微生物的遺傳和變異第三節(jié)

微生物的遺傳和變異第三節(jié)第一頁，共六十四頁，2022年，8月28日第二節(jié)細(xì)菌基因轉(zhuǎn)移的方式細(xì)菌的三種水平基因轉(zhuǎn)移形式接合轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)化p.237第二頁，共六十四頁，2022年，8月28日接合(conjugation)：細(xì)胞與細(xì)胞的直接接觸（由F因子介導(dǎo)）轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)：由噬菌體作為載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化(transformation)：游離DNA分子+感受態(tài)細(xì)胞第三頁，共六十四頁，2022年，8月28日一細(xì)菌的接合作用(conjugation)接合作用：通過細(xì)胞與細(xì)胞的直接接觸而產(chǎn)生的遺傳信息轉(zhuǎn)移和重組過程第四頁，共六十四頁，2022年，8月28日證實(shí)接合過程需要細(xì)胞間的直接接觸的“U”型管實(shí)驗(yàn)（BernardDavis，1950）第五頁，共六十四頁，2022年，8月28日2.機(jī)制接合作用是由一種被稱為F因子的質(zhì)粒介導(dǎo)F因子的分子量通常為5×107Da

，上面有編碼細(xì)菌產(chǎn)生性菌毛（sexpili）及控制接合過程進(jìn)行的20多個(gè)基因。含有F因子的細(xì)胞：“雄性”菌株（F+），其細(xì)胞表面有性菌毛

