化學(xué)生物學(xué)導(dǎo)論-課件第一章蛋白質(zhì)protein

第一章蛋白質(zhì)Protein蛋白質(zhì)存在于所有的生物細(xì)胞中，是構(gòu)成生物體最基本的結(jié)構(gòu)物質(zhì)和功能物質(zhì)。蛋白質(zhì)是生命活動的物質(zhì)基礎(chǔ)，它參與了幾乎所有的生命活動過程。蛋白質(zhì)不僅是構(gòu)成人體一切組織的主要成分，更為重要的是，它與生命活動有著相當(dāng)密切的關(guān)系。如調(diào)節(jié)生理功能的激素，參加營養(yǎng)代謝的酶，運(yùn)載氧的血紅蛋白，抵抗疾病的抗體等，均以蛋白質(zhì)為主要構(gòu)造材料。還有人體酸堿度的調(diào)節(jié)、體液的平衡、遺傳信息的傳遞等，也與蛋白質(zhì)有關(guān)。第一節(jié) 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)組成蛋白質(zhì)的定量測定是生物化學(xué)和其他生物學(xué)科中經(jīng)常涉及的分析內(nèi)容，也是臨床診斷和檢驗(yàn)疾病治療效果的重要指標(biāo)，還是藥物和食品分析的常見項(xiàng)目。那么，如何測試一個(gè)樣品中蛋白質(zhì)含量和組成呢？

一、蛋白質(zhì)的元素組成

蛋白質(zhì)是一類含氮有機(jī)化合物，大多數(shù)蛋白質(zhì)還含有少量的硫，有的含有磷，少數(shù)還含有鐵、銅、錳、鋅、鉬等金屬元素，個(gè)別的蛋白質(zhì)還含有碘等。

元素百分含量平均（%）CHONSP50556.97.7212415.017.60.32.30.40.9527231620.6大多數(shù)蛋白質(zhì)的含氮量接近于16%，所以，在任何生物樣品中，每克氮的存在，大約表示該樣品含有100/16=6.25克的蛋白質(zhì)，故可以根據(jù)生物樣品中的含氮量來計(jì)算蛋白質(zhì)的大概含量。蛋白質(zhì)含量（克%）=每克生物樣品中含氮的克數(shù)

6.25100對微量分析而言，蛋白質(zhì)內(nèi)源光譜在靈敏度方面常常不能滿足需要，為此，人們發(fā)展了各種光譜探針分析方法。蛋白質(zhì)光譜探針，就是能與蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用的無機(jī)離子、有機(jī)小分子或絡(luò)合物，這些物質(zhì)與蛋白質(zhì)結(jié)合生成超分子復(fù)合物之后，體系的光譜性質(zhì)發(fā)生變化，從而可以提供蛋白質(zhì)濃度或結(jié)構(gòu)方面的信息。蛋白質(zhì)的定量分析方法很多，如電化學(xué)探針、發(fā)光探針等，但研究最多、應(yīng)用最廣的還是吸光光度法、熒光分析法和共振光散射等分子光譜探針。這里僅介紹幾種常見的測試方法。（1）雙縮脲法雙縮脲法是一種測定蛋白質(zhì)的經(jīng)典方法，雙縮脲反應(yīng)是雙縮脲在堿性溶液中與銅離子(Cu2+)生成紫紅色化合物的反應(yīng)。具有2個(gè)或2個(gè)以上肽鍵的化合物都有雙縮脲反應(yīng)，因此蛋白質(zhì)在堿性溶液中也能與Cu2+

生成紫紅色化合物，可在540nm測量吸光度。（2）Folin-Lowry法Lowry等將雙縮脲試劑和Folin酚試劑（磷鉬酸鹽磷鎢酸鹽）結(jié)合使用，在蛋白質(zhì)發(fā)生雙縮脲反應(yīng)之后，再和Folin酚試劑反應(yīng)，此試劑在堿性條件下被蛋白質(zhì)中酪氨酸的酚基還原，生成顏色更深的化合物，可在640nm測量吸光度。該方法法比雙縮脲法靈敏100倍，其不足之處是此反應(yīng)受多種因素干擾，且由于蛋白質(zhì)中酪氨酸、色氨酸含量不同，在顯色靈敏度方面存在差異。本法可測定范圍是25—250g蛋白質(zhì)。（3）考馬斯亮藍(lán)G-250法

在酸性條件下，染料考馬斯亮蘭G-250(CoomassiebrilliantblueG-250)與蛋白質(zhì)結(jié)合后，其吸收高峰從465nm移至595nm處，由棕黃色轉(zhuǎn)為深蘭色。因蛋白質(zhì)與染料生成復(fù)合物顏色的深淺與其濃度成比例關(guān)系，可作為測定蛋白質(zhì)濃度的方法。該方法使用方便，反應(yīng)時(shí)間短，染色穩(wěn)定，且對顯色時(shí)間不嚴(yán)格要求，并有抗干擾性強(qiáng)的特點(diǎn)，為常用的蛋白濃度測定方法。該法的線性范圍為1～20μg/mL，靈敏度高于Lowry法、溴酚藍(lán)法和溴甲酚綠法，成為靈敏度最高的染料探針分析方法。

蛋白質(zhì)的組成分析最初分離得到的蛋白質(zhì)，人們根據(jù)元素分析知道蛋白質(zhì)是一類含氮有機(jī)化合物，除了含有碳、氫氧、氮以外，還含有少量的硫。因此，采用化學(xué)水解手段對蛋白質(zhì)進(jìn)行處理，對蛋白質(zhì)的組成進(jìn)行分析，完全水解得到各種氨基酸的混合物，部分水解通常得到多肽片段。最后得到各種氨基酸的混合物。（1）酸水解常用6mol/L的鹽酸或4mol/L的硫酸在105-110℃條件下進(jìn)行水解，反應(yīng)時(shí)間約20小時(shí)。此法的優(yōu)點(diǎn)是不容易引起水解產(chǎn)物的消旋化。缺點(diǎn)是色氨酸被沸酸完全破壞；含有羥基的氨基酸如絲氨酸或蘇氨酸有一小部分被分解；門冬酰胺和谷氨酰胺側(cè)鏈的酰胺基被水解成了羧基。（2）堿水解一般用5mol/L氫氧化鈉煮沸10-20小時(shí)。由于水解過程中許多氨基酸都受到不同程度的破壞，產(chǎn)率不高。部分的水解產(chǎn)物發(fā)生消旋化。該法的優(yōu)點(diǎn)是色氨酸在水解中不受破壞。水解產(chǎn)物的分析一、氨基酸分子中含有氨基的脂肪酸均稱為氨基酸。作為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)單元的氨基酸均為L--氨基酸。天然蛋白質(zhì)由20種基本氨基酸組成，有少數(shù)蛋白質(zhì)還含有若干種不常見的氨基酸，它們都是基本氨基酸的衍生物。

