胞殘片。缺點：酶的費用高；通用性差；產(chǎn)物抑制分類：外加酶法；自溶法第三十頁，共三十三頁，2022年，8月28日重要微生物細(xì)胞壁的降解酶生物體酶水解鍵的類型細(xì)菌糖苷酶N-乙酰胞壁?；?L-丙氨酸酰胺酶多肽酶肽聚糖中AGA和AAM之間的（1、4）-鍵殘基；某些糖肽中的N-乙酰胞壁?；鶜埢蚅-氨基酸殘基之間的鍵；甘氨酸-甘氨酸，丙氨酸-甘氨酸等的肽鍵。真菌、酵母-（1，3）-葡聚糖酶-（1，6）-浦聚糖酶甘露聚糖酶甲殼素酶蛋白酶聚糖中隨機（1，3）-鍵聚糖中隨機（1，6）-鍵（1，2）-或（1，3）-或（1，6）--D甘露糖苷鍵甲殼糖和殼糊精中的N-乙酰-6-D-氨基葡萄糖基（1，4）-B-鍵藻類纖維素酶纖維素中的（1，4）-鍵第三十一頁，共三十三頁，2022年，8月28日5、化學(xué)法原理：用某些化學(xué)試劑溶解細(xì)胞壁或抽提細(xì)胞中某些組分的方法。優(yōu)點：對產(chǎn)物有選擇性細(xì)胞外形保持完整，碎片少。缺點：通用性差時間長有些化學(xué)試劑有毒性用于化學(xué)法的試劑種類：酸堿調(diào)節(jié)有機溶劑表面活性劑