不含F(xiàn)因子的細(xì)胞：“雌性”菌株（F-），細(xì)胞表面沒有性菌毛第六頁，共六十四頁，2022年，8月28日第七頁，共六十四頁，2022年，8月28日F因子的四種細(xì)胞形式a）F-菌株，不含F(xiàn)因子，沒有性菌毛，但可以通過接合作用接收F因子而變成雄性菌株（F+）；b）F+菌株，F(xiàn)因子獨(dú)立存在，細(xì)胞表面有性菌毛。c）Hfr菌株，F(xiàn)因子插入到染色體DNA上，細(xì)胞表面有性菌毛。d）F′菌株，Hfr菌株內(nèi)的F因子因不正常切割而脫離染色體時(shí)，形成游離的但攜帶一小段染色體基因的F因子，特稱為F′因子。細(xì)胞表面同樣有性菌毛。第八頁，共六十四頁，2022年，8月28日第九頁，共六十四頁，2022年，8月28日1）F+×F-雜交雜交的結(jié)果：供體細(xì)胞和受體細(xì)胞均成為F+細(xì)胞F+菌株的F因子向F-細(xì)胞轉(zhuǎn)移，但含F(xiàn)因子的宿主細(xì)胞的染色體DNA一般不被轉(zhuǎn)移。第十頁，共六十四頁，2022年，8月28日第十一頁，共六十四頁，2022年，8月28日Hfr菌株的F因子插入到染色體DNA上，因此只要發(fā)生接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移過程，就可以把部分甚至全部細(xì)菌染色體傳遞給F-細(xì)胞并發(fā)生重組，由此而得名為高頻重組菌株（Highfrequencyofrecombination）。2）Hfr×F-雜交Hfr菌株仍然保持著F+細(xì)胞的特征，具有F性菌毛，并象F+一樣與F-細(xì)胞進(jìn)行接合。所不同的是在發(fā)生轉(zhuǎn)移時(shí)，由于F因子除先導(dǎo)區(qū)(leadingregion)以外，其余絕大部分是處于轉(zhuǎn)移染色體的末端，因此F因子的轉(zhuǎn)移是先導(dǎo)區(qū)結(jié)合著染色體DNA向受體細(xì)胞轉(zhuǎn)移的。由于轉(zhuǎn)移過程常被中斷，因此F因子不易轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞中，故Hfr×F-雜交后的受體細(xì)胞(或接合子)大多數(shù)仍然是F-。第十二頁，共六十四頁，2022年，8月28日染色體上越靠近F因子的先導(dǎo)區(qū)的基因，進(jìn)入的機(jī)會(huì)就越多，在F-中出現(xiàn)重組子的的時(shí)間就越早，頻率也高。F因子不易轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞中，故Hfr×F-雜交后的受體細(xì)胞（或稱接合子）大多數(shù)仍然是F-。第十三頁，共六十四頁，2022年，8月28日3）F′×F-雜交Hfr菌株內(nèi)的F因子因不正常切割而脫離染色體時(shí)，形成游離的但攜帶一小段染色體基因的F因子，特稱為F′因子。F′×F-與F+×F-的不同：給體的部分染色體基因隨F′一起轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞a）與染色體發(fā)生重組；b）繼續(xù)存在于F′因子上，形成一種部分二倍體；細(xì)胞基因的這種轉(zhuǎn)移過程又常稱為性導(dǎo)（sexduction）、F因子轉(zhuǎn)導(dǎo)（F-duction），或F因子媒介的轉(zhuǎn)導(dǎo)（F-mediatedtransduction）。第十四頁，共六十四頁，2022年，8月28日二細(xì)菌的轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）由噬菌體介導(dǎo)的細(xì)菌細(xì)胞間進(jìn)行遺傳交換的一種方式：一個(gè)細(xì)胞的DNA通過病毒載體的感染轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞中能將一個(gè)細(xì)菌宿主的部分染色體或質(zhì)粒DNA帶到另一個(gè)細(xì)菌的噬菌體稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體細(xì)菌轉(zhuǎn)導(dǎo)的二種類型：普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)第十五頁，共六十四頁，2022年，8月28日1普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)（generalizedtransduction）噬菌體可以轉(zhuǎn)導(dǎo)供體細(xì)菌染色體的任何部分到受體細(xì)胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程1951年，JoshuaLederberg和NortonZinder為了證實(shí)大腸桿菌以外的其它菌種是否也存在接合作用，用二株具不同的多重營養(yǎng)缺陷型的鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行類似的實(shí)驗(yàn)：用“U”型管進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)時(shí)，在給體和受體細(xì)胞不接觸的情況下，同樣出現(xiàn)原養(yǎng)型細(xì)菌！第十六頁，共六十四頁，2022年，8月28日沙門氏菌LT22A是攜帶P22噬菌體的溶源性細(xì)菌另一株是非溶源性細(xì)菌一個(gè)表面看起來的常規(guī)研究卻導(dǎo)致一個(gè)驚奇和十分重要發(fā)現(xiàn)的重要例證！基因的傳遞很可能是由可透過“U”型管濾板的P22噬菌體介導(dǎo)的（普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)這一重要的基因轉(zhuǎn)移途徑的發(fā)現(xiàn)）第十七頁，共六十四頁，2022年，8月28日普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)過程第十八頁，共六十四頁，2022年，8月28日2局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)（specializedtransduction）把供體菌的少數(shù)特定基因轉(zhuǎn)移到受體菌中的過程第十九頁，共六十四頁，2022年，8月28日溫和噬菌體感染整合到細(xì)菌染色體的特定位點(diǎn)上宿主細(xì)胞發(fā)生溶源化溶源菌因誘導(dǎo)而發(fā)生裂解時(shí)，在前噬菌體二側(cè)的少數(shù)宿主基因因偶爾發(fā)生的不正常切割而連在噬菌體DNA上部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌的少數(shù)特定基因轉(zhuǎn)移到受體菌中的過程第二十頁，共六十四頁，2022年，8月28日溫和噬菌體λ裂解時(shí)的不正常切割：包含gal或bio基因（幾率一般僅有10-6）缺陷噬菌體在宿主細(xì)胞內(nèi)能夠象正常的λDNA分子一樣進(jìn)行復(fù)制、包裝，提供所需要的裂解功能，形成轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒。但沒有正常噬菌體的溶源性和增殖能力，感染受體細(xì)胞后，通過DNA整合進(jìn)宿主染色體而形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子。第二十一頁，共六十四頁，2022年，8月28日3局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)與普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要區(qū)別：a）普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)是誤包；局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)是誤切。b）局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒攜帶特定的染色體片段并將固定的個(gè)別基因?qū)胧荏w，故稱為局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)。而普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)攜帶的宿主基因具有隨機(jī)性，包裝的可能全部是宿主菌的基因。第二十二頁，共六十四頁，2022年，8月28日三細(xì)菌的遺傳轉(zhuǎn)化（genetictransformation）定義：游離DNA分子(質(zhì)粒和染色體DNA)被自然或人工感受態(tài)細(xì)胞攝取，并得到表達(dá)的基因轉(zhuǎn)移過程。第二十三頁，共六十四頁，2022年，8月28日1、轉(zhuǎn)化1928年，Griffith發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌（Streptococcuspneumoniae）的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象目前已知有二十多個(gè)種的細(xì)菌具有自然轉(zhuǎn)化的能力進(jìn)行轉(zhuǎn)化，需要二方面必要的條件：受體細(xì)胞處于感受態(tài)：最容易接受外源DNA的一種生理狀態(tài)。轉(zhuǎn)化因子：外源游離dsDNA分子第二十四頁，共六十四頁，2022年，8月28日