不同的氨基酸在于

R基團(tuán)的不同1，氨基酸的結(jié)構(gòu)和分類

從蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物中分離得到的基本氨基酸中，除不含手性碳原子的甘氨酸和含有環(huán)狀二級氨基的脯氨酸外，其他均具有如下結(jié)構(gòu)通式。

脂肪族氨基酸

含羥基、含硫氨基酸、環(huán)氨基酸

芳香族氨基酸、堿性氨基酸

酸性氨基酸及其酰胺LeuL-C-C-CONH2-C-CONH2-C-COOH-C-C-COOH-H-CH3-C-OH-C-SH-C-C-S-CPPro-C-CCNN+

-C-C-C-C-NH3+-C--C--OH-C-NSouthlineCircularlineCentrallineNan-KanlineChung-SanlineNorthwestlineAliphaticAmideAcidicImino,CircularBasicSulfurHydroxyAromatic-C-C-C-N-C-N

N+=

C-C-C-C

C-C-C-C

CC-C

CCCHNC-COOH

a-C-C

OHGlnQAsnNAspDGluEPheFArgRLysKHisHGlyGAAAlaVValI

IleYTyrSerSThrTMetMCysC氨基酸R基團(tuán)化學(xué)結(jié)構(gòu)TrpW第21-22種氨基酸蛋白質(zhì)的生物合成是生命活動的重要組成部分，通常蛋白質(zhì)由20種氨基酸組成。自然界傳統(tǒng)的三聯(lián)體密碼共有64個(gè)，其中61個(gè)用來編碼20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸，另外3個(gè)UAA,UAG,UGA為終止密碼子，指導(dǎo)蛋白質(zhì)翻譯的終止。1986年，第21種參與蛋白質(zhì)生物合成的氨基酸-硒代半胱氨酸被發(fā)現(xiàn)，它由終止密碼子UGA直接編碼。2002年，由另外一個(gè)終止密碼子UAG編碼的第22種氨基酸吡咯賴氨酸在古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)。

硒代半胱氨酸

2，幾種重要的不常見氨基酸在少數(shù)蛋白質(zhì)中分離出一些不常見的氨基酸，通常稱為不常見蛋白質(zhì)氨基酸。這些氨基酸都是由相應(yīng)的基本氨基酸衍生而來的。4-羥基脯氨酸5-羥基賴氨酸6-N-甲基賴氨酸3,5-二碘酪氨酸3，非蛋白氨基酸

除了上述構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸以外，自然界還存在一些并不是蛋白質(zhì)組分的氨基酸，這些氨基酸通常被稱為非蛋白氨基酸，至今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)200多種以上，它們具有不同的功能。

某些非蛋白氨基酸的結(jié)構(gòu)與功能

-丙氨酸：泛酸及輔酶A的組成成分-氨基丁酸：存在與腦組織中的神經(jīng)遞質(zhì)高半胱氨酸：甲硫氨酸生物合成的中間產(chǎn)物高絲氨酸：氨基酸代謝的中間產(chǎn)物鳥氨酸：尿素生成過程的中間產(chǎn)物瓜氨酸：苯甘氨酸：抗菌素構(gòu)成成分(MicakgcinB)氨基酸工業(yè)及其應(yīng)用20種氨基酸中，其中8種為人類必需的氨基酸-體內(nèi)不能合成，需要從食物中攝取-蘇氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸，這8種氨基酸中，又有3種為支鏈氨基酸。由于20種氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，所以氨基酸及其衍生物廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、添加劑、化妝品、科學(xué)研究等領(lǐng)域，已經(jīng)形成了一個(gè)較大的氨基酸工業(yè)。氨基酸合成方法目前氨基酸的合成方法有5種：（1）直接發(fā)酵法；（2）添加前體發(fā)酵法；（3）酶法；（4）化學(xué)合成法；（5）蛋白質(zhì)水解提取法。通常將直接發(fā)酵法和添加前體發(fā)酵法統(tǒng)稱為發(fā)酵法。γ-聚谷氨酸γ-聚谷氨酸是一種水溶性，生物降解，不含毒性，使用微生物發(fā)酵法制得的生物高分子。在“納豆”—發(fā)酵豆中被首次發(fā)現(xiàn)。用γ-PGA與聚乙二醇合成的交聯(lián)物是可生物降解的具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子材料,可吸收自身質(zhì)量數(shù)百倍至1000倍的水量,吸水后膨脹,加壓后水分不會脫去,是一種保水性材料。納豆1g吸水1700g我國氨基酸工業(yè)的發(fā)展現(xiàn)狀目前，我國已經(jīng)成為氨基酸生產(chǎn)和消費(fèi)大國，年消費(fèi)量約300多萬噸（其中谷氨酸鈉即味精就達(dá)200萬噸）。我國氨基酸生產(chǎn)發(fā)展快速的主要有谷氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸和色氨酸等。氨基酸生產(chǎn)方法和產(chǎn)量氨基酸生產(chǎn)方法產(chǎn)量氨基酸生產(chǎn)方法產(chǎn)量味精發(fā)酵I精氨酸發(fā)酵，提取III賴氨酸發(fā)酵I谷氨酰胺發(fā)酵III蛋氨酸化學(xué)合成I脯氨酸發(fā)酵III蘇氨酸發(fā)酵II纈氨酸發(fā)酵III色氨酸發(fā)酵II異亮氨酸發(fā)酵III甘氨酸化學(xué)合成II亮氨酸發(fā)酵,提取III苯丙氨酸發(fā)酵II組氨酸發(fā)酵,提取III天冬氨酸酶法II絲氨酸發(fā)酵,提取III丙氨酸酶法III酪氨酸發(fā)酵,提取III半胱氨酸胱氨酸還原III天冬酰胺提取III類型I:500,000-3000,000t/a;類型II:10,000-100,000t/a;類型III:100-10,000t/a二、氨基酸的性質(zhì)除甘氨酸外，氨基酸均含有一個(gè)手性-碳原子，因此都具有旋光性。比旋光度是氨基酸的重要物理常數(shù)之一，是鑒別各種氨基酸的重要依據(jù)1，氨基酸的旋光性2，氨基酸的光吸收構(gòu)成蛋白質(zhì)的20種氨基酸在可見光區(qū)都沒有光吸收，但在遠(yuǎn)紫外區(qū)(<220nm)均有光吸收。在近紫外區(qū)(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。酪氨酸的max＝275nm，275=1.4x103;苯丙氨酸的max＝257nm，257=2.0x102;色氨酸的max＝280nm，280=5.6x103;3，氨基酸的離解性質(zhì)氨基酸在結(jié)晶形態(tài)或在水溶液中，并不是以游離的羧基或氨基形式存在，而是離解成兩性離子。在兩性離子中，氨基是以質(zhì)子化(-NH3+)形式存在，羧基是以離解狀態(tài)(-COO-)存在。在不同的pH條件下，兩性離子的狀態(tài)也隨之發(fā)生變化。甘氨酸的酸堿滴定曲線谷氨酸的酸堿滴定曲線組氨酸的酸堿滴定曲線4，氨基酸的等電點(diǎn)

