rnai用于基因功能的鑒定和確證課件

RNAi(shRNA/miRNA)用于基因功能的鑒定和確證FulenGenGainoffunctionORFexpressionclonesTansfection/TransductionLossoffunctionshRNA/miRNAChemicalgeneticsInhibitorsandactivatorsofbiologicalprocessAutomatedread-outmechanismTherapeuticstrategycellFulenGenGeneFunctionScreeningMechanismofRNAi(shRNA/miRNA)FulenGenshRNA的設(shè)計(jì)與構(gòu)建shRNA的驗(yàn)證miRNA的克隆與檢測miRNA靶標(biāo)的確證基因沉默后的功能拯救FulenGenFulenGen保證高表達(dá)抑制效率和最低的脫靶效應(yīng)；慢病毒載體和以哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體；序列已經(jīng)過測序；每個(gè)基因提供4個(gè)克隆，至少有1抑制水平達(dá)到70%以上提供包含不規(guī)則序列的陰性對照克隆來比較研究。OmicsLink?shRNA表達(dá)克隆FulenGen經(jīng)過驗(yàn)證的人類激酶組shRNA表達(dá)克隆

350個(gè)人類激酶基因的確證shRNA表達(dá)克隆表達(dá)抑制效應(yīng)都經(jīng)過驗(yàn)證，達(dá)70％以上

低的脫靶效應(yīng)。FulenGenshRNA克隆用于信號通路研究ExonicNon-codingMicroRNAs由RNAPolymeraseII轉(zhuǎn)錄IntronicNon-codingandcodingLee,etal.,EMBOJ.23:4051-602004/~-OHmatureandprimarymicroRNA的結(jié)構(gòu)Pri-miRNADroshaCleavagesiteMatureVector-BasedmicroRNAExpressionClonesPromoter5’miRflank3’miRflankPre-miRTerFulenGenOmicsLink?HumanPrecursormiRNAExpressionClonespEZ-MR02650種前體miRNA表達(dá)克隆涵蓋了miRBase（11.0版本）中已知的678種miRNA的95%miRNA表達(dá)框已完全測序確證基于慢病毒載體系統(tǒng)的表達(dá)克隆可轉(zhuǎn)染未分化細(xì)胞和難轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，獲得與普通分化細(xì)胞類似的轉(zhuǎn)染效率提供被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的存活性的篩選基因，可用于穩(wěn)定或瞬時(shí)表達(dá)調(diào)控通過應(yīng)用eGFP可以監(jiān)測病毒和質(zhì)粒載體的轉(zhuǎn)染效率FulenGenmicroRNA

腫瘤發(fā)生

miR-9

神經(jīng)母細(xì)胞瘤miR-10b乳腺癌miR-15、miR-15a白血病、垂體腺瘤

miR-16、miR-16-1

白血病、垂體腺瘤

miR-17-5p、miR-17-92肺癌、淋巴瘤miR-20a肺癌、淋巴瘤miR-21乳腺癌、膽管腺癌、頭頸癌、白血病、宮頸癌miR-29、miR-29b白血病，膽管腺癌miR-31結(jié)腸直腸癌miR-34a胰腺癌

miR-96結(jié)腸直腸癌miR-98頭頸癌

miR-103胰腺癌miR-107

白血病、胰腺癌

miR-125a、miR-125b神經(jīng)母細(xì)胞瘤、乳腺癌miR-128膠質(zhì)母細(xì)胞瘤miR-133b結(jié)腸直腸癌miR-135b結(jié)腸直腸癌miR-143結(jié)腸癌、宮頸癌miR-145乳腺癌、結(jié)腸直腸癌miR-146甲狀腺癌miR-155乳腺癌、白血病、胰腺癌miR-181、miR-181a、miR-181b、miR-181c肺癌、白血病、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、甲狀腺癌

miR-183直腸結(jié)腸癌miR-184

神經(jīng)母細(xì)胞瘤miR-196a-2

胰腺癌miR-221膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、甲狀腺癌、胰腺癌

miR-222甲狀腺癌miR-223

白血病miR-301胰腺癌miR-376

胰腺癌let-7、let-7a、let-7a-1、hsa-let-7a-2、let-7a-3肺癌、結(jié)腸癌miRNA與腫瘤miRNA的檢測和定量檢測方法

NothernblotMicroarrayQuantitativeReal-timePCR檢測對象Primary-miRNAPre-miRNAMaturemiRNAFulenGenqPCR檢測miRNA的特異性qPCR檢測miRNA的特異性miRNA

Target的分析研究發(fā)現(xiàn)，在哺乳動(dòng)物中，miRNAs的基因抑制作用是通過其5’一段長為6－8nt的核苷酸與mRNAs3’端非翻譯區(qū)域相結(jié)合實(shí)現(xiàn)的。一般這段核苷酸位于miRNA序列5’的2~8個(gè)nt，被稱為seed區(qū)。2007年，美國約翰·霍普金斯大學(xué)發(fā)現(xiàn)miR-29b5’的6個(gè)核苷酸與該miRNA的細(xì)胞定位有關(guān)。FulenGenmiRNA5’的seed區(qū)域在miRNA家族中具有很高的保守性，對脊椎動(dòng)物的miRNAtarget的識(shí)別具有重要的作用，尤其是第2-8個(gè)堿基。FulenGenRenillaLuciferasedataFireflyLuciferasedatamiRNA的編輯及其靶標(biāo)的變化seedelment：

A

ImiR376a-5p經(jīng)過編輯后，其靶標(biāo)的變化FulenGenOmicsLink?HumanmiRNATargetSequence(3’UTR)ExpressionClonesSV40hLucRLucCMVpolyApolyApUCoriKan/Neo3’UTRSV40GLucsAPCMVpolyApolyApUCoriKan/Neo3’UTRpEZX-MT01pEZX-MT02FulenGenGaussialuciferaseexpressioninCHOcellsFulenGen構(gòu)建克隆轉(zhuǎn)染細(xì)胞分泌表達(dá)Luciferase取上清加入底物讀取熒光值FulenGenmiRNADeliverintocell,tissueoranimalRestorethesilencegenefunctionmRNA

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