重組及重組技術(shù)

關(guān)于重組及重組技術(shù)第一頁，共九十三頁，2022年，8月28日DNA重組（DNArecombination）是指不同DNA分子斷裂和連接而產(chǎn)生DNA片段的交換并重新組合形成新DNA分子的過程。重組DNA技術(shù)（recombinantDNAtechnology）是指在體外將兩個或兩個以上DNA分子重新組合并在適當(dāng)細胞中增殖形成新DNA分子的過程。第二頁，共九十三頁，2022年，8月28日第一節(jié)

自然界DNA重組和基因轉(zhuǎn)移

DNARecombinationandGeneTransferinNature第三頁，共九十三頁，2022年，8月28日DNA重組同源重組(homologousrecombination)位點特異性重組(site-specificrecombination)轉(zhuǎn)座重組(transpositionrecombination)接合作用(conjugation)轉(zhuǎn)化作用(transformation)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用(transduction)第四頁，共九十三頁，2022年，8月28日發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologousrecombination)，又稱基本重組（generalrecombination）。是最基本的DNA重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個DNA分子同源序列間進行單鏈或雙鏈片段的交換。以E.coli的同源重組為例，了解同源重組機制的Holliday模型。一、同源重組是最基本的DNA重組方式第五頁，共九十三頁，2022年，8月28日Holliday模型的4個關(guān)鍵步驟：兩個同源染色體DNA排列整齊；片段重組體(patchrecombinant)拼接重組體(splicerecombinant)一個DNA的一條鏈斷裂、并與另一個DNA對應(yīng)的鏈連接，形成Holliday中間體；通過分支移動產(chǎn)生異源雙鏈DNA；Holliday中間體切開并修復(fù)，形成兩個雙鏈重組體DNA，分別為：第六頁，共九十三頁，2022年，8月28日片段重組體（見模型圖右邊產(chǎn)物）：

切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來自同一親本DNA。拼接重組體（見模型圖左邊產(chǎn)物）：

切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側(cè)來自不同親本DNA。

第七頁，共九十三頁，2022年，8月28日參與細菌DNA同源重組的酶有數(shù)十種，其中最關(guān)鍵的是RecA蛋白、RecBCD復(fù)合物和RuvC蛋白。RecBCD復(fù)合物具有三種酶活性，即依賴于ATP的核酸外切酶活性、可被ATP增強的核酸內(nèi)切酶活性以及需要ATP的解螺旋酶活性。RecA蛋白可結(jié)合單鏈DNA（ssDNA），形成RecA-ssDNA復(fù)合物。RuvC有內(nèi)切酶活性，能專一性識別Holliday連接點，并有選擇地切開同源重組體的中間體。第八頁，共九十三頁，2022年，8月28日

內(nèi)切酶

(recBCD)DNA侵擾(recA)分支遷移

(recA)

內(nèi)切酶(recBCD)

DNA

連接酶5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′3′3′5′3′5′3′3′5′5′3′5′3′5′3′Holliday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′第九頁，共九十三頁，2022年，8月28日Holliday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′5′5′3′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′內(nèi)切酶(ruvC)內(nèi)切酶(ruvC)DNA連接酶DNA連接酶拼接重組體片段重組體第十頁，共九十三頁，2022年，8月28日二、位點特異重組是發(fā)生在特異位點間的DNA整合位點特異性重組(site-specificrecombination)

是由整合酶催化，在兩個DNA序列的特異位點間發(fā)生的整合。第十一頁，共九十三頁，2022年，8月28日λ噬菌體的整合酶識別噬菌體和宿主染色體的特異靶位點發(fā)生選擇性整合；反轉(zhuǎn)錄病毒整合酶可特異地識別、整合反轉(zhuǎn)錄病毒cDNA的長末端重復(fù)序列(longterminalrepeat,LTR)。

（一）λ噬菌體DNA的整合第十二頁，共九十三頁，2022年，8月28日（二）細菌的位點特異性重組沙門氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變第十三頁，共九十三頁，2022年，8月28日hix為反向重復(fù)序列，它們之間的H片段可在Hin控制下進行特異位點重組(倒位)。H片段上有兩個啟動子P，其一驅(qū)動hin基因表達，另一正向時驅(qū)動H2和rH1基因表達，反向(倒位)時H2和rH1不表達。rH1為H1的阻遏蛋白基因。第十四頁，共九十三頁，2022年，8月28日H2鞭毛素

阻遏蛋白Hin重組酶轉(zhuǎn)位片段hinH2IH1H1鞭毛素hinH2IDNA啟動序列H1啟動序列沙門氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變第十五頁，共九十三頁，2022年，8月28日（三）免疫球蛋白基因的重排（了解）免疫球蛋白(Ig)，由兩條輕鏈(L鏈)和兩條重鏈(H鏈)組成，分別由三個獨立的基因族編碼，其中兩個編碼輕鏈(和)，一個編碼重鏈。

輕鏈的基因片段：重鏈的基因片段：LVJCLV

D

JC第十六頁，共九十三頁，2022年，8月28日重鏈(IgH)基因的V-D-J重排和輕鏈(IgL)基因的V-J重排均發(fā)生在特異位點上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的兩側(cè)均存在保守的重組信號序列(recombinationsignalsequence,RSS)。此重排的重組酶基因rag(recombinationactivatinggene)共有兩個，分別產(chǎn)生蛋白質(zhì)RAG1和RAG2。

CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCACTGTTTTTGG重組信號序列基因片段第十七頁，共九十三頁，2022年，8月28日免疫球蛋白基因重排過程第十八頁，共九十三頁，2022年，8月28日三、轉(zhuǎn)座重組可使基因移位由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因移位或重排稱為轉(zhuǎn)座(transposition)。大多數(shù)基因在基因組內(nèi)的位置是固定的，但有些基因可以從一個位置移動到另一位置。這些可移動的DNA序列包括插入序列和轉(zhuǎn)座子。第十九頁，共九十三頁，2022年，8月28日

插入序列(insertionsequences,IS)組成：IRTransposaseGeneIR（一）插入序列轉(zhuǎn)座二個分離的反向重復(fù)(invertedrepeats,IR)序列特有的正向重復(fù)序列一個轉(zhuǎn)座酶（transposase)編碼基因第二十頁，共九十三頁，2022年，8月28日插入序列發(fā)生轉(zhuǎn)座的形式：保守性轉(zhuǎn)座(conservativetransposition)復(fù)制性轉(zhuǎn)座(duplicativetransposition)第二十一頁，共九十三頁，2022年，8月28日插入序列的復(fù)制性轉(zhuǎn)座第二十二頁，共九十三頁，2022年，8月28日轉(zhuǎn)座子(transposons)——可從一個染色體位點轉(zhuǎn)移到另一位點的分散重復(fù)序列。IRIRTransposaseGene有用基因（二）轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座子組成：

反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)座酶編碼基因抗生素抗性等有用的基因第二十三頁，共九十三頁，2022年，8月28日

細菌的可流動性元件A插入序列：轉(zhuǎn)座酶編碼基因兩側(cè)連接反向末端重復(fù)序列(箭頭所示)B轉(zhuǎn)座子Tn3：含有轉(zhuǎn)座酶、β-內(nèi)酰胺酶及阻遏蛋白編碼基因C轉(zhuǎn)座子Tn10：含四環(huán)素抗性基因及兩個相同的插入序列IS10L第二十四頁，共九十三頁，2022年，8月28日由轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座第二十五頁，共九十三頁，2022年，8月28日四、原核細胞可通過接合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)進行基因轉(zhuǎn)移或重組（一）接合作用當(dāng)細胞與細胞、或細菌通過菌毛相互接觸時，質(zhì)粒DNA從一個細胞（細菌）轉(zhuǎn)移至另一細胞（細菌）的DNA轉(zhuǎn)移稱為接合作用(conjugation)。第二十六頁，共九十三頁，2022年，8月28日可接合質(zhì)粒如F因子(Ffactor)細菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。質(zhì)粒第二十七頁，共九十三頁，2022年，8月28日（二）轉(zhuǎn)化作用通過自動獲取或人為地供給外源DNA，使細胞或培養(yǎng)的受體細胞獲得新的遺傳表型，稱為轉(zhuǎn)化作用