當(dāng)溶液濃度為某一pH值時(shí)，氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-數(shù)目正好相等，凈電荷為0。這一pH值即為氨基酸的等電點(diǎn)，簡稱pI。在等電點(diǎn)時(shí)，氨基酸既不向正極也不向負(fù)極移動，即氨基酸處于兩性離子狀態(tài)。側(cè)鏈不含離解基團(tuán)的中性氨基酸，其等電點(diǎn)是它的pK’1和pK’2的算術(shù)平均值：pI=(pK’1+pK’2)/2

同樣，對于側(cè)鏈含有可解離基團(tuán)的氨基酸，其pI值也決定于兩性離子兩邊的pK’值的算術(shù)平均值。酸性氨基酸：pI=(pK’1+pK’R-COO-

)/2

鹼性氨基酸：pI=(pK’2+pK’R-NH2)/2第二節(jié)多肽一個(gè)氨基酸的氨基與另一個(gè)氨基酸的羧基之間失水形成的酰胺鍵稱為肽鍵，所形成的化合物稱為肽。一、多肽的結(jié)構(gòu)由兩個(gè)氨基酸組成的肽稱為二肽，由多個(gè)氨基酸組成的肽則稱為多肽。組成多肽的氨基酸單元稱為氨基酸殘基。多肽的形成與結(jié)構(gòu)

在多肽鏈中，氨基酸殘基按一定的順序排列，這種排列順序稱為氨基酸順序通常在多肽鏈的一端含有一個(gè)游離的-氨基，稱為氨基端或N-端；在另一端含有一個(gè)游離的-羧基，稱為羧基端或C-端。氨基酸的順序是從N-端的氨基酸殘基開始，以C-端氨基酸殘基為終點(diǎn)的排列順序。如上述五肽可表示為：

Ser–Gly–Tyr–Ala–Leu二、肽鍵肽鍵的特點(diǎn)是氮原子上的孤對電子與羰基具有明顯的共軛作用。組成肽鍵的原子處于同一平面。肽鍵中的C-N鍵具有部分雙鍵性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)。在大多數(shù)情況下，以反式結(jié)構(gòu)存在。四肽的結(jié)構(gòu)三、多肽的性質(zhì)

多肽分子中含有游離的末端氨基和羧基，氨基酸殘基的側(cè)鏈上也含有可離解基團(tuán)，因此，多肽可以看成是一個(gè)“大氨基酸”。多肽在水溶液中也以兩性離子的形式存在，有等電點(diǎn)。在等電點(diǎn)時(shí)，正離子數(shù)目與負(fù)離子數(shù)目相等，凈電荷為零。等電點(diǎn)的高低，主要取決于側(cè)鏈上的堿性和酸性基團(tuán)的相對數(shù)目。

1，多肽的兩性離解

2，多肽鏈的水解

多肽的肽鍵與一般的酰胺鍵一樣，可以被酸或堿水解，也可以被酶水解。根據(jù)多肽水解程度的不同可以分為完全水解和部分水解。完全水解得到各種氨基酸的混合物，部分水解通常得到多肽片段。酸或堿能夠?qū)⒍嚯耐耆?，酶水解一般是部分水解?/p>

四、天然存在的重要多肽在生物體中，多肽最重要的存在形式是作為蛋白質(zhì)的亞單位。但是，也有許多分子量比較小的多肽以游離狀態(tài)存在。這類多肽通常都具有特殊的生理功能，常稱為活性肽。如：腦啡肽；激素類多肽；抗生素類多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。鵝膏覃堿Met-腦啡肽Leu-腦啡肽牛催產(chǎn)素（九肽）

短桿菌肽S(環(huán)十肽)

谷胱甘肽-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸，簡寫為GSH，是廣泛存在于動物和植物細(xì)胞中的一種三肽，在生物體內(nèi)發(fā)生的氧化還原反應(yīng)中起重要作用。它有兩種存在形式，即還原型和氧化型：

合成的肽甜味二肽

阿斯巴甜-天冬氨酰-苯丙氨酸甲酯，白色結(jié)晶，稀溶液的甜度約為蔗糖的100～200倍。

紐甜（Neotame）N-[N-（3,3-二甲基丁基）-L-α-天門冬氨酰]-L-苯丙氨酸1-甲酯。

第三節(jié)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)是由一條或多條多肽鏈以特殊方式結(jié)合而成的生物大分子。蛋白質(zhì)與多肽并無嚴(yán)格的界線，通常是將分子量在6000道爾頓以上的多肽稱為蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)分子量變化范圍很大,從大約6000到1000000道爾頓甚至更大。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，1969年國際純化學(xué)與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會（IUPAC）對蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的不同層次作了界定主要包括以肽鏈線性結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的一級結(jié)構(gòu)，以及由肽鏈卷曲、折疊而形成的三維結(jié)構(gòu)-蛋白質(zhì)的二級、三級和四級結(jié)構(gòu)。一、蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)(Primarystructure)包括組成蛋白質(zhì)的多肽鏈數(shù)目.多肽鏈的氨基酸順序，以及多肽鏈內(nèi)或鏈間二硫鍵的數(shù)目和位置。其中最重要的是多肽鏈的氨基酸順序，它是蛋白質(zhì)生物功能的基礎(chǔ)。牛胰核糖核酸酶的一級結(jié)構(gòu)