以革蘭氏陽性的肺炎鏈球菌為材料，其轉(zhuǎn)化過程大體是：1、雙鏈DNA片段與感受態(tài)受體菌的細(xì)胞表面特定位點(diǎn)結(jié)合。2、在位點(diǎn)上的DNA發(fā)生酶促分解，形成平均分子量為（4~5)x106D的DNA片段。3、DNA雙鏈中的一條單鏈逐步降解，同時(shí)，另一條單鏈逐步進(jìn)入細(xì)胞。第二十五頁，共六十四頁，2022年，8月28日4、轉(zhuǎn)化DNA單鏈與受體菌染色體組上的同源區(qū)段配對(duì)，接著受體染色體組的相應(yīng)單鏈片段被切除，并被外來的單鏈DNA所交換和取代，于是形成了雜種DNA區(qū)段。5、受體菌染色體組進(jìn)行復(fù)制，雜合區(qū)段分離成兩個(gè)，其中之一類似供體菌，另一類似受體菌。當(dāng)細(xì)胞分裂后，此染色體分離形成了一個(gè)轉(zhuǎn)化子。第二十六頁，共六十四頁，2022年，8月28日轉(zhuǎn)化全過程第二十七頁，共六十四頁，2022年，8月28日轉(zhuǎn)化整合過程第二十八頁，共六十四頁，2022年，8月28日轉(zhuǎn)化過程的特點(diǎn)：a）對(duì)核酸酶敏感；c）轉(zhuǎn)化是否成功及轉(zhuǎn)化效率的高低主要取決于轉(zhuǎn)化（DNA）給體菌株和轉(zhuǎn)化受體菌株之間的親源關(guān)系；d）通常情況下質(zhì)粒的自然轉(zhuǎn)化效率低b）不需要活的DNA供體細(xì)胞；第二十九頁，共六十四頁，2022年，8月28日人工轉(zhuǎn)化用CaCl2處理細(xì)胞，電穿孔等是常用的人工轉(zhuǎn)化手段。在自然轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)上發(fā)展和建立的一項(xiàng)細(xì)菌基因重組手段，是基因工程的奠基石和基礎(chǔ)技術(shù),該過程與細(xì)菌自身的遺傳控制無關(guān).用多種不同的技術(shù)處理受體細(xì)胞，使其人為地處于一種可以攝取外源DNA的“人工感受態(tài)”。第三十頁，共六十四頁，2022年，8月28日接合(conjugation)：細(xì)胞與細(xì)胞的直接接觸（由F因子介導(dǎo)）轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)：由噬菌體介導(dǎo)自然遺傳轉(zhuǎn)化(naturalgenetictransformation)：游離DNA分子+感受態(tài)細(xì)胞第三十一頁，共六十四頁，2022年，8月28日第三節(jié)基因克隆及重組DNA技術(shù)利用DNA體外重組技術(shù)，將一個(gè)特定的基因或DNA序列插入一個(gè)載體DNA分子上，導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)，使其擴(kuò)增和表達(dá)?；蚩寺〉谌摚擦捻?，2022年，8月28日是指對(duì)遺傳信息的分子操作和施工，即把分離到的或合成的基因經(jīng)過改造，插入載體中，導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)，使其擴(kuò)增和表達(dá)，從而獲得大量基因產(chǎn)物，或者令生物表現(xiàn)出新的性狀。基因工程（geneticengineering）或重組DNA技術(shù)(recombinantDNAtechnology)二十世紀(jì)生物科學(xué)具有劃時(shí)代意義的巨大事件，推動(dòng)了生物科學(xué)的迅猛發(fā)展，并帶動(dòng)了生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的興起。第三十三頁，共六十四頁，2022年，8月28日微生物在基因工程的興起和發(fā)展過程中起著不可替代的作用！“微生物與基因工程”第三十四頁，共六十四頁，2022年，8月28日一、基因工程的基本過程1.基因分離：a）分別提取供體DNA和載體DNA2.體外重組b）用專一性很強(qiáng)的限制性核酸內(nèi)切酶分別切割供體和載體DNA在DNA連接酶的作用下使具有相同粘性末端的供體DNA片段和載體連接，成為重組載體。3.重組載體的傳遞與篩選用人工轉(zhuǎn)化的方法將重組載體導(dǎo)入受體細(xì)胞中，并通過一定的篩選標(biāo)記篩選得到含有目的外源片段的重組子.4.在特定的宿主中表達(dá),得到基因工程產(chǎn)品第三十五頁，共六十四頁，2022年，8月28日第三十六頁，共六十四頁，2022年，8月28日大腸桿菌生產(chǎn)胰島素第三十七頁，共六十四頁，2022年，8月28日假單胞菌生產(chǎn)毒素蛋白第三十八頁，共六十四頁，2022年，8月28日二、基因工程的發(fā)展歷史對(duì)基因工程的建立與發(fā)展具有重要意義的幾項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)：DNA的特異切割DNA的分子克?。ㄈ斯まD(zhuǎn)化方法的建立）DNA的快速測序聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）（DNA的體外擴(kuò)增）DNA合成技術(shù)DNA的定點(diǎn)誘變技術(shù)第三十九頁，共六十四頁，2022年，8月28日基因工程工具酶基因工程所用到的絕大多數(shù)工具酶都是從不同微生物中分離和純化而獲得的一、限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）能識(shí)別雙鏈DNA分子的特定序列，并在識(shí)別位點(diǎn)或其附近切割DNA的一類內(nèi)切酶。簡稱為限制性酶（restritionenzyme）。在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)限制性酶與DNA甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制–修飾系統(tǒng)，利用限制酶降解進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的外源DNA，同時(shí)用甲基化酶修飾細(xì)菌本身DNA，以避免被酶降解。第四十頁，共六十四頁，2022年，8月28日

