發(fā)酵飼料生產(chǎn)工藝與應(yīng)用講義

{生產(chǎn)管理培訓(xùn)}發(fā)酵飼料生產(chǎn)工藝與應(yīng)用講義發(fā)酵飼料生產(chǎn)工藝與應(yīng)用靈璧縣立騰同創(chuàng)農(nóng)牧科技有限責(zé)任公司二0一二年十一月目錄安徽省立騰同創(chuàng)農(nóng)牧科技有限公司簡介安徽省立騰同創(chuàng)農(nóng)牧科技有限公司企業(yè)文化安徽省立騰同創(chuàng)農(nóng)牧科技有限公司的十年發(fā)展戰(zhàn)略—————安徽省立騰同創(chuàng)農(nóng)牧科技有限公司的第一個發(fā)展五年發(fā)展計劃第一章發(fā)酵飼料生產(chǎn)的菌種及發(fā)酵工藝第二章發(fā)酵飼料生產(chǎn)技術(shù)第一章發(fā)酵飼料生產(chǎn)的菌種及發(fā)酵工藝第一節(jié)概述一、發(fā)酵飼料的定義料原料。采用發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)的動物飼料或飼料原料，其特性主要是：（1）含有大量的活性微生物；（2）多數(shù)以厭氧發(fā)酵方式進行生產(chǎn)；（3）未經(jīng)干燥的物料含水量通常在30%以上；（4）物料的酸性物質(zhì)明顯增加，營養(yǎng)組成更合理；（5）生產(chǎn)原料以植物性農(nóng)副產(chǎn)品為主。酵飼料。二、發(fā)酵飼料的概述厭氧發(fā)酵。發(fā)酵物料的含水量為30%~50%，發(fā)酵時間和溫度受環(huán)境影響很大，基本不進行人為控制和調(diào)節(jié)。物，能降低飼料生產(chǎn)成本，但基本不具備生物學(xué)活性和功能。本節(jié)主要論述厭氧固態(tài)發(fā)酵工藝，常規(guī)的發(fā)酵飼料生產(chǎn)流程如：原料→消毒→冷卻接種→培養(yǎng)→干燥→包裝的大劑量使用。合飼料中添加5.0%以上）使用高活菌含量的微生物發(fā)酵飼料可生產(chǎn)成本通常都在10元/kg10%的比例使用在配合800致生產(chǎn)設(shè)備投資增加的主要原因。如能簡化生產(chǎn)操作工藝步驟，用具備強大的市場競爭力。第二節(jié)發(fā)酵飼料的生產(chǎn)菌種和霉菌。一、乳酸菌目前生產(chǎn)中使用的乳酸菌至少有30性乳酸發(fā)酵和雙歧桿菌異型乳酸發(fā)酵。（一）同型乳酸發(fā)酵C6H12O6——→2CH3CH(OH)COOH酸乳球菌。（二）專性異型乳酸發(fā)酵C6H12O6——→CH3CH(OH)COOH+CH3COOH+CO2↑低得多，而且還有產(chǎn)氣損失。典型的生產(chǎn)菌種主要有:發(fā)酵乳桿菌、高加索酸奶桿菌、短乳桿菌、巴氏乳桿菌。（三）兼性乳酸發(fā)酵兩種代謝進行的程度和比例取決于菌種的性質(zhì)和外界培養(yǎng)條件。酒乳桿菌。（四）雙歧桿菌異型乳酸發(fā)酵2C6H12O6——→2CH3CH(OH)COOH+3CH3COOH度慢一些，而乳酸的生成速度卻快一些。醇和CO2。二、芽孢菌用芽孢桿菌發(fā)酵飼料的目的主要是為了消耗培養(yǎng)體系中殘留的氧氣，為乳酸菌創(chuàng)造一個厭氧環(huán)境。另外，近年來研究還發(fā)現(xiàn)，有些芽孢桿菌能產(chǎn)生殺滅大腸桿菌和沙門氏菌等有害微生物的類型的微生物細胞有破壞作用，對酵母菌和乳酸菌沒有影響。三、酵母菌度為25~35pH4.0~6.0（EMP20多種，主要為以下三種：釀快，在適宜的溫度和營養(yǎng)條件下，它們的世代倍增時間不超過3h，特別適合處理食品加工業(yè)產(chǎn)生的廢水。2~6μm乳酸菌的1000倍左右。工業(yè)生產(chǎn)中常用的酵母菌主要有釀酒酵理。四、霉菌目前在生產(chǎn)中應(yīng)用的霉菌有近十種，主要為：米曲霉、黑曲霉、5cm。點上說，霉菌發(fā)酵不適于生產(chǎn)飼料或者飼料原料。維素酶和蛋白酶的特性，利用廉價的粗蛋白原料作為發(fā)酵底物，生產(chǎn)高活性的蛋白飼料或者粗酶制劑。五、選用生產(chǎn)菌種的基本原則（一）安全性（必須同時符合以下兩個要求）（1）菌體本身不產(chǎn)生有毒有害物質(zhì)。（2）不會危害環(huán)境固有的生態(tài)平衡（主要針對某些基因工程（二）有效性（能滿足一個要求即可）（1）菌種本身具有很好的生長代謝活力，能有效降解大分子好抗?fàn)I養(yǎng)因子，合成小肽和有機酸等小分子物質(zhì)。（2）能保護和加強動物微生物區(qū)系的正平衡。這種功效主要是指能有效維護和提高有益微生物在動物消化道料的生產(chǎn)菌種本身就是從飼養(yǎng)的目標(biāo)動物的消化道中分離出來現(xiàn)第二種途徑的方式可以多種多樣，比較常用的有：耗盡氧氣，降低體系的氧化還原電位；降低環(huán)境的pH值；代謝物中含有能選擇性殺滅大腸桿菌和沙門氏菌等有害微生物的抗菌物質(zhì)等。第三節(jié)發(fā)酵飼料生產(chǎn)菌種之間的相互關(guān)系目前人類可利用的這些發(fā)酵技術(shù)基本上都是純培養(yǎng)技術(shù)，而實際上在自然界中很難找出單一微生物存在的生態(tài)環(huán)境。據(jù)已有的微生物研究報道，地球上存在的微生物超過100萬10研究的不超過1萬種。根據(jù)目前已有的研究成果，大體可以把微生物之間的關(guān)系分為以下幾種：中性共生、同住、互惠共生、共生、競爭、拮抗和寄生。一、中性共生這是指兩種或兩種以上的微生物同時存在于同一個環(huán)境中，但是它們之間沒有直接的生態(tài)關(guān)系，各自生活互不干擾。例如淡水中生長的衣藻和水生細菌。二、同住濃度的糖液（25%左右）中生長。當(dāng)糖被酵母菌消耗以后，糖濃另外一些只能利用還原性單糖的微生物生長提供營養(yǎng)。發(fā)酵飼料的重要理論基礎(chǔ)。三、互惠共生這是兩種微生物互惠互利的現(xiàn)象，比較典型的菌種是阿拉伯考慮這種組合優(yōu)勢。四、共生一個形態(tài)和生理單位。藍藻或藍細菌的細胞僅限于特定的層內(nèi)，料的生產(chǎn)過程中很難遇到，少有實用的例子。五、競爭爭往往表現(xiàn)的很激烈。件一旦改變，就可能被另一種微生物代替并發(fā)育成新的優(yōu)勢種。往往比較低，至少比同類的野生菌低。野生菌的代謝活動是很“經(jīng)濟的。如果從生長速度分析，它們的物質(zhì)和能量的利用效免。如何巧妙利用微生物之間的生存競爭是研究微生物發(fā)酵飼料生用微生物有益菌群種群優(yōu)勢發(fā)酵飼料的目的，但是到目前為止，有關(guān)方面的成熟技術(shù)還是很少。六、拮抗一種微生物可以產(chǎn)生不利于另一種微生物生存的代謝物質(zhì)，生物的生長，這種現(xiàn)象就稱為“拮抗。如：青貯飼料接種的乳酸菌和醋酸菌在發(fā)酵過程中，不斷降低pH值，結(jié)果絕大多數(shù)不生存。獲得的枯草芽孢桿菌MA139希望的。七、寄生究中還沒有遇到。核心。第四節(jié)發(fā)酵飼料的生產(chǎn)工藝一、固態(tài)厭氧發(fā)酵高活性生物飼料只要密封得當(dāng)，即使長期存放也不會腐敗變質(zhì)。目前比較典型的固態(tài)厭氧發(fā)酵生物飼料的成功例子主要有致，主要有酵母菌、乳酸菌和芽孢桿菌。30%~40%。下進行糖酵解，產(chǎn)生酒精和CO2，乳酸菌也同時增殖、代謝，產(chǎn)生有機酸。隨著袋內(nèi)氣壓的不斷增加，不斷有CO2帶著酒精和有物料發(fā)酵的成熟度。