(transformation)。第二十八頁，共九十三頁，2022年，8月28日例：溶菌時，裂解的DNA片段被另一細菌攝取。第二十九頁，共九十三頁，2022年，8月28日（三）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用當(dāng)病毒從被感染的（供體）細胞釋放出來、再次感染另一（受體）細胞時，發(fā)生在供體細胞與受體細胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組即為轉(zhuǎn)導(dǎo)作用(transduction)。第三十頁，共九十三頁，2022年，8月28日λ噬菌體的生活史溶菌生長途徑(lysispathway)溶源菌生長途徑(lysogenicpathway)第三十一頁，共九十三頁，2022年，8月28日第二節(jié)

重組DNA技術(shù)RecombinantDNATechnology第三十二頁，共九十三頁，2022年，8月28日重組DNA技術(shù)的發(fā)展史1865年的豌豆雜交試驗。1944年的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實驗。1973年美國斯坦福大學(xué)的科學(xué)家構(gòu)建第一個重組DNA分子。1977年美國南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應(yīng)用重組DNA技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上重要的藥物。1980年開始建造第一家應(yīng)用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠。1997年英國羅林研究所成功的克隆了多莉。第三十三頁，共九十三頁，2022年，8月28日重組DNA技術(shù)相關(guān)概念克隆(clone):來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning)，即無性繁殖。DNA克隆第三十四頁，共九十三頁，2022年，8月28日技術(shù)水平：分子克隆(molecularclone)

（即DNA克?。?/p>

細胞克隆個體克?。▌游锘蛑参铮?/p>

第三十五頁，共九十三頁，2022年，8月28日其主要過程包括：在體外將目的DNA片段與能自主復(fù)制的遺傳元件（又叫載體）連接，形成重組DNA分子，進而在受體細胞中復(fù)制、擴增，從而獲得單一DNA分子的大量拷貝。重組DNA技術(shù)，又稱分子克?。╩olecularcloning）或DNA克?。―NAcloning）或基因工程（geneticengineering）技術(shù)第三十六頁，共九十三頁，2022年，8月28日

目的：①分離獲得某一感興趣的基因或DNA②獲得感興趣基因的表達產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）第三十七頁，共九十三頁，2022年，8月28日一、重組DNA技術(shù)中常用的工具酶

限制性核酸內(nèi)切酶

DNA聚合酶Ⅰ

逆轉(zhuǎn)錄酶

T4DNA連接酶堿性磷酸酶末端轉(zhuǎn)移酶

TaqDNA聚合酶第三十八頁，共九十三頁，2022年，8月28日重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ①合成雙鏈cDNA分子或片段連接；②缺口平移制作高比活探針；③

DNA序列分析；④填補3末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標記等反轉(zhuǎn)錄酶①合成cDNA；②替代DNA聚合酶I進行填補，標記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5羥基末端磷酸化，或標記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3羥基末端進行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基第三十九頁，共九十三頁，2022年，8月28日限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease)

限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)是一類核酸內(nèi)切酶，能識別雙鏈DNA分子內(nèi)部的特異序列，并裂解磷酸二酯鍵。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ定義：第四十頁，共九十三頁，2022年，8月28日與甲基化酶共同構(gòu)成細菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護自身DNA。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技術(shù)中常用Ⅱ型）分類：作用：第四十一頁，共九十三頁，2022年，8月28日第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名：Hin

dⅢ

屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶第四十二頁，共九十三頁，2022年，8月28日Ⅱ類酶識別序列特點——

回文結(jié)構(gòu)(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG第四十三頁，共九十三頁，2022年，8月28日BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口黏端切口第四十四頁，共九十三頁，2022年，8月28日有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為配伍末端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA

同尾酶第四十五頁，共九十三頁，2022年，8月28日來源不同的限制酶，但能識別和切割同一位點，這些酶稱同裂酶或同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同裂酶：第四十六頁，共九十三頁，2022年，8月28日名稱識別序列及切割位點名稱識別序列及切割點切割后產(chǎn)生５’突出末端:BamHⅠ5’…G▼GATCC...3’BglⅡ

5’…A▼GATCT...3’EcoRⅠ

5’…G▼AATTC...3’HindⅢ

5’…A▼AGCTT...3’

HpaⅡ

5’…C▼CGG...3’

MboⅠ

5’…▼GATC...3’