二、蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)是指肽鏈的主鏈在空間的排列。它只涉及肽鏈主鏈的構(gòu)象及鏈內(nèi)或鏈間形成的氫鍵。肽鏈主鏈的構(gòu)象是由肽鍵的特殊結(jié)構(gòu)決定的。組成肽鍵的原子都處于同一平面。在肽鏈中，兩個(gè)相鄰的肽鍵通過一個(gè)共同的-碳原子相連接。由于C-N和C-C鍵可以自由旋轉(zhuǎn)，因此，在保持肽鍵平面結(jié)構(gòu)不變的條件下，能夠形成不同的空間排列。

二面角（ф，ψ）一個(gè)肽平面圍繞N1-C旋轉(zhuǎn)的角度用ф表示；另一個(gè)肽平面圍繞C-C2旋轉(zhuǎn)的角度，用ψ表示。這兩個(gè)旋轉(zhuǎn)角度叫二面角。一對二面角（ф，ψ）決定了與一個(gè)-碳原子相連的兩個(gè)肽平面的相對位置

肽平面的幾種不同的構(gòu)象類型

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的類型維持主鏈空間排列的另一個(gè)重要因素是氫鍵。主鏈中的-C=O和-N-H能夠相互形成鏈內(nèi)或鏈間的氫鍵。在各種可能的構(gòu)象中，能夠形成氫鍵最多的構(gòu)象最穩(wěn)定。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)主要有-螺旋、-折疊、-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲。多肽鏈中的各個(gè)肽平面圍繞同一軸旋轉(zhuǎn)，形成螺旋結(jié)構(gòu)，螺旋一周，沿軸上升的距離即螺距為0.54nm,含3.6個(gè)氨基酸殘基；兩個(gè)氨基酸之間的距離為0.15nm;肽鏈內(nèi)形成氫鍵，氫鍵的取向幾乎與軸平行，第一個(gè)氨基酸殘基的酰胺基團(tuán)的-CO基與第四個(gè)氨基酸殘基酰胺基團(tuán)的-NH基形成氫鍵。蛋白質(zhì)分子為右手-螺旋。（1）-螺旋肽鏈-螺旋結(jié)構(gòu)的四種表示方法

-螺旋（2）-折疊-折疊是由兩條或多條幾乎完全伸展的肽鏈平行排列，通過鏈間的氫鍵交聯(lián)而形成的。肽鏈的主鏈呈鋸齒樁折疊構(gòu)象在-折疊中，-碳原子總是處于折疊的角上，氨基酸的R基團(tuán)處于折疊的棱角上并與棱角垂直，兩個(gè)氨基酸之間的軸心距為0.35nm；-折疊結(jié)構(gòu)的氫鍵主要是由兩條肽鏈之間形成的；也可以在同一肽鏈的不同部分之間形成。幾乎所有肽鍵都參與鏈內(nèi)氫鍵的交聯(lián)，氫鍵與鏈的長軸接近垂直。-折疊有兩種類型。一種為平行式，即所有肽鏈的N-端都在同一邊。另一種為反平行式，即相鄰兩條肽鏈的方向相反。（2）-折疊蛋白質(zhì)-折疊結(jié)構(gòu)的順反形式

（3）-轉(zhuǎn)角-turn在-轉(zhuǎn)角部分，由四個(gè)氨基酸殘基組成;彎曲處的第一個(gè)氨基酸殘基的-C=O和第四個(gè)殘基的–N-H之間形成氫鍵，形成一個(gè)不很穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。這類結(jié)構(gòu)主要存在于球狀蛋白分子中。蛋白質(zhì)的兩種主要-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)

由于甘氨酸和脯氨酸結(jié)構(gòu)的特殊性，常常出現(xiàn)在-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)中。

無序蛋白無序蛋白(disorderedproteins)，也稱天然未折疊蛋白(nativelyunfoldedproteins)或內(nèi)在無結(jié)構(gòu)蛋白(intrinsicallyunstructuredproteins,IUPs)，指該蛋白質(zhì)在體外中性pH條件下缺乏有序結(jié)構(gòu)，即特定的三級結(jié)構(gòu)。無序蛋白是構(gòu)成真核生物蛋白質(zhì)的一大部分，約占總蛋白質(zhì)的30％。無序蛋白通常具有生物功能，這也是對“功能蛋白質(zhì)通常需要一個(gè)穩(wěn)定的高級結(jié)構(gòu)(三級或四級)”這一傳統(tǒng)觀念的巨大挑戰(zhàn)。