有氧發(fā)酵階段：C6H12O6+6O2——→6CO2+6H2O無氧發(fā)酵階段：C6H12O6——→2CO2+2C2H5OH(乙醇)3~5d如果環(huán)境溫度低于12CO2O2長時間與接種的乳酸菌接觸，會導(dǎo)致乳酸菌活力大減，甚至死亡。菌的含量能達到108cuf/g以上。將其在生羊配合飼料中添加15%~20%10%制的因素很多，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也很難把握，實際推廣有一定困難。個月以上；產(chǎn)品在儲存和運輸過程中不受外界空氣干擾。農(nóng)業(yè)部飼料工業(yè)中心的微生物發(fā)酵飼料課題組發(fā)明了呼吸膜可移動式固態(tài)厭氧發(fā)酵飼料（也稱袋裝發(fā)酵飼料）生產(chǎn)技術(shù)。這種發(fā)酵技術(shù)的具體工藝流程如圖1-1。壓的硅膠膜。在發(fā)酵過程中，微生物會產(chǎn)生CO2等氣體，使得袋從而也就排除了外界雜菌的干擾。原料不需要消毒就可以直接用于接種培養(yǎng)。這種工藝很簡單，如果以日產(chǎn)30t計算，設(shè)備投資不超過40萬元，特別適合在我國廣大農(nóng)村推廣使用。第三章發(fā)酵飼料生產(chǎn)技術(shù)第一節(jié)發(fā)酵飼料用乳酸菌的分離篩選乳酸菌是一類最常見的益生菌，生物飼料的發(fā)酵生產(chǎn)一般都少有20多種。大量實驗證明，只有動物消化道國有的微生物才菌是動物消化道內(nèi)起主要作用的微生物。一、樣品的采集本。E.ColiK88,這是一種常見的5~7d生羊進行屠宰，在無菌環(huán)境中提取它的胃液、小腸液和大腸液，迅速保存在無菌生理鹽水（NaCl的濃度為0.9%）中。適量的半胱氨酸，半胱氨酸有巰基（—SH可以消除溶液中殘余的氧。二、乳酸菌的分離純化對樣品進行選擇性增殖培養(yǎng)，以增加目標(biāo)乳酸菌的含量?？股嘏Ｄ讨醒a充6%~8%的蔗糖，高溫消毒、冷卻，然后用氮氣或者二氧化碳驅(qū)除溶液中殘留的空氣，再接入適量采集的樣品，在30~32℃條件下厭氧培養(yǎng)10~24h量比較低，可以適當(dāng)延長培養(yǎng)時間。下一步分離純化操作。乳酸菌分離培養(yǎng)基通常采用MRS瓊脂培養(yǎng)基，其營養(yǎng)組成與pH如下：蛋白胨：5.0g/L；牛肉浸膏：4.0g/L；酵母膏：2.0g/L；葡萄糖：12.0g/L；玉米漿：10.0mL;司盤80：1ml;磷酸氫二鉀：1.0g/L；三水乙酸鈉：3.0g/L；檸檬酸三銨：1.0g/L；硫酸鎂：0.1g/L；硫酸錳：0.03g/L；瓊脂：18.0g/L。pH6.2±0.2。加熱溶解上述各組分，配制成均勻的溶液，分裝在厭氧滾管中（每個管中加5~6mL115℃消毒殺菌30min50℃左右后，在冰水中滾動滾管，使固體培養(yǎng)基均勻凝固在管壁上。0.02%MRS分離培養(yǎng)基中加入適量的半胱氨酸可以在一定時間內(nèi)維持環(huán)境的低電位。了。30~32℃條件下培養(yǎng)1~2d。兩天以后不出現(xiàn)理想的菌落，可以再延長培養(yǎng)時間。雖然乳酸菌的最適宜生長溫度是37~40℃，但是在分離篩選過程差異可以更明晰，也更有利于挑選理想的菌種。經(jīng)過上述分離操作，我們獲得了5株乳酸菌，它們分別是：1.來源于羊胃的格氏乳桿菌（Lactobacillusgasseri）;2.來源于十二指腸的羅伊氏乳桿菌（Lactobacillusreuteri）;3.來源于小腸的屎腸球菌（Enterococcusfaecium）;4.來源于空腸的嗜酸乳桿菌（Lactobacillusacidophilus）;5.來源于結(jié)腸的發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillusfermentium三、發(fā)酵力和耐酸穩(wěn)定性分析菌的產(chǎn)量，具體方法如下：接種分離獲得的細菌純種于試管培養(yǎng)液中，30~32℃恒溫培養(yǎng)12h，然后再擴大接種到牛奶瓶中，30~32℃恒溫培養(yǎng)6h，測定乳酸含量?；?lián)苯作用生成在565nm565nm以通過測定565nm處的吸光度來測定乳酸的含量。實驗室乳酸含量的測定一、原理565nm乳酸含量。二、試劑1.4.0%硫酸銅溶液將4g無水硫酸銅溶解在水溶液中，定容至100ml。2.羥基聯(lián)苯（C6H5·C6H4OH）溶液將1g羥基聯(lián)苯溶解于100ml濃度為0.08mol/L的NaOH溶液中，儲存在褐色試劑瓶中。3.乳酸標(biāo)準(zhǔn)液將280mg純?nèi)樗徜嚾苡谒校涑?50mL溶液，其乳酸濃度為1mg/mL，存放于4℃冰箱中。在做標(biāo)準(zhǔn)曲線時將溶液稀釋10倍，使乳酸含量為100μg/mL123456mL稀釋液，稀釋配制成1，2，3，4，5，6μg/mL乳酸標(biāo)準(zhǔn)液。4.濃硫酸溶液在比色管中分別加入1mL乳酸標(biāo)準(zhǔn)液和0.05mL硫酸銅溶液，然后加入6mL濃硫酸，放置5min，冷卻至20℃以下。三、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備和乳酸含量的測定在上述比色管中加入0.05mL羥基聯(lián)苯溶液，混合均勻，在室溫下放置6~8h565nm線。（1）最大吸收波長的確定乳酸發(fā)酵液樣品顯色后，表明，最大吸收波長為565nm。圖2-1最大吸收波長的確定（2）最佳顯色條件的選擇A2B3C2D1E1F3鈣0.05g20%硫酸銅0.8ml6ml0.125ml，靜置時間15min，加熱顯色時間5min。（3）乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備乳酸標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液濃度在10~80μg/ml范圍內(nèi)與吸光度值基本呈60μg/ml時吸光度值大于1儀器誤差的因素，故制備標(biāo)準(zhǔn)曲線時濃度范圍取在15、20、25、3035404550μg/ml，得到如圖的乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為A=0.0189C－0.0808(A為吸光度值，C為乳酸濃度，n=8)r=0.998915~50μg/ml范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。（圖2-2：乳酸標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液濃度與吸光度值之間的關(guān)系）（圖2-3：乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線）耐酸穩(wěn)定性分析主要是考慮乳酸菌在實際使用過程中過動物胃酸的成活問題。生長育肥羊的胃酸pH比較低，一般的微生物1.0mL活菌數(shù)量已知的培養(yǎng)液，在無菌條件下，接種到生長羊、牛的胃液中，在37℃恒溫培養(yǎng)。同時做6個平行，每隔1h取樣1次，分析乳酸菌數(shù)量的變化。5率都在50%以上（見表2-4）表3-4各種乳酸細菌在生長羊胃液中的穩(wěn)定性時間/h123456格氏乳桿菌存活率/%88.282.691.495.8112136羅伊氏乳桿菌存活率/%88.481.371.466.957.246.8屎腸球菌存活率/%86.562.176.371.264.855.6嗜酸乳桿菌存活率/%91.288.684.276.871.364.2發(fā)酵乳桿菌存活率/%94.692.891.488.586.384.6變異，安全無毒?？