NdeⅠ

5’…GA▼TATG...3’切割后產(chǎn)生3’突出末端:ApaⅠ

5’…GGGCC▼C...3’HaeⅡ

5’…PuGCGC▼Py...3’KpnⅠ

5’…GGTAC▼C...3’PstⅠ

5’…CTGCA▼G...3’SphⅠ

5’…GCATG▼C...3’切割后產(chǎn)生平末端:AluⅠ

5’…AG▼CT...3’EcoRⅤ

5’…GAT▼ATC...3’HaeⅢ

5’…GG▼CC...3’PvuⅡ

5’…CAG▼CTG...3’SmaⅠ

5’…CCC▼GGG...3’

限制性內(nèi)切核酸酶第四十七頁，共九十三頁，2022年，8月28日

二、重組DNA技術(shù)中常用的載體

定義為攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或表達有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。

載體按功能分為

克隆載體(cloningvector)

表達載體(expressionvector)

第四十八頁，共九十三頁，2022年，8月28日克隆載體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴增而特意設(shè)計的載體稱為克隆載體。表達載體(expressionvector)為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計的載體稱為表達載體。第四十九頁，共九十三頁，2022年，8月28日（一）克隆載體至少有一個復(fù)制起點使載體在宿主細胞中進行自主復(fù)制，并能使克隆的外源DNA片段得到同步擴增。至少有一個選擇標志（selectionmarker）：選擇標志是區(qū)分含與不含載體的細胞所必需的，包括抗生素抗性基因、β-半乳糖苷酶基因（lacZ）、營養(yǎng)缺陷耐受基因等。有適宜的RE的單一切點：載體中一般都構(gòu)建有一段特異性核苷酸序列，在這段序列中包含了多個RE的單一切點，可供外源基因插入時選擇，叫多克隆位點（multiplecloningsites，MCS）。1.克隆載體應(yīng)具備的基本特點

第五十頁，共九十三頁，2022年，8月28日（1）質(zhì)粒

(plasmid)特點:存在于細菌染色體外的環(huán)狀雙鏈超螺旋結(jié)構(gòu)。能在宿主細胞內(nèi)獨立自主復(fù)制，帶有某些遺傳信息，會賦予宿主細胞一些遺傳性狀。2.常用的克隆載體

第五十一頁，共九十三頁，2022年，8月28日第五十二頁，共九十三頁，2022年，8月28日pUC18質(zhì)粒載體圖譜第五十三頁，共九十三頁，2022年，8月28日

λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)

λgt系列（插入型，適用cDNA克?。〦MBL系列（置換型，適用基因組DNA克?。?）噬菌體DNA(phage)

M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列第五十四頁，共九十三頁，2022年，8月28日柯斯質(zhì)粒（cosmid）載體（又稱黏粒載體）

酵母人工染色體

(yeastartificialchromosome,YAC)

細菌人工染色體

(bacterialartificialchromosome,BAC)

動物病毒DNA改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）（3）其他克隆載體第五十五頁，共九十三頁，2022年，8月28日（二）表達載體表達載體是指用來在宿主細胞中表達外源基因的載體。根據(jù)宿主細胞的不同分為：原核表達載體真核表達載體第五十六頁，共九十三頁，2022年，8月28日1.原核表達載體

原核表達載體的基本組成

R：調(diào)節(jié)序列；P：啟動子；SD：SD序列；TT：轉(zhuǎn)錄終止序列第五十七頁，共九十三頁，2022年，8月28日2.真核表達載體

真核表達載體的基本組成

OriPro：原核復(fù)制起始序列；P：啟動子；MCS：多克隆位點；

TT：轉(zhuǎn)錄終止序列；orieuk：真核復(fù)制起始序列。第五十八頁，共九十三頁，2022年，8月28日基本原理目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體細胞外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選克隆基因的表達

三、重組DNA技術(shù)的基本原理及操作步驟第五十九頁，共九十三頁，2022年，8月28日

以質(zhì)粒為載體的DNA

克隆過程第六十頁，共九十三頁，2022年，8月28日（一）目的ＤＮＡ的分離獲取——分化學(xué)合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列。從基因組DNA文庫和cDNA文庫中獲取目的DNA(見第20章)PCR法(見第20章)其他方法(見第20章)第六十一頁，共九十三頁，2022年，8月28日化學(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列。第六十二頁，共九十三頁，2022年，8月28日組織或細胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌基因組DNA文庫存在于轉(zhuǎn)化細胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合從基因組DNA文庫獲取目的基因第六十三頁，共九十三頁，2022年，8月28日限制酶切位點限制酶消化除去中間片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色體DNA限制酶部分消化外源DNA與載體DNA混合連接反應(yīng)體外包裝用重組噬菌體感染大腸桿菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文庫用隨機切割的真核生物染色體DNA片段構(gòu)建基因文庫第六十四頁，共九十三頁，2022年，8月28日mRNAcDNA

