原核生物的基因表達(dá)與操作

重組基因的原核生物表達(dá)體系與產(chǎn)物的分離純化目的基因載體體外重組重組子（雜合DNA）轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞篩選陽性克隆大量擴(kuò)增，獲得子代DNA基因克隆的技術(shù)路線重組基因表達(dá)的目的1.

蛋白質(zhì)功能研究

2.生物制藥和疫苗生產(chǎn)

3.

疾病的基因治療

4.

食品、化工用酶制劑

5.

抗蟲、抗逆植物改良

6.細(xì)胞代謝產(chǎn)物的富集重組基因表達(dá)體系1.

原核體系2.

真核體系

大腸桿菌枯草桿菌乳酸菌沙門氏桿菌蘇云金桿菌酵母細(xì)胞昆蟲細(xì)胞植物細(xì)胞、組織動(dòng)物細(xì)胞、組織大腸桿菌表達(dá)體系優(yōu)越性：1.對(duì)大腸桿菌的背景知識(shí)，特別是基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)理有深刻的了解；2.是一種安全的基因工程實(shí)驗(yàn)體系，擁有各類適用的寄主菌株和不同類型的載體；3.許多克隆的真核基因都可以在大腸桿菌細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)有效、高水平的表達(dá)；4.大腸桿菌培養(yǎng)方便、操作簡(jiǎn)單、成本低廉，易用于批量生產(chǎn)。大腸桿菌表達(dá)體系大腸桿菌中表達(dá)體系的不足：1.真核基因，在結(jié)構(gòu)上同原核基因之間存在著很大的差別。2.真核基因的轉(zhuǎn)錄信號(hào)同原核的不同。細(xì)菌的

RNA聚合酶不能識(shí)別真核的啟動(dòng)子；外源基因可能含有具大腸桿菌轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)功能的核苷酸序列。3.真核基因mRNA的分子結(jié)構(gòu)同細(xì)菌的有所差異，影響真核基因mRNA穩(wěn)定性。4.許多真核基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，都要經(jīng)過轉(zhuǎn)譯后的加工修飾（正確折疊和組裝），而大多數(shù)的這類修飾作用在細(xì)菌細(xì)胞中并不存在；5.細(xì)菌的蛋白酶，能夠識(shí)別外來的真核基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)分子，并把它們降解掉。

1.通過表達(dá)載體將外源基因?qū)胨拗骶?，并指?dǎo)宿主菌的酶系統(tǒng)合成外源蛋白。

2.外源基因不能帶有間隔順序(內(nèi)含子)，因而必須用cDNA或全化學(xué)合成基因，而不能用基因組DNA。

3.必須利用原核細(xì)胞的強(qiáng)啟動(dòng)子和SD序列等調(diào)控元件控制外源基因的表達(dá)。

4.外源基因與表達(dá)載體連接后，必須形成正確的開放閱讀框架(ORF)。

5.利用宿主菌的調(diào)控系統(tǒng)，調(diào)節(jié)外源基因的表達(dá)，防止外源基因的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)宿主菌的毒害。重組基因在原核細(xì)胞中表達(dá)具備條件

啟動(dòng)子

核糖體結(jié)合位點(diǎn)(SD序列)

終止子

選擇標(biāo)記基因

復(fù)制子

原核生物基因表達(dá)載體的組成特征啟動(dòng)子核糖體結(jié)合位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄終止子大腸桿菌表達(dá)載體報(bào)告基因（reportergene）：特指那些編碼產(chǎn)物可以被快速測(cè)定的功能核苷酸編碼單元（半乳糖苷酶基因、堿性磷酸酶基因、螢光素酶基因、半乳糖激酶基因以及氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因等）。追蹤某種特定的DNA結(jié)構(gòu)（重組質(zhì)粒）是否已經(jīng)導(dǎo)入寄主細(xì)胞、抑或是器官和組織；也可用來同任何一種目的啟動(dòng)子連接，因此其表達(dá)活性可作為檢測(cè)啟動(dòng)子功能的依據(jù)。Lac(乳糖啟動(dòng)子)Trp(色氨酸啟動(dòng)子)Tac(乳糖和色氨酸的雜合啟動(dòng)子)PL(λ噬菌體的左向啟動(dòng)子)T7噬菌體啟動(dòng)子常用的可調(diào)控啟動(dòng)子通過與阻遏蛋白的相互作用來控制基因的啟動(dòng)和停止大腸桿菌的Lac啟動(dòng)子