根據(jù)所含無序結(jié)構(gòu)的多少，可將無序蛋白分為兩大類：完全無序蛋白(全序列無序)和部分無序蛋白(局部超過30-40個(gè)殘基的區(qū)域無序。完全無序蛋白又可分為完全不含二級結(jié)構(gòu)和含部分二級結(jié)構(gòu)兩種。1-5：部分無序蛋白；6-7：完全無序蛋白0:有序蛋白無序蛋白的結(jié)構(gòu)特征：1，含有大量重復(fù)序列；2，通常具有較高的親水性和帶電性。無序蛋白的功能通常涉及到與其相應(yīng)配體的結(jié)合，這些配體如蛋白質(zhì)、核酸，而且這種結(jié)合常常是在其無序結(jié)構(gòu)進(jìn)行一定折疊后所誘導(dǎo)的。到目前為止，所發(fā)現(xiàn)的無序蛋白功能已超過30種，其中伴侶分子是最能體現(xiàn)無序蛋白功能的一類分子。伴侶分子通常參與RNA和蛋白質(zhì)分子的折疊過程，而其中的無序區(qū)域起著關(guān)鍵作用，刪除或替代這些區(qū)域常使伴侶分子喪失功能。三、蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)(TertiaryStructure)是指在二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，肽鏈的不同區(qū)段的側(cè)鏈基團(tuán)相互作用在空間進(jìn)一步盤繞、折疊形成的包括主鏈和側(cè)鏈構(gòu)象在內(nèi)的特征三維結(jié)構(gòu)。維系這種特定結(jié)構(gòu)的力主要有氫鍵、疏水鍵、離子鍵和范德華力等。尤其是疏水鍵，在蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)中起著重要作用。生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的類型球狀蛋白質(zhì)-主要是可溶性蛋白，存在與細(xì)胞質(zhì)中。纖維狀蛋白質(zhì)-主要是細(xì)胞骨架類蛋白，存在于細(xì)胞間，細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞器內(nèi)。膜蛋白-主要是細(xì)胞上的受體蛋白，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和通道蛋白。1，超二級結(jié)構(gòu)在某些具有特殊功能的球狀蛋白質(zhì)分子中，常常出現(xiàn)許多相鄰的二級結(jié)構(gòu)單元按照一定規(guī)律、規(guī)則地組合在一起，彼此相互作用，形成在空間構(gòu)象上有區(qū)別的二級結(jié)構(gòu)組合單位，稱為超二級結(jié)構(gòu)。它可以作為構(gòu)成三級結(jié)構(gòu)的元件。超二級結(jié)構(gòu)有（兩個(gè)-螺旋互相纏繞構(gòu)成）、（兩個(gè)-折疊通過一段肽鏈連接）、（三段-折疊鏈和兩段-螺旋組成）和（三條反平-折疊通過-轉(zhuǎn)角連接）等幾種類型。結(jié)構(gòu)域（structuraldomain）對于一些相當(dāng)大的蛋白質(zhì)分子，一條長的多肽鏈，有時(shí)要先分別折疊成幾個(gè)相對獨(dú)立的區(qū)域，再組裝成球狀或顆粒狀的復(fù)雜構(gòu)象（三級結(jié)構(gòu)）。這種在二級結(jié)構(gòu)或超二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上形成的特定區(qū)域稱為結(jié)構(gòu)域（structuraldomain）。每個(gè)結(jié)構(gòu)域自身都是緊密裝配的，但結(jié)構(gòu)域之間的聯(lián)系是比較松散的，因此在兩個(gè)結(jié)構(gòu)域間常常形成空穴。不同的蛋白質(zhì)，其結(jié)構(gòu)域的數(shù)目各不相同。蛋白質(zhì)分子分成幾個(gè)結(jié)構(gòu)域的現(xiàn)象，通常與蛋白質(zhì)的功能有關(guān)。2，三級結(jié)構(gòu)的折疊類型

以結(jié)構(gòu)域?yàn)閱挝?，根?jù)二級結(jié)構(gòu)的類型、數(shù)量、組合方式等，三級結(jié)構(gòu)主要有以下幾種類型。（1）全類型:蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的二級結(jié)構(gòu)以-螺旋為主，各段-螺旋通過反平行或近于相互垂直的狀態(tài)連接，排列成層，再平行疊起，從而形成三級結(jié)構(gòu)的構(gòu)象基礎(chǔ)。（2）平行/類型

整個(gè)肽鏈中-螺旋與-折疊交替存在，卷曲組成多層，一般平行的-折疊片層在結(jié)構(gòu)域的內(nèi)部，-螺旋覆蓋在外部，實(shí)際上是超二級結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步連接擴(kuò)充，大多數(shù)卷曲成右手交叉連接。（3）反平行類型:主要由-折疊片層反平行排列形成，鏈之間以-轉(zhuǎn)角連接，或者以跳過相鄰鏈的條帶而進(jìn)行連接。常見的希臘花邊桶的鏈呈反時(shí)針方向盤繞，桶的相對兩邊鏈呈右手交叉連接。（4）不規(guī)則結(jié)構(gòu)類型：許多小蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)不規(guī)則，其中正規(guī)的二級結(jié)構(gòu)單元較少，沒有上述幾種結(jié)構(gòu)類型。有些蛋白質(zhì)富含金屬元素，有些富含二硫鍵。

3，多結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)

大分子的蛋白質(zhì)往往具有多個(gè)結(jié)構(gòu)域，其三級結(jié)構(gòu)是在結(jié)構(gòu)域構(gòu)象的基礎(chǔ)上通過肽鏈連接形成的。免疫球蛋白G-晶體蛋白四、蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)(QuaternaryStructure)是指由多條各自具有一、二、三級結(jié)構(gòu)的肽鏈通過非共價(jià)鍵連接起來的結(jié)構(gòu)形式；各個(gè)亞基在這些蛋白質(zhì)中的空間排列方式及亞基之間的相互作用關(guān)系。蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)主要涉及具有三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈聚合形成蛋白質(zhì)時(shí)的空間排列方式和相互作用。許多天然球狀蛋白質(zhì)多是由兩條或多條肽鏈構(gòu)成的，在這些蛋白質(zhì)分子中，肽鏈之間沒有共價(jià)鍵連接，每條肽鏈各自具有一、二、三級結(jié)構(gòu)。1，寡聚蛋白的亞基數(shù)目

這種蛋白質(zhì)分子中，最小的單位通常稱為亞基或亞單位（Subunit），它一般由一條肽鏈構(gòu)成，無生理活性；維持亞基之間的化學(xué)鍵主要是疏水力。由多個(gè)亞基聚集而成的蛋白質(zhì)常常稱為寡聚蛋白。