梢源罅繎?yīng)用在牛、羊等飼料中。pH保護的功能。第二節(jié)發(fā)酵飼料用芽孢桿菌的分離篩選和安全性評價芽孢桿菌也是一類比較常見的發(fā)酵飼料生產(chǎn)菌，但是這類菌的應(yīng)用效果與菌種來源、飼養(yǎng)環(huán)境和動物類型都有很大的關(guān)系。雖然種類很多，但是真正能體現(xiàn)出穩(wěn)定的、優(yōu)良效果的還很少。乳酸菌和酵母菌的安全穩(wěn)定性一般都很可靠（一些耗氧發(fā)酵主管部門關(guān)注的重點。芽孢桿菌一般都不是動物消化道內(nèi)固有菌，它們發(fā)揮作用的原因至今還沒有統(tǒng)一的定論。但是目前人們對兩點原因是比較認可的：產(chǎn)生能殺滅大腸桿菌和沙門氏菌等有害微生物的酸菌的生長繁殖創(chuàng)造厭氧環(huán)境。芽孢桿菌的分離篩選主要也是依據(jù)上述兩個原則。安全性評價主要依據(jù)抗生素敏感性以及致毒性，相關(guān)的技術(shù)都比較成熟。一、樣品的采集和初篩與乳酸菌的分離篩選一樣，目標(biāo)芽孢桿菌也是從發(fā)生了瘟疫的動物養(yǎng)殖場或者進行攻毒試驗幸存的動物體中篩選。1.樣品的采集與初篩在發(fā)生了大批死亡的養(yǎng)殖場里，我們從土壤和糞便中采集樣品，共需采集24個樣品，每個樣品約2g，在無菌條件下分別保存在20mL12h內(nèi)進行后續(xù)的培養(yǎng)分離，具體方法如下：（1）取0.5ml樣品液，加入到5ml的復(fù)合營養(yǎng)肉湯（MNB）中。MNB培養(yǎng)基組成與pH：葡萄糖：5.0g/L;蛋白胨：5.0g/L；牛肉膏：3.0g/L;酵母浸粉：1.0g/L;MgSO4·H2O:0.005g/L。pH:7.0±0.2120℃消毒30min冷卻到常溫，備用。（2）從24種樣品中分離得到芽孢桿菌菌株約120株，這些芽孢桿菌均具有革蘭氏陽性、過氧化物酶陽性、產(chǎn)生好氧芽6株對E.coliK88具有強烈的抑制作用，它們都基本具備了芽孢桿菌的特性，將此6株菌株編號為：MA23MA139MA257MA59MA633和MA7446株作為后續(xù)復(fù)篩的備選菌種。二、菌種的復(fù)篩在芽孢桿菌的復(fù)篩過程中，設(shè)計了待篩菌與4種指示菌同步于候選菌株的富集生長；②采用指示菌混合培養(yǎng)，給候選的芽孢桿菌營造一個競爭的環(huán)境，有利于產(chǎn)生高抗菌活性的芽孢桿菌，并能在有限的環(huán)境中為爭奪營養(yǎng)條件，拮抗其他細菌而存活下來。同時在不同的試管中分別接種43.5約為106cfu/mL。表2-54種指示菌及其來源指示菌學(xué)名來源金黃色葡萄球StaphylococcusIVDCC56005中國獸醫(yī)微生物菌種保藏中菌SalmonellatyphimuriumIVDCC79-13心鼠傷寒沙門氏EsherichiacoliIVDCC83901中國獸醫(yī)微生物菌種保藏中菌EsherichiacoliIVDCC83529心大腸桿菌K88中國獸醫(yī)微生物菌種保藏中大腸桿菌K99心中國獸醫(yī)微生物菌種保藏中心在上述4個指示菌中，大腸桿菌K88的抵抗力最強，金黃色葡萄球菌抵抗力最弱。制備指示菌懸液時，用接種針從斜面上挑取少量的指示菌，分別接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（MNB）中，37℃培養(yǎng)18~24h，保證菌懸液的濃度為108cfu/mL左右。37℃混合震蕩培養(yǎng)48h70℃的水浴中保溫30min，殺死營養(yǎng)細胞。