來自大腸桿菌的乳糖操縱子由阻遏蛋白基因(LacI)、啟動(dòng)基因(P)、操縱基因(O)和編碼3個(gè)與乳糖利用有關(guān)的酶的結(jié)構(gòu)基因所組成受活化蛋白和cAMP的正調(diào)控，阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控受IPTG（異丙基硫代半乳糖苷）、TMG（硫甲基半乳糖苷）、ONPG（鄰硝基苯基半乳糖苷）的誘導(dǎo)LacUV5啟動(dòng)子：Lac啟動(dòng)子的衍生物大腸桿菌的trp啟動(dòng)子

來自大腸桿菌的色氨酸操縱子由啟動(dòng)子、衰減子、操縱基因及trpE的部分結(jié)構(gòu)基因組成受阻遏蛋白和衰減子的調(diào)控，阻遏蛋白前體必須與色氨酸結(jié)合才有活性3-β-吲哚丙烯酸（IAA）可競(jìng)爭(zhēng)性抑制色氨酸與阻遏蛋白的結(jié)合，提高轉(zhuǎn)錄活性。

Tac啟動(dòng)子

是一組由Lac和trp啟動(dòng)子人工構(gòu)建的雜合啟動(dòng)子，其啟動(dòng)能力比Lac和trp都強(qiáng)；受Lac阻遏蛋白的負(fù)調(diào)節(jié)，受IPTG（異丙基硫代半乳糖苷）的誘導(dǎo)。λ噬菌體的左向啟動(dòng)子PL來自λ噬菌體早期左向轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，活性比Trp啟動(dòng)子高約11倍；受控于溫度敏感的阻遏蛋白cI

。在低溫(28-30℃)時(shí)，cIts857阻遏蛋白可阻遏PL啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄。在高溫(42℃)時(shí)，cIts857蛋白失活，阻遏解除，促使PL啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄。1.非融合型表達(dá)載體pKK223-3載體

1）強(qiáng)啟動(dòng)子:tac（trp-lac）

2）操縱基因：乳糖操縱子系統(tǒng)

trp的-35區(qū)

lacUV5的-10區(qū)

lac操縱基因

常用大腸桿菌表達(dá)載體3）表達(dá)誘導(dǎo)物：IPTG（乳糖的類似物，不會(huì)被降解）條件：必須選擇一個(gè)有l(wèi)acI的宿主菌。非融合蛋白：指所表達(dá)的外源蛋白的N端或C端不含任何其他氨基酸。所表達(dá)的蛋白質(zhì)以真核蛋白的mRNA的AUG為起始，在其氨基端不含細(xì)菌多肽序列。

非融合蛋白特點(diǎn)：表達(dá)時(shí)要求高：SD序列與ATG的距離要合適。即使改變2-3個(gè)堿基，表達(dá)效率也會(huì)大受影響。

優(yōu)點(diǎn)：能夠較好地保持原來蛋白的活性。

缺點(diǎn)：在宿主細(xì)胞內(nèi)容易被蛋白酶降解，蛋白產(chǎn)量低；分離純化費(fèi)時(shí)費(fèi)力，成本較高。

2.分泌型表達(dá)載體載體表達(dá)出的外源蛋白質(zhì)與細(xì)菌的分泌信號(hào)肽連在一起，可被宿主菌分泌到細(xì)胞周質(zhì)中。

pINIII-comA1,pINIII-comA2,pINIII-comA3,1）強(qiáng)啟動(dòng)子：Ipp（脂蛋白基因啟動(dòng)子）和lacUV5啟動(dòng)子。2）調(diào)節(jié)基因：lacI。3）S-D序列和起始密碼ATG。

4）分泌信號(hào)肽：大腸桿菌外膜蛋白基因ompa。5）插入位點(diǎn)區(qū)（多克隆位點(diǎn)）。

3.融合蛋白表達(dá)載體系統(tǒng)表達(dá)出的外源基因產(chǎn)物蛋白是與質(zhì)粒載體上的菌體蛋白連接在一起的。如：pGEX、pET系列優(yōu)點(diǎn)：便于融合蛋白的分離和純化。