蛋白質(zhì)亞基數(shù)目醇脫氫酶2蘋果酸脫氫酶2醛縮酶33-磷酸甘油醛脫氫酶4乳酸脫氫酶4血紅蛋白4谷氨酸合成酶12蕃茄株低矮病毒外殼蛋白1802，寡聚蛋白亞基的排列方式球狀蛋白三級結(jié)構(gòu)的主要特征絕大多致的蛋白質(zhì)折疊成為近乎球狀的結(jié)構(gòu)。球狀蛋白質(zhì)一旦具有三級結(jié)構(gòu)后，蛋白質(zhì)內(nèi)部變得更為緊密，內(nèi)部的空間約有75％被原子所充滿。1,存在于蛋白質(zhì)內(nèi)部主要是一些非極性殘基的側(cè)鏈，約有63％是丙氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、有氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸等；帶電的殘基，天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸和精氨酸只有4％。約95％的帶電的側(cè)鏈?zhǔn)欠植荚诘鞍踪|(zhì)的表面；約14％的亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸在蛋白質(zhì)分子表面。2,原則上，一些相對規(guī)則的-螺旋和-折疊分布在球狀蛋白的內(nèi)部，而且壓積得很緊密，致使球狀蛋白成為致密的結(jié)構(gòu)；那些連接-螺旋和-折疊疊的規(guī)整性相對差一些的二級結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)角和環(huán)狀以及特定的“無規(guī)”卷曲，則更多地是分布在球狀蛋白的外周。3,在很多蛋白質(zhì)分子的內(nèi)部還存在著數(shù)量不同的水分子，這些水分子也和一些極性的基因或負(fù)電性的原子形成氫鍵。其中一些水分子也參與了蛋白質(zhì)功能的行使。4,球狀蛋白的表面并不是非常光滑的，而是具有很多溝渠，經(jīng)常會出現(xiàn)一些“裂隙”或“洞穴”，在“裂隙”或“洞穴’’的周圍常常是疏水性的：這些“裂隙”或“洞穴”可能是蛋白質(zhì)(酶)的活性部位所在。5，對于蛋白質(zhì)來說，為了維持蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象和功能，其分子的周圍必須存在一個(gè)水層。至于需要多少水才能保持蛋白質(zhì)的活性,則取決于蛋白質(zhì)的分子大小、形狀、表面電荷、疏水及親水性質(zhì)等。蛋白質(zhì)分子周圍存在的水分子可以分為兩類：一類是與蛋白質(zhì)緊密地結(jié)合的“結(jié)合水”；結(jié)合水是直接與蛋白質(zhì)分子相互作用的一類水分子（主要是以氫鍵形式與蛋白分子結(jié)合），對蛋白質(zhì)構(gòu)象的形成和維持等起著關(guān)鍵的作用。另一類是與蛋白松散結(jié)合起溶劑作用的“大量水”。大量水主要是作為溶劑起作用，雖然對維持蛋白的活性也很重要，但可以部分被有機(jī)溶劑等取代。6,蛋白質(zhì)中的部分二級結(jié)構(gòu)并不是永久不變的，由于在蛋白質(zhì)的內(nèi)部也存在極少量的親水殘基，在蛋白質(zhì)分子的表面也常見到一些疏水的殘基。這些“異?！狈植嫉臍埢?，致使肽鏈的局部結(jié)構(gòu)發(fā)生“扭曲”，從而相對地處于較不穩(wěn)定的狀態(tài)，有時(shí)可隨著環(huán)境因素的變化而進(jìn)行結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)換。如酶的底物，小分子化合物以及酸堿、金屬離子等。瘋牛病(MCD)-朊蛋白而蛋白質(zhì)與配體（底物、藥物等）結(jié)合時(shí)，蛋白質(zhì)核心部分的結(jié)構(gòu)在結(jié)合前后基本不變，以維持蛋白質(zhì)整體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。只有少數(shù)的局部區(qū)域(柔性區(qū)域)會在與配體結(jié)合時(shí)，構(gòu)象作出適應(yīng)性的變化，產(chǎn)生“誘導(dǎo)契合效應(yīng)”，以利于蛋白質(zhì)和配體的高度選擇性的結(jié)合。谷氨酸受體與谷氨酸結(jié)合過程中的構(gòu)象變化乳鐵蛋白在與Fe離子結(jié)合過程中構(gòu)象變化硫氧還蛋白

的結(jié)構(gòu)緊密結(jié)合水親水性殘基疏水性殘基溶菌酶的結(jié)構(gòu)肌紅蛋白的結(jié)構(gòu)第四節(jié)、化合物質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用在蛋白質(zhì)體外的應(yīng)用中，一般涉及到分離純化、儲存、含量檢測等過程，其中常常發(fā)生化學(xué)物質(zhì)與蛋白質(zhì)非專一性的相互作用，如沉淀作用、變性作用、穩(wěn)定作用以及化學(xué)修飾作用等。在藥物以及化學(xué)生物學(xué)研究中，藥物、酶的底物或小分子探針等常常與蛋白質(zhì)發(fā)生較為專一性的相互作用。藥物與蛋白激酶乳酸脫氫酶與底物一、蛋白質(zhì)表面水層被破壞1，當(dāng)向蛋白質(zhì)溶液中加入高濃度的無機(jī)鹽時(shí)，鹽與水分子結(jié)合，水分子就離開蛋白質(zhì)的周圍，暴露出疏水區(qū)域，疏水區(qū)域間的相互作用，使蛋白質(zhì)聚集而沉淀，疏水區(qū)域越多，就越易產(chǎn)生沉淀。如鹽析-硫酸銨沉淀。2，水互溶性有機(jī)溶劑濃度達(dá)到一定濃度時(shí)，在疏水區(qū)域附近近有序排列的水分子可以被有機(jī)溶劑所取代，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子聚集而沉淀。最常用的溶劑是乙醇和丙酮，加量在20%-50%（V/V））之間。濃度過高會使蛋白質(zhì)表面的結(jié)合水失去，導(dǎo)致其失去活性。3，許多非離子型聚合物，包括聚乙二醇（PEG）可用來進(jìn)行選擇性沉淀以純化蛋白質(zhì)。聚合物的作用認(rèn)為與有機(jī)溶劑相似，能降低水化度，使蛋白質(zhì)沉淀。一般PEG的分子量需大于4000，最常用的是6000和20000。所用的PEG濃度通常為20%，濃度再高，會使粘度增大，造成沉淀的回收比較困難。

二、改變蛋白質(zhì)表面電荷分布1，由于酸性、堿性氨基酸多數(shù)分布在蛋白質(zhì)表面，溶液pH的改變會導(dǎo)致表面電荷的狀態(tài)，造成蛋白質(zhì)溶解度降低而沉淀，也會造成親水性變化，使其構(gòu)象變化，生物活性發(fā)生改變或喪失。如等電點(diǎn)沉淀，有機(jī)酸沉淀，pH對酶催化的影響等。pH對-乳球蛋白溶解度的影響