存活的芽孢經(jīng)過10倍稀釋，取一定的稀釋液涂布于MNA固體培養(yǎng)基（在MNB培養(yǎng)液中加入1.8%左右的瓊脂）平皿表面，使之形成單菌落。接種到試管斜面中，編號后保存在4℃冰箱中。然后在采用平板擴散的方法，將分離出來的芽孢桿菌用滅菌牙簽蘸取少許分別點種到倒好的MNA平板中（平板在使用前置于37℃下培養(yǎng)24h，除去部分水份以便于抗菌物質(zhì)在培養(yǎng)37℃培養(yǎng)24h的培養(yǎng)皿蓋上并熏蒸約40min，以便殺死活細胞并能讓菌落固定于平板的表面，然后移去培養(yǎng)皿蓋并讓平板里殘余的氯仿?lián)]發(fā)30min指示菌培養(yǎng)液，均勻布滿后傾倒出剩余的菌液，晾干平板，置平板于37℃培養(yǎng)16~18h的大小和清晰程度，來判斷受試菌對指示菌的抗菌能力。這6種芽孢桿菌當(dāng)中，MA139對4株指示菌表現(xiàn)出最強的抗菌能力（見表2-6、圖2-7表2-6初分離出6株芽孢桿菌對4株指示菌的抑菌圈直徑菌株抑菌圈直徑/mmE.coliK88E.coliK99S.typhimuriumMA2329.8±0.635.6±0.746.8±0.540.6±0.8MA13932.0±1.035.9±0.747.5±0.542.5±0.7MA35728.2±0.435.0±0.645.4±0.840.8±0.7MA55931.3±0.933.6±0.844.4±1.138.3±0.9MA63429.6±0.731.5±1.245.6±0.638.6±1.0MA74431.0±1.033.6±0.645.7±0.838.4±1.1注：表中值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。圖2-7MA139對指示菌的抑制作用（A、B、C、D分別代表對大腸桿菌K88、K99的抑制作用）三、芽孢桿菌的抗逆性試驗與乳酸細菌的耐受性試驗一樣，芽孢桿菌也需要進行類似的檢胰液素對它的毒害作用。分別提取生長羊（體重40~60kg）的胃食糜和小腸食糜，分別是用4生羊胃液中含有的食糜量對胃酸的pH一些（通常取10份）混合以后在用紗布擠壓過濾。經(jīng)過篩選出來細菌MA139MNB培養(yǎng)基中，37℃下225r/min震蕩培養(yǎng)36h，將培養(yǎng)液置于80℃水浴保溫15min，離心收集芽孢（相對離心力為2500×g，5minPBS:0.144%Na2HPO4,0.024%KH2PO4,pH7.0溶在PBS緩沖液中，即為菌懸液，用于后續(xù)的抗逆耐受性試驗。3h24h內(nèi)不生長，而24h后開始生長，培養(yǎng)液變得渾濁。在試驗的第5天，MA139在小MA139的芽孢可以在羊小腸中存活并通過營養(yǎng)體增殖。四、芽孢桿菌的鑒定通過上述的分離篩選，我們獲得了比較有價值的桿菌MA139，但必須做嚴(yán)格的鑒定。1.形態(tài)學(xué)鑒定蘭氏染色及芽孢染色。MA139的細胞呈直桿狀，芽孢橢圓形近中生，孢囊不膨大。在MNA培養(yǎng)基上培養(yǎng)12h，產(chǎn)生黏液，細胞形24h培養(yǎng)至36h，菌體均以休眠體芽孢的形式存在，菌落呈白色[圖2-8（1）]。在液體靜止培養(yǎng)時有菌膜形成。圖2-82.生理生化鑒定形態(tài)鑒定結(jié)果（圖2-8）符合芽孢桿菌的特性，接著進行生理生化鑒定。生理生化鑒定比較復(fù)雜，涉及的操作步驟很多。參照發(fā)酵試驗、需氧性測定、V-P試驗、淀粉水解試驗、明膠水解試驗、過氧化氫酶試驗、檸檬酸鹽利用試驗、石蕊牛奶試驗等。芽孢桿菌鑒定用培養(yǎng)基如下：（1）糖醇發(fā)酵培養(yǎng)基及葡萄糖產(chǎn)氣試驗培養(yǎng)基組成：（NH4）2HPO41.0g/L;MgSo4·7H200.2g/L；酵母浸膏0.2g/L。配好后加入2%的溴百里香蘭指示劑1mL/LpH為7.2加入1%將杜蘭管口朝下放入試管，115℃滅菌30min。