組成結(jié)構(gòu)：

1）啟動(dòng)子：tac

2）操縱基因：lacP

3）調(diào)節(jié)基因：lacI

4）S-D序列

5）ori：pBR322ori6）融合肽：GST(谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶）融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建的三個(gè)原則：首先，受體細(xì)菌結(jié)構(gòu)基因應(yīng)能高效表達(dá)，且其表達(dá)產(chǎn)物可以通過親和層析進(jìn)行特異性簡(jiǎn)單純化。其次，外源基因應(yīng)插在受體菌結(jié)構(gòu)基因的下游區(qū)域，并為融合蛋白提供終止密碼子。另外，兩個(gè)結(jié)構(gòu)基因拼接位點(diǎn)處的序列設(shè)計(jì)十分重要，它直接決定了融合蛋白的裂解方法。最后，當(dāng)兩個(gè)蛋白編碼序列融合在一起時(shí)，外生命科學(xué)學(xué)院用融合載體組合表達(dá)融合蛋白質(zhì)：

以Ecoli.lacZ為靶基因的組合最典型，含三個(gè)不同載體，每個(gè)載體都有一個(gè)lacZ啟動(dòng)子和SD序列，且在lacZ基因下游部位具有一EcoRⅠ識(shí)別序列

(GAATTC)5’上游存在著不同數(shù)量的G-C堿基對(duì)。三種情況必有一個(gè)保持著正確的讀碼結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生出真實(shí)的融合蛋白質(zhì)。第二節(jié)

外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白從GST上切下來pGEX-2X的插入?yún)^(qū)pGEX-1X的插入?yún)^(qū)pGEX-3X的插入?yún)^(qū)4.其他融合蛋白系統(tǒng)

His-tag（組氨酸標(biāo)簽）在外源多肽的N端或C端接上6個(gè)組氨酸（His）。

His-tag能與Ni2+柱結(jié)合，但很容易被EDTA（或咪唑溶液）洗脫下來，可以純化蛋白質(zhì)。融合蛋白：是指蛋白質(zhì)的N末端由原核DNA序列或其他DNA序列編碼，C端由真核DNA的完整序列編碼。這樣的蛋白質(zhì)有一段短的原核多肽或具有其他功能的多肽和真核蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，故稱為融合蛋白。

外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)

位于細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞周質(zhì)細(xì)胞外表達(dá)產(chǎn)物形式包涵體蛋白融合蛋白整合型外源蛋白分泌型外源蛋白

目標(biāo)蛋白在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)的主要優(yōu)點(diǎn)是：表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建比較簡(jiǎn)單；能夠達(dá)到很高的目標(biāo)蛋白表達(dá)量，一般可以達(dá)到占細(xì)

胞總蛋白的20%～40%。

目標(biāo)蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)的形式有二種：

在細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)為不溶性的包涵體顆粒

包涵體存在于大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)中在細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)為可溶性的蛋白質(zhì)

可溶性的目標(biāo)蛋白質(zhì)除可存在于細(xì)胞質(zhì)中外，還可借

助于身的功能序列和大腸桿菌蛋白質(zhì)加工、運(yùn)輸體系，最

終分泌到周質(zhì)空間，或外泌到培養(yǎng)液中。包涵體蛋白

本質(zhì)：細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的不斷聚集

包括：1.折疊狀態(tài)的蛋白質(zhì)的聚集作用；

2.非折疊狀態(tài)的蛋白質(zhì)的聚集作用；

3.蛋白質(zhì)的中間體結(jié)構(gòu)。

優(yōu)點(diǎn)：易于分離純化

在一定程度上保持表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定能夠避免細(xì)胞內(nèi)蛋白水解酶的作用，有利于目標(biāo)蛋白的富集

簡(jiǎn)化外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離操作包涵體的水難溶性及其密度遠(yuǎn)大于其它細(xì)胞碎片和細(xì)胞成分，

菌體經(jīng)超聲波裂解后，直接通過高速離心即可將重組異源蛋白從細(xì)菌裂解物中分離出來

能夠表達(dá)對(duì)大腸桿菌宿主有毒或有致死效應(yīng)的目標(biāo)蛋白包涵體表達(dá)形式的優(yōu)點(diǎn)以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過有效的變性復(fù)性操作，才能回收得到具有正確空間構(gòu)象（因而具有生物活性）的目標(biāo)蛋白，因此包涵體變復(fù)性操作的效率對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的收率至關(guān)重要。