限制性內(nèi)切酶I型：單一多功能(限制-修飾)的酶，不是特異性的切割，所以用處不大。III型：雙功能的酶，特異性的切割，用處不大。

II型：分開的核酸內(nèi)切酶和甲基化酶(EcoRI,MEcoRI)。特異性的切割，十分有用。識(shí)別序列通常由4-8個(gè)堿基對(duì)組成，具有回文結(jié)構(gòu)。EcoRI:EscherichiacoliRY13,識(shí)別序列:GAATTCCTTAAGBamHI:BacillusamyloliquefaciensH,識(shí)別序列:GGATCCCCTAGG第四十一頁，共六十四頁，2022年，8月28日限制性內(nèi)切酶的剪切方式第四十二頁，共六十四頁，2022年，8月28日常用限制性內(nèi)切酶第四十三頁，共六十四頁，2022年，8月28日

酶連

DNA連接酶(1967,許多實(shí)驗(yàn)室同時(shí)發(fā)現(xiàn))的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用對(duì)于重組DNA技術(shù)的創(chuàng)立和發(fā)展也具有頭等重要的意義。將兩段DNA拼接起來的酶叫連接酶，目前已知有三種方法可以用來在體外連接DNA片段：第一種：粘性末端連接；第二種：平端連接；第三種：先在DNA末端加上化學(xué)合成的銜接物或接頭，使之形成粘性末端，再進(jìn)行連接。

T4噬菌體DNA連接酶：它催化DNA的5’磷酸基與3’羥基之間形成磷酸二酯鍵（Weiss等，1968）第四十四頁，共六十四頁，2022年，8月28日轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒DNA進(jìn)入受體細(xì)胞，并在受體細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達(dá)的過程。感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化電穿孔轉(zhuǎn)化第四十五頁，共六十四頁，2022年，8月28日抗生素篩選第四十六頁，共六十四頁，2022年，8月28日

能夠把脫氧核糖核苷酸連續(xù)地加到雙鏈DNA分子引物鏈的3’-OH末端,催化核苷酸的聚合作用,而不發(fā)生從引物模板上解離的情況.

常見的DNA聚合酶：最常用的依賴于DNA的DNA聚合酶是大腸桿菌DNA聚合酶I（全酶）（DNA聚合酶；5’-3’外切核酸酶；3’-5’外切核酸酶）;大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段，（沒有5’-3’外切核酸酶的活性）；TaqDNA聚合酶(Thermusaquaticus;1976;Chien),能耐高溫；pfuDNA聚合酶(Pyrococcusfuriosus),高保真性。DNA聚合酶第四十七頁，共六十四頁，2022年，8月28日DNA擴(kuò)增PCR反應(yīng)第四十八頁，共六十四頁，2022年，8月28日PCR的基本反應(yīng)體系

（以DNA為模板的反應(yīng)：

10×緩沖液10l

4種dNTP混合物

各200mol/L

引物

各10～100pmol

模板DNA

0.1～2g

TaqDNA聚合酶

2.5u

Mg2+

1.5mmol/L

加雙或三蒸水至100l

第四十九頁，共六十四頁，2022年，8月28日TaqDNA聚合酶來自水生棲熱菌Thermusaquaticus良好的耐熱性Mg2+依賴性無校正功能PfuDNA聚合酶來自Pyrococcusfuriosus(激烈火球菌“Pfu”)糾錯(cuò)功能，高保真性第五十頁，共六十四頁，2022年，8月28日基因工程的常用載體：質(zhì)粒載體λ噬菌體載體柯斯質(zhì)粒載體M13噬菌體載體真核細(xì)胞的克隆載體人工染色體噬菌粒載體第五十一頁，共六十四頁，2022年，8月28日一、質(zhì)粒克隆載體a）低分子量有利于DNA的分離和操作；特點(diǎn)：b）具有較高拷貝數(shù)；c）易于導(dǎo)入細(xì)胞；d）具有安全性；質(zhì)粒載體克隆外源DNA片段的大小一般不超過15Kb第五十二頁，共六十四頁，2022年，8月28日第五十三頁，共六十四頁，2022年，8月28日第五十四頁，共六十四頁，2022年，8月28日二、λ噬菌體克隆載體將野生型λ噬菌體DNA進(jìn)行改造后建成，主要是去掉噬菌體DNA上過多的常用限制酶的酶切位點(diǎn)，及對(duì)非必要基因區(qū)域進(jìn)行改造。特點(diǎn)：1）它的分子遺傳學(xué)背景十分清楚2）λ噬菌體載體的容量較大。一般質(zhì)粒載體只能容納10多個(gè)kb。而λ噬菌體載體卻能容納大約23kb的外源DNA片段。3）具有較高的感染效率。其感染宿主細(xì)胞的效率幾乎可達(dá)100％，而質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化率卻只有0.1％。4）和質(zhì)粒相比，λ噬菌體具有更為狹窄的寄主范圍，因此更加安全第五十五頁，共六十四頁，2022年，8月28日經(jīng)過體外基因操作和包裝后形成重組噬菌體，可以通過正常的感染途徑進(jìn)入宿主細(xì)胞；重組噬菌體DNA也可不經(jīng)過體外包裝而直接通過轉(zhuǎn)染（轉(zhuǎn)化）方式進(jìn)入宿主細(xì)胞；第五十六頁，共六十四頁，2022年，8月28日質(zhì)粒和噬菌體載體都可用于構(gòu)建基因文庫；但后者更有優(yōu)勢：容納的外源DNA片段較大；以感染途徑進(jìn)入宿主細(xì)胞的效率比轉(zhuǎn)化高；第五十七頁，共六十四頁，2022年，8月28日三、柯斯質(zhì)粒載體柯斯質(zhì)粒載體（cosmidvector），又稱粘粒，是由λ噬菌體的粘性末端和質(zhì)粒構(gòu)建而成。Cosmid(cossite-carryingplasmid)帶有粘性末端位點(diǎn)(cos)的質(zhì)粒第五十八頁，共六十四頁，2022年，8月28日特點(diǎn)：1）具有λ噬菌體的特性：在克隆了外源片段后可在體外被包裝成噬菌體顆粒，高效地感染對(duì)λ噬菌體敏感的大腸桿菌細(xì)胞。進(jìn)入寄主的柯斯質(zhì)粒DNA分子，按照λ噬菌體DNA的方式環(huán)化，但無法按噬菌體的方式生活，更無法形成子代噬菌體顆粒。2）具有質(zhì)粒載體的特性：在寄主細(xì)胞內(nèi)如質(zhì)粒一樣進(jìn)行復(fù)制，攜帶有抗性基因和克隆位點(diǎn)，并具氯霉素?cái)U(kuò)增效應(yīng)。3）具有高容量的克隆能力：柯斯質(zhì)粒本身一般只有5～7kb左右，而它克隆外源DNA片段的極限值竟高達(dá)45kb.柯斯質(zhì)粒用于克隆大片段的DNA分子特別有效，而這種特性對(duì)于研究高等生物的基因組十分重要。第五十九頁，共六十四頁，2022年，8月28日四、微生物作為克隆載體的宿主一、宿主的基本要求與性質(zhì)①能夠高效吸收外源DNA