（2）運動型培養(yǎng)基瓊脂：3g/L;牛肉膏：3.0g/L;氯化鈉：5.0/g；蛋白胨：10g/L。pH7.0~7.2。121℃滅菌15min。（3V-P試驗培養(yǎng)基蛋白胨：5.0g/L；K2HPO4:5.0g/L;葡萄糖：5.0g/L。pH7.0±0.2。2mL/支分裝試管，121℃滅菌15min。（42%5%7%10%的NaCl,pH7.0~7.2。121℃滅菌15min。（5）石蕊牛奶試驗培養(yǎng)基石蕊乙醇溶液25mL，脫脂牛奶1000mL，4mL/支分裝試管，115℃滅菌15min。（6）檸檬酸鹽試驗培養(yǎng)基NaCl:5.0g/L；MgSO4·7H20:0.2g/L；（NH4H2PO41.0g/LK2HPO41.0g/L5.0g/L溴百里草酚蘭（濃度為4%pH6.8±0.2。分裝試管，121℃滅菌15min。（7）明膠水解培養(yǎng)基蛋白胨：0.5%；明膠：10%~15%。pH7.0~7.2。分裝試管，115℃滅菌20min。（820g/LKNO31.0g/L；NaCl:0.5g/L；K2HPO4：0.5g/L；MgSO4·7H2O:0.1g/L；瓊脂：2.0g/L。pH7.0~7.2。121℃滅菌15min。（9充氮除氧，121℃滅菌15min。生理生化試驗結(jié)果見表2-9。表2-9試驗菌的生理生化試驗結(jié)果項目MA139項目MA139葡萄糖發(fā)酵+葡萄糖產(chǎn)氣-麥芽糖發(fā)酵+運動性+棉籽糖發(fā)酵+厭氧生長-乳糖發(fā)酵+淀粉水解試驗+甘露醇發(fā)酵+H2O2酶試驗+2%NaCl+檸檬酸鹽試驗+5%NaCl+石蕊牛奶還原+7%NaCl+V-P試驗+10%NaCl-明膠液化試驗+“+”為反應(yīng)陽性；“-”為反應(yīng)陰性。MA139是芽孢桿菌。3.基因鑒定：16SrRNA分析列分析。16SrRNA分析是目前比較常用的分析手段。采用基因組DNA提純試劑盒提取MAA139基因組DNA菌16SrRNA基因特性引物進行PCR測定16SrRNA究所實驗室都能進行。其結(jié)果證實MA139是枯草芽孢桿菌。五、芽孢桿菌的安全性評價確證了芽孢桿菌的特性，接下來需要考慮其安全性問題。桿菌MA139為例，簡要說明進行芽孢桿菌安全性評價的方法。安全性試驗的靶動物一般都選用老鼠，具體可參考如下方法：選擇12只體重基本一致的SD大鼠（Sprague-Dawley,SD,初始體重在200~220g比較適合，雌雄各半，分為兩個實驗組，一組用5mL芽孢菌懸液（108cfu/mL）注射到大鼠腹腔中；另一組用5mL6h時間為1周。灌服MA139的芽孢后，所有大鼠均無明顯臨床癥狀，無一死亡，試驗組和對照組間，沒有明顯差異，證明MA139安全無毒。六、抗生素敏感性試驗在實際生產(chǎn)中，絕大多數(shù)的動物飼料都添加了抗生素，動進細菌間耐藥性基因的傳遞和轉(zhuǎn)移。所以在選擇菌種的時候，生素的敏感性進行檢驗。研究結(jié)果顯示（表2-10，圖2-11MA139對試驗的十種細菌具有一定的同源性。圖2-11MA139對抗生素的敏感性表2-10MA139對抗生素的敏感性抗生素名稱濃度抑菌圈直徑/mm結(jié)果判定大觀霉素[Spectinomycin(SPT)]100μg/片26.5+桿菌肽[Bacitracin(B)]0.04IU/片0.0-卡那霉素[Kanamycin(K)]30μg/片24.1+多黏菌素B[PolymyxinB(PB)]300μg/片12.8+呋喃唑酮[Furazolidone(FR)]300μg/片21.3+紅霉素[Erythromycin(E)]15μg/片24.0+氯霉素[Chloramphenicol(C)]30μg/片28.7+四環(huán)素[Tetracycline(TE)]30μg/片17.7+萬古霉素[Vanycin(VA)]30μg/片19.2+利福平[Rifampin(RA)]5μg/片27.8+注：“+”為敏感；“-”為不敏感。