經(jīng)過復(fù)性處理的目標(biāo)蛋白不一定能完全恢復(fù)原來的生物學(xué)活性，有時(shí)甚至完全得不到有活性的蛋白蛋，尤其當(dāng)目標(biāo)蛋白分子中的Cys殘基數(shù)目較高時(shí)，體外復(fù)性蛋白質(zhì)的成功率相當(dāng)?shù)?，一般不超過30%

復(fù)性處理工藝可使目標(biāo)蛋白的制備成本上升。包涵體表達(dá)形式的缺點(diǎn)

分離純化細(xì)菌包涵體蛋白質(zhì)的基本步驟：破碎細(xì)胞

(Disruptionofcell)↓

分離包涵體

(Seperationofinclusionbody)↓

溶解包涵體

(Dissolve

inclusionbody)↓

蛋白質(zhì)產(chǎn)物的構(gòu)象復(fù)原等。

(Recoveryoftargetproteinconformation)包涵體的復(fù)性前準(zhǔn)備洗滌：由于脂體及部分破碎的細(xì)胞膜及膜蛋白與包涵體粘連在一起，在溶解包涵體之前要先洗滌包涵體，通常用低濃度的變性劑如2M尿素在50mMTrispH7.0-8.5左右、1mMEDTA中洗滌。此外可以用溫和去垢劑TritonX-100洗滌去除膜碎片和膜蛋白。包涵體的溶解

1.采用高濃度的變性劑，使其形成伸展的肽鏈。常用的變性劑有尿素（8M）、鹽酸胍（GuaHCl6-8M），通過離子間的相互作用，破壞包涵體蛋白間的氫鍵而增溶蛋白。尿素的增溶效果稍差，異氰硫酸胍（GuaSCN）最強(qiáng)。變性劑的使用濃度和作用時(shí)間：一般在偏堿性的環(huán)境中如pH8.0-9.0，尿素在堿性環(huán)境中不穩(wěn)定。有些蛋白只能用鹽酸胍。增溶時(shí)一般室溫過夜，但鹽酸胍在37度1小時(shí)便可以使多數(shù)蛋白完全變性溶解。2.去垢劑：如強(qiáng)的陰離子去垢劑SDS，可以破壞蛋白內(nèi)的疏水鍵，避免蛋白形成疏水核心，可以增溶幾乎所有的蛋白。但由于SDS無法徹底的去除而不允許在制藥過程中使用（研究）。

3.極端pH：可以破壞蛋白的次級(jí)鍵從而增溶蛋白。如在pH>9.0溶解牛生長(zhǎng)激素和牛凝乳蛋白酶包涵體。有些蛋白可以溶解在60mMHCl中。這些方法只適合于少部分蛋白的增溶。

4.還原劑：由于蛋白間二硫鍵的存在，在增溶時(shí)一般使用還原劑。還原劑的使用濃度一般是50-100mMDTT，也有使用5mM濃度。實(shí)際，還原劑的使用濃度與蛋白二硫鍵的數(shù)目無關(guān)，而有些沒有二硫鍵的蛋白加不加還原劑無影響。對(duì)于目標(biāo)蛋白沒有二硫鍵某些包涵體的增溶，有時(shí)還原劑的使用也是必要的，可能由于含二硫鍵的雜蛋白影響了包涵體的溶解。含有半胱氨酸的蛋白質(zhì)，需要加入還原劑巰基乙醇、二硫蘇糖醇等。加入金屬螯合劑EDTA去除金屬離子。(伸展態(tài))U→(中間態(tài))I→(自然態(tài))N↓

A（包涵體）從中間體轉(zhuǎn)變?yōu)樘烊粦B(tài)的過程比較緩慢。當(dāng)溶液中離子強(qiáng)度或變性劑濃度很低，又無其它輔助手段存在時(shí)，聚集趨勢(shì)占主導(dǎo)地位，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的自發(fā)復(fù)性效率極低。蛋白質(zhì)折疊的三態(tài)模型復(fù)性目的復(fù)性：通過緩慢去除變性劑（避免折疊中間體重新聚集）使目標(biāo)蛋白從變性的完全伸展?fàn)顟B(tài)（？）恢復(fù)到正常的折疊結(jié)構(gòu)，同時(shí)去除還原劑使二硫鍵正常形成。一般在尿素濃度4M左右時(shí)復(fù)性過程開始，到2M左右時(shí)結(jié)束。對(duì)于鹽酸胍而言，可以從4M開始，到1.5M時(shí)復(fù)性過程已經(jīng)結(jié)束。