2，聚電解質(zhì)（高分子化合物），如羧甲基纖維素，海藻酸鹽，果膠酸鹽和卡拉膠等，一些陰離子聚合物，如聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸，以及一些陽離子聚合物如聚乙烯亞胺和以聚苯乙烯為骨架的季胺鹽。它們通過靜電引力與蛋白質(zhì)表面的相反電荷作用，改變了其表面的電荷狀態(tài)，不但可以造成蛋白質(zhì)沉淀，也可以影響其生物活性。也可能影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。三、改變蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)是由疏水相互作用、靜電相互作用、氫鍵、范德華力這些弱相互作用力及二硫鍵所維持的。在分離提純、使用、儲存過程中,攪拌、升溫、pH變化、鹽濃度變化、添加表面活性劑或有機(jī)溶劑等因素對大部分蛋白質(zhì)都有造成結(jié)構(gòu)變化的可能。而目標(biāo)蛋白質(zhì)自身濃度的變化也有可能造成三維結(jié)構(gòu)的變化,導(dǎo)致失活。失活的蛋白質(zhì)就成為雜質(zhì),不僅無用,還可能有毒。蛋白質(zhì)構(gòu)象變化1，蛋白質(zhì)濃度細(xì)胞中成千上萬種生物分子以不同的濃度發(fā)揮著各自的生理作用，但是體外研究中常常忽略細(xì)胞內(nèi)的擁擠環(huán)境。體外模擬反應(yīng)都是在稀溶液中進(jìn)行。而真實(shí)的細(xì)胞內(nèi)是異常擁擠不堪的。細(xì)胞內(nèi)含有大量的多糖、蛋白質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)，這些大分子以不同的濃度存在，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)所有大分子的濃度估計(jì)高達(dá)80-200g/L，細(xì)胞容積的20%-30%都被大分子占用，細(xì)胞內(nèi)是高度擁擠的大分子環(huán)境。

細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)擁擠環(huán)境圖許多蛋白質(zhì)在一般緩沖溶液中的穩(wěn)定性相當(dāng)?shù)停承┟傅鞍兹芤涸?7C放置的半衰期僅幾個(gè)小時(shí)。這種穩(wěn)定性降低的原因常常是某些物理或化學(xué)因素破壞了維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的天然狀態(tài)，引起蛋白質(zhì)理化性質(zhì)改變并導(dǎo)致其生理活性喪失，這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的變性。細(xì)胞內(nèi)的擁擠環(huán)境限制了蛋白質(zhì)相互反應(yīng)過程中的構(gòu)象變化。但是，在我們使用蛋白質(zhì)（酶）時(shí)，蛋白質(zhì)的濃度都是極稀的，一般在0.1mg-100mg/L，甚至更低。過低的蛋白質(zhì)濃度使蛋白質(zhì)的構(gòu)象不斷變化，導(dǎo)致生物活性下降。2，物理因素溫度是影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性最重要的因素。細(xì)胞機(jī)械破碎、錯(cuò)流式膜過濾等操作必然有升溫的問題，有可能造成蛋白質(zhì)的熱變性。一般而言,大多數(shù)蛋白質(zhì)在0-4C

之間較穩(wěn)定。而大多數(shù)的熱變性都是不可逆的。一些蛋白質(zhì)對溶液的凍融也很敏感。蛋白質(zhì)的器壁吸附現(xiàn)象，這個(gè)現(xiàn)象幾乎在蛋白質(zhì)與固相表面接觸的同時(shí)即會發(fā)生,最大量的吸附往往發(fā)生在蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)附近。吸附受到器壁表面性質(zhì)、蛋白質(zhì)性質(zhì)及溶液條件的影響,其中最主要的影響因素是表面能量。大多數(shù)蛋白質(zhì)與聚苯乙烯的吸附即是不可逆的。

3，化學(xué)因素（1）強(qiáng)酸和強(qiáng)堿，強(qiáng)的無機(jī)酸堿及有機(jī)酸堿都可以改變蛋白質(zhì)溶液的pH，引起蛋白質(zhì)表面必需基團(tuán)的電離，由于各氨基酸殘基所帶電荷的相互吸引或排斥使蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化，改變了原來蛋白質(zhì)表面的電荷分布，使蛋白質(zhì)構(gòu)象重新排布，導(dǎo)致不可逆失活。（2）有機(jī)溶劑，水互溶有機(jī)溶劑可以使酶、蛋白質(zhì)失去活性，是因?yàn)橛袡C(jī)溶劑取代了蛋白質(zhì)表面的結(jié)合水，并通過疏水作用與蛋白質(zhì)結(jié)合，改變了溶液的介電常數(shù)，從而影響維持蛋白質(zhì)天然構(gòu)象的非共價(jià)力的平衡。3，去污劑和表面活性劑；去污劑一般分為離子型和非離子型兩大類，都具有長鏈?zhǔn)杷埠陀H水的極性頭。當(dāng)少量的陰離子去污劑（如十二烷基硫酸鈉，SDS）單體加入到蛋白質(zhì)溶液中時(shí)，去污劑與蛋白質(zhì)表面的疏水區(qū)域結(jié)合。隨著加入量增加，與蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)達(dá)到飽和，這時(shí)去污劑則以協(xié)同方式結(jié)合于蛋白質(zhì)其它位點(diǎn)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)伸展，分子內(nèi)部的疏水性氨基酸殘基暴露，并進(jìn)一步與去污劑結(jié)合，直到達(dá)到飽和為止，從而使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆變性。4，變性劑，如高濃度脲（8-10mol/L）和鹽酸胍（6mol/L）常常用于蛋白質(zhì)變性和復(fù)性研究，由于脲或鹽酸胍與蛋白質(zhì)多肽鏈作用，破壞了蛋白質(zhì)分子內(nèi)維持其二級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)的氫鍵，引起蛋白質(zhì)不可逆失活。四、化學(xué)物質(zhì)對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定作用

蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性是指蛋白質(zhì)抵抗各種因素的影響，保持其生物活性的能力。根據(jù)生物體內(nèi)蛋白質(zhì)等存在的狀態(tài)，可以利用化學(xué)物質(zhì)或化學(xué)方法使蛋白質(zhì)穩(wěn)定化，以有利于蛋白質(zhì)在體外的應(yīng)用。通過研究蛋白質(zhì)的變性及穩(wěn)定性，可以了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能與穩(wěn)定性的關(guān)系等。在蛋白質(zhì)（酶）分離、純化、儲藏和應(yīng)用中，可以通過化學(xué)方法使蛋白質(zhì)穩(wěn)定。其中常用的方法有以下幾種：固定化：將酶或蛋白質(zhì)多點(diǎn)連接于載體上（無機(jī)載體、高分子載體）；添加劑：保護(hù)蛋白質(zhì)（酶）不被氧化、不受變性劑變性等化學(xué)修飾：共價(jià)交聯(lián)，使蛋白質(zhì)構(gòu)象固化。穩(wěn)定劑共溶劑