雙鏈cDNA重組DNA分子cDNA文庫

反轉(zhuǎn)錄酶載體受體菌復(fù)制

從cDNA文庫獲取目的基因逆轉(zhuǎn)錄酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT第六十五頁，共九十三頁，2022年，8月28日（二）載體的選擇與構(gòu)建——選目的不同，操作基因的性質(zhì)不同，載體的選擇和改建方法也不同。

目的：①獲得某一目的基因或DNA片段②獲得目的DNA片段所編碼的蛋白質(zhì)第六十六頁，共九十三頁，2022年，8月28日載體插入DNA片段宿主細胞質(zhì)粒<5~10kb細菌，酵母λ噬菌體載體~20kb細菌黏粒~50kb細菌BAC~400kb細菌YAC~3Mb酵母不同載體的克隆容量及適宜宿主細胞第六十七頁，共九十三頁，2022年，8月28日（三）目的DNA與載體連接——接方式：（1）單一相同黏端連接（2）不同黏端連接

（3）通過其他措施產(chǎn)生黏端進行連接

黏端連接第六十八頁，共九十三頁，2022年，8月28日BamHⅠ切割反應(yīng)

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連⑴單一相同黏端連接第六十九頁，共九十三頁，2022年，8月28日⑵不同黏端連接（定向克?。〦coRⅠ切割位點Bg

lⅡ切割位點+EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體第七十頁，共九十三頁，2022年，8月28日由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進行粘端連接。

①人工接頭(linker)連接⑶通過其他措施產(chǎn)生黏端進行連接第七十一頁，共九十三頁，2022年，8月28日人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ第七十二頁，共九十三頁，2022年，8月28日在末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進行粘端連接。

②同聚物加尾連接第七十三頁，共九十三頁，2022年，8月28日5′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′5′

3′3′5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體5′第七十四頁，共九十三頁，2022年，8月28日③PCR法針對目的DNA的5-和3-端，設(shè)計一對特異引物，在每條引物的5-端分別加上不同的RE位點，然后以目的DNA為模板，經(jīng)PCR擴增便可得到帶有引物序列的目的DNA，再用相應(yīng)RE切割PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生黏端，隨后便可與帶有相同黏端的線性化載體進行有效連接。第七十五頁，共九十三頁，2022年，8月28日平端連接

限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補齊或切平形成的平端適用于：第七十六頁，共九十三頁，2022年，8月28日目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連第七十七頁，共九十三頁，2022年，8月28日3.粘-平末端連接黏-平末端連接是指目的DNA和載體之間通過一端為黏端、另一端為平端的方式進行連接。

屬于定向克隆第七十八頁，共九十三頁，2022年，8月28日受體菌條件：安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent)

導(dǎo)入方式：轉(zhuǎn)化(transformation)轉(zhuǎn)染(transfection)感染(infection)（四）重組DNA轉(zhuǎn)入受體細胞——轉(zhuǎn)第七十九頁，共九十三頁，2022年，8月28日1.借助載體上的遺傳標志進行篩選（初篩）

(1)利用抗生素抗性標志篩選(2)利用基因的插入失活/插入表達特性篩選(3)利用標志補救篩選(4)利用噬菌體的包裝特性進行篩選（五）重組體的篩選與鑒定——篩第八十頁，共九十三頁，2022年，8月28日2.序列特異性篩選

(1)RE酶切法(2)PCR法

(3)核酸雜交法(4)DNA測序法

3.親和篩選法第八十一頁，共九十三頁，2022年，8月28日插入失活篩選帶有重組載體的克隆第八十二頁，共九十三頁，2022年，8月28日α互補篩選（藍-白篩選）第八十三頁，共九十三頁，2022年，8月28日菌落或噬斑原位雜交篩選重組體第八十四頁，共九十三頁，2022年，8月28日重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為：小結(jié)分分離獲取目的基因選載體的選