蛋白質(zhì)的復(fù)性是重組蛋白純化中最關(guān)鍵和最復(fù)雜的問題。蛋白質(zhì)的性質(zhì)不同，所處的環(huán)境不同，使其復(fù)性條件大不相同。任何一個(gè)蛋白質(zhì)都有一個(gè)最佳的復(fù)性條件，只有選擇到了合適的復(fù)性緩沖液，使蛋白得以正確折疊，才能使進(jìn)一步的層析分離得以順利完成。包含體蛋白復(fù)性方法幾個(gè)要求：活性蛋白的回收率高正確的復(fù)性的產(chǎn)物易于與錯(cuò)誤的折疊蛋白質(zhì)分離。折疊復(fù)性后應(yīng)得到濃度較高的蛋白質(zhì)產(chǎn)品復(fù)性過程耗時(shí)少復(fù)性常用方法

1.稀釋復(fù)性：直接加入水或復(fù)性緩沖液，缺點(diǎn)是體積增加較大，后續(xù)處理困難。

稀釋蛋白濃度：濃度高則容易形成聚集體（較低的復(fù)性收率）。有時(shí)需低于0.01mg/mL。

脈沖流加復(fù)性：分批次加入到緩沖液中，使折疊中間體保持在較低的水平。例：在5-10mg/mL終濃度下，溶菌酶復(fù)性收率可達(dá)80%以上。

2.透析復(fù)性：好處是不增加體積，通過逐漸降低外透液濃度來控制變性劑去除速度，速度慢，不適合大規(guī)模操作，無法應(yīng)用到生產(chǎn)規(guī)模。

3.超濾復(fù)性：選擇合適載留分子量的膜，允許變性劑通過膜而蛋白質(zhì)通不過。在生產(chǎn)中較多的使用，規(guī)模較大，缺點(diǎn)是不適合樣品量較少的情況，且有些蛋白可能在超濾過程中不可逆的變性（蛋白聚集于膜上）。4.色譜復(fù)性：輔助手段，兼具分離。

4.1凝膠過濾復(fù)性：除了蛋白質(zhì)在膠粒中傳質(zhì)和擴(kuò)散外，蛋白質(zhì)與介質(zhì)之間并沒有發(fā)生其他作用。該法可以起到一定的抑制凝集作用，并且在凝膠過濾中脲等變性劑脫除得相對(duì)較慢，對(duì)有些蛋白質(zhì)的復(fù)性有利。

4.2吸附型層析復(fù)性：離子交換、疏水層析、親和層析和擴(kuò)張床層析均屬于吸附層析。其基本復(fù)性原理是層析柱平衡后，將變性蛋白上樣并吸附在凝膠介質(zhì)上，然后用清洗緩沖液洗掉未吸附的變性劑和雜蛋白，最后用復(fù)性緩沖液將吸附的蛋白洗脫下來，在洗脫過程中完成復(fù)性。Solid-Phase(orMatrix-assisted)RefoldingIBinE.coliIB(solid)SolubilizedIB(unfolded)AggregateRefoldedBioactivemonomerRefoldingSolution-stateFSolidSupportFunctionalGroupSolid-staterefoldingRemoveDenaturantF5.分子伴侶：主要包括硫氧還蛋白二硫鍵異構(gòu)酶、肽酰一輔氨酰順反異構(gòu)酶等。分子伴侶和折疊酶等不僅可在細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的折疊和聚集過程的平衡，而且可在體外促進(jìn)蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性。體內(nèi)復(fù)性主要是在工程菌培養(yǎng)過程中同時(shí)加入分子伴侶的基因進(jìn)行共表達(dá)；體外復(fù)性主要是將基因工程菌中包涵體溶解，再加入分子伴侶幫助折疊。復(fù)性過程中的添加劑

低分子化合物自身并不能加速蛋白質(zhì)的折疊，但可能通過破壞錯(cuò)誤折疊中間體的穩(wěn)定性或增加折疊中間體和未折疊分子的可溶性來提高復(fù)性產(chǎn)率?？煞乐共豢赡婢奂w的出現(xiàn)。鹽酸胍、脲、烷基脲以及碳酸酰胺類等，在非變性濃度下是有效的促進(jìn)劑。