糖類，醇氨基酸及其衍生物無機(jī)鹽，甘油，聚乙二醇等常用1-4M濃度共溶劑來穩(wěn)定蛋白質(zhì)和細(xì)胞器?？寡趸瘎?/p>

底物、輔酶金屬離子

化學(xué)交聯(lián)劑半胱氨酸，2-巰基乙醇還原谷胱甘肽，二巰基赤蘚醇等巰基試劑可防止巰基氧化植物抗氧化劑如兒茶酚黃酮等也具有保護(hù)作用酶可被底物輔酶、競爭性抑制劑及反應(yīng)產(chǎn)物等所穩(wěn)定。金屬離子不僅可以影響酶的活性，還可以影響酶的穩(wěn)定性如Ca2+多位點(diǎn)結(jié)合使得蛋白質(zhì)分子成為緊密的活性形式。交聯(lián)劑可在相隔較近的兩個(gè)氨基酸殘基之間，或蛋白質(zhì)與其他分子之間（如固定化載體）發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)使蛋白質(zhì)的構(gòu)象穩(wěn)定。五、化學(xué)物質(zhì)的共價(jià)修飾作用

由于大多數(shù)親水性氨基酸殘基都分布在蛋白質(zhì)表面，因此，一些活潑得到化學(xué)物質(zhì)可以直接與蛋白質(zhì)表面的活性基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，從而產(chǎn)生生理活性（包括藥理、毒理等）。除少數(shù)烷化劑外，絕大多數(shù)外源化合物需經(jīng)體內(nèi)代謝活化，轉(zhuǎn)變成親電子的活性代謝物，再與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)分子中的親核基團(tuán)反應(yīng)。其中的一些特殊的化合物也被用于研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，以及蛋白質(zhì)的標(biāo)記（如熒光探針）等。

1，蛋白質(zhì)分子中的可反應(yīng)基團(tuán)

蛋白質(zhì)中可以發(fā)生反應(yīng)的氨基酸殘基主要有：N-末端的氨基，賴氨酸殘基中的-氨基；半胱氨酸殘基中的巰基，絲氨酸及蘇氨酸殘基中的羥基，酪氨酸殘基中的酚羥基以及組氨酸殘基中的咪唑基和色氨酸殘基中的吲哚基。最容易發(fā)生反應(yīng)的主要是氨基和巰基。試劑類型化合物或前體反應(yīng)機(jī)制烷基化芳香基化鹵代物親核取代環(huán)氧化物硫酸烷基酯活潑的烯烴1,4-加成羰基化合物醛形成席佛堿?；袡C(jī)酸酐、酰氯等親核取代或加成磷酰化有機(jī)磷親核取代自由基·OH、·CCl3自由基反應(yīng)具有親電氮化合物芳香胺親核取代2.茚三酮反應(yīng)

在酸性條件下，氨基酸與茚三酮共熱，生成紫色化合物Pro的茚三酮反應(yīng)呈黃色Sanger法。2,4-二硝基氟苯在堿性條件下，能夠與肽鏈N-端的游離氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性條件下水解，得到黃色DNP-氨基酸。該產(chǎn)物能夠用乙醚抽提分離。不同的DNP-氨基酸可以用色譜法進(jìn)行鑒定。3,氨基的反應(yīng)

二硝基氟苯（DNFB）法在堿性條件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以與N-端氨基酸的游離氨基作用，得到丹磺酰氨基酸。此法的優(yōu)點(diǎn)是丹磺酰-氨基酸有很強(qiáng)的熒光性質(zhì)，檢測靈敏度可以達(dá)到110-9mol。3.氨基的反應(yīng)

丹磺酰氯法③Edman氨基酸順序分析法Edman（苯異硫氰酸酯法）氨基酸順序分析法實(shí)際上也是一種N-端分析法。此法的特點(diǎn)是能夠不斷重復(fù)循環(huán)，將肽鏈N-端氨基酸殘基逐一進(jìn)行標(biāo)記和解離。此反應(yīng)即是目前“蛋白質(zhì)順序測定”的設(shè)計(jì)原理④氨基的含量測定有許多化合物都可用來修飾賴氨酸殘基，三硝基苯磺酸(TNBS)就是其中非常有效的一種。TNBS與賴氨酸殘基反應(yīng)，在420nm和367nm能夠產(chǎn)生特定的光吸收。在蛋白質(zhì)序列分析中，用于多肽鏈N-末端殘基的測定的化合修飾方法--2，4-二硝基氟苯(DNFD)法、丹磺酰氯(DNS)法和)苯異硫氰酸酯(PITC)法都是常用的氨基修飾方法。

4，巰基的反應(yīng)分子氧、H2O2以及過氧化物（如過氧甲酸）、氧自由基等是最常見的氧化劑，在生物體內(nèi)，蛋白質(zhì)的氧化失活主要是通過活性氧（羥基自由基、超氧離子、過氧化氫、過氧化物）來完成的。這些氧化劑的殺菌作用主要也是造成蛋白質(zhì)失活。各種氧化劑能夠氧化芳香族側(cè)鏈的氨基酸以及甲硫氨酸、半胱氨酸和胱氨酸殘基。在堿性條件下，半胱氨酸可以被Cu2+氧化成次磺酸或亞磺酸或磺酸半胱氨酸。巰基的化學(xué)修飾

5,5'-二硫-2-硝基苯甲酸(DTNB)，又稱為Ellman試劑，目前已成為最常用的巰基修飾試劑。DTNB可以與巰基反應(yīng)形成二硫鍵，產(chǎn)生的5-巰基-2-硝基苯甲酸陰離子在412nm具有很強(qiáng)的吸收，可以很容易通過光吸收的變化來監(jiān)測反應(yīng)的程度。有機(jī)汞試劑是最早使用的巰基修飾試劑之一，其中最常用的是對氯汞苯甲酸，該化合物溶于水中形成羥基衍生物，與巰基相互作用時(shí)在255n