導(dǎo)致很嚴(yán)重的后果。第三節(jié)發(fā)酵飼料生產(chǎn)菌種的制備和保存在獲得了飼料生產(chǎn)菌種以后，需要對生產(chǎn)菌種進行擴大培養(yǎng)部分購買，部分自己制備。和干燥保存進行論述。一、乳酸菌的培養(yǎng)乳酸菌是最常用的有益菌，一般都是厭氧菌，很難制成干粉，最好現(xiàn)培養(yǎng)現(xiàn)用。污染的牛奶中加入6.0%~8.0%37℃左右，在無菌條件下接種、厭氧培養(yǎng)，就可以獲得比較理想的培養(yǎng)物。以下是在實際生產(chǎn)中采用的乳酸菌擴大培養(yǎng)方法。選取無抗生素污染的純牛奶10L，加入600~800g白砂糖（也60~70在500mL三角瓶中，用棉花塞塞緊，外包牛皮紙。在110℃左右消毒滅菌10min37提高糖酸轉(zhuǎn)化效率，而且乳酸菌培養(yǎng)過程容易控制氣壓。在36~40℃恒溫培養(yǎng)20~24h，就可以用于后續(xù)的發(fā)酵飼料擴大接種，乳酸菌培養(yǎng)液與發(fā)酵飼料的接種比例為0.2%左右。需要強調(diào)的是一定要用無抗生素污染的牛奶。乳酸菌一般對抗生素很敏感，溶液中只要有5mg/kg的抗生素就會對乳酸的生量為8.0%加水調(diào)漿（加水量是奶粉分量的8營養(yǎng)濃度。二、乳酸菌培養(yǎng)液的脫水干燥傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)液的干燥都是設(shè)法先除去培養(yǎng)液中的自由水量一般都超過90%，干物質(zhì)的含量不超過10%，除水通常需要力損失也越大。90%以上。即使采用瞬時噴霧干燥，活力損失也要超過85%。脫水后的2024h40%以上，給實際推廣造成很大困難。近年來，世界各地的畜牧科研工作者在活性乳酸菌的干燥保14%左100℃氣流干燥以后，可以比較簡單地把水份降低到6%10酸絕培養(yǎng)液混合，使混合物的水份含量為11%~20%，從而使乳酸乳酸菌，在室溫條件下保存3個月，乳酸菌的活力可以保存50%以上，保存6個月時，乳酸菌的活力保存在40%左右。此方法簡率較高。（一）活性乳酸菌脫水干燥流程干燥載體混合抽真空密封包裝乳酸菌培養(yǎng)（二）流程說明1.載體的干燥載體為麥粉、玉米粉或者其他農(nóng)副產(chǎn)品。粉碎后過20目篩。對倉內(nèi)，抽氣冷卻至40℃。如果緩沖倉的物料不超過1t，冷卻時間一般不超過2h，干燥后麥粉的含水量只增加0.3%潮，包裝袋的容量為10-50kg比較合適。2.乳酸菌擴大培養(yǎng)酵乳桿菌和植物乳桿菌等常用的發(fā)酵飼料生產(chǎn)用乳酸菌。0.5%35℃條件下厭氧培養(yǎng)10~14h2.0~4.0×1011cfu/g7.0%為93.0%0.5mg/kg到乳酸菌培養(yǎng)基。將培養(yǎng)基在95~105℃條件下消毒10~15min，冷卻至40℃以下。3.干燥載體與乳酸菌菌液混合封。4.菌劑的保存期及活菌損失情況1,3,6個月時，分別菌劑中活菌損失情況。我們進行了6次實際生產(chǎn)試驗，結(jié)果如表2-11至2-17。表2-11嗜熱鏈球菌制劑保存試驗（25℃，真空保存，含水量11.27%）保存時間/d103090180存活率/%91.481.254.231.8表2-122512.88%）保存時間/d103090180存活率/%88.379.262.146.8表2-132514.43%）保存時間/d103090180存活率/%81.664.455.231.5表2-142515.92%）保存時間/d103090180存活率/%67.542.337.632表2-1525