In-VitroRefoldingPathwaySSSSUnfoldedAggregateIntermediate(moltenglobular)3DStructure(Bioactive)SSSSCorrectlyFoldedIntramolecularMisfoldingSSSSSSSSSSSSIntermolecularMisfoldingStandardIBRenaturationProcess

CellDisruptionRefoldingPost-refoldingpurificationstepIBIsolationIBWashingSolubilizationCentrifugation

RemoveCellDebrisDenaturantPartialRemovalofDenaturantCompleteRemovalofDenaturantIBDissolvedRefolding包涵體分離純化過程61細(xì)胞培養(yǎng)收獲細(xì)胞細(xì)胞破碎離心5-10000g沉淀物沖洗和離心分離包涵體親和純化和復(fù)性溶解包涵體-細(xì)胞破碎,沖洗和分離每100ml培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞沉淀物於4ml20mMTris?-HClpH8.0在冰浴情況下，用超聲震蕩破碎細(xì)胞，并在+4oC下高速離心10分鐘重新懸浮細(xì)胞沉淀物於2ml含

e.g.urea的沖洗緩沖液和再度超聲震蕩并在+4oC下高速離心10分鐘用沖洗緩沖液沖洗細(xì)胞沉淀物622MUREA20mMTrisHCl2%TritonX1000.5MNaCl溶解和準(zhǔn)備樣品重新懸浮細(xì)胞沉淀物於5ml溶解緩沖液(e.g.): 20mMTris?-HCl,0.5MNaCl,

5mM咪唑,6M鹽酸胍,

1mM2-巰基乙醇pH863在室溫等30-60分鐘在+4oC離心15分鐘用0.22μm或0.45μm濾膜過濾載體和標(biāo)記 純化pGEX

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶 GSTMicroSpin?PurificationModule,

GSTrap?,GlutathioneSepharose?FastFlowPQE

6x組氨酸 HisMicroSpinPurificationModule pET HisTrap?,HiTrap?Chelating,

6x組氨酸 ChelatingSepharoseFastFlowpEZZ18(非誘導(dǎo)性表達(dá))

蛋白A的IgG結(jié)合區(qū) IgGSepharose6FastFlowpRIT2T(利用溫度改變誘導(dǎo))

蛋白A的IgG結(jié)合區(qū) IgGSepharose6FastFlow親和層析純化65GST融合蛋白的純化GST重組蛋白

酶切位點(diǎn)FactorXa:

Mr17-20000/28-30000Thrombin: Mr

37000PreScission?Protease:

Mr

46000GlutathioneSepharose?Mr2600010C66SDSPAGEanalysis020406080100%Elutionbuffer00.51.01.52.02.53.03.55.010.015.020.0mlminWashElutionbuffer2.7mgpureGSTfusionprotein5.010.015.020.0A280kD9414.420.1304367123柱:

GSTrap1ml樣品: 8ml大腸桿菌表達(dá)含

GST融合蛋白胞漿萃取液結(jié)合緩沖液:

PBS,pH7.3洗脫緩沖液 50mMTris?-HCl,pH8.0＋10mM還原谷胱甘肽流速: 1ml/min層析

步驟: 4CV結(jié)合緩沖液,8ml樣品,10CV結(jié)合緩沖液,

5CV洗脫緩沖液,5CV結(jié)合緩沖液(CV=柱體積)系統(tǒng):

?KTA?explorer101:

低分子量標(biāo)記(LMW)Calibrationkit,

還原,AmershamPharmaciaBiotech2:

胞漿萃取液,1g/10ml3:

洗脫GST融合蛋白67(His)6

融合蛋白的純化和檢測(cè)重組蛋白HisHisHisNi2+HisHisHisHisNi2+Ni2+Ni2+69SDSPAGEFlowthrough加樣結(jié)合液洗脫液結(jié)合液AA280280AA4054051.00.50.00.700.600.500.400.300.200.100.05.010.015.020.0Volume(ml)ElutedpoolWashkDa94.067.043.020.114,412345678樣品: 5ml大腸桿菌表達(dá)含(His)-標(biāo)記谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶，

GST-(His)6

柱:

HiTrapChelating1ml,加Ni2+結(jié)合緩沖液: 1X磷酸緩沖液,20mM咪唑pH7.4洗脫緩沖液: 1X磷酸緩沖液,500mM咪唑pH7.4流速: 2ml/min,312cm/h結(jié)果: 洗脫GST-(His)6,4ml,

A280:1.65總量:4.46