2023年動物肝臟中DNA的提取及檢測實驗報告

動物肝臟中ＤNA的提取及檢測一、前言脫氧核糖核酸脫氧核糖核酸(DＮA,為英文Deoｘyribonucleic

acid的縮寫），又稱去氧核糖核酸，是脫氧核糖核酸染色體的重要化學(xué)成分,同時也是組成基因的材料。有時也被稱為“遺傳微?！?，因素是在繁殖過程中，父代會把它們自己DNＡ的一部分復(fù)制傳遞到子代中,從而完畢性狀的傳播。DNA是高分子聚合物，DNＡ溶液為高分子溶液，具有很高的粘度，可被甲基綠染成綠色。DNA對紫外線(260nm)有吸取作用，運用這一特性,可以對ＤNA進(jìn)行含量測定。當(dāng)核酸變性時,吸光度升高,稱為增色效應(yīng);當(dāng)變性核酸重新復(fù)性時,吸光度又會恢復(fù)到本來的水平。較高溫度、有機溶劑、酸堿試劑、尿素、酰胺等都可以引起ＤNA分子變性，即DＮA雙鏈堿基間的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開—也稱為DNA的解螺旋。在細(xì)胞內(nèi)，DNＡ能與蛋白質(zhì)結(jié)合形成染色體，整組染色體則統(tǒng)稱為染色體組。對于人類而言,正常的體細(xì)中具有46條染色體。染色體在細(xì)胞分裂之前會先在分裂間期完畢復(fù)制，細(xì)胞分裂間期又可劃分為：Ｇ1期-ＤＮA合成前期、S期-DNA合成期、G２-ＤNA合成后期。對于真核生物，如動物、植物及真菌而言,染色體重要存在于細(xì)胞核內(nèi);而對于原核生物,如細(xì)菌而言，則重要存在于細(xì)胞質(zhì)中的擬核內(nèi)。染色體上的染色質(zhì)蛋白，如組織蛋白，可以將DNA進(jìn)行組織并壓縮，以幫助DＮA與其他蛋白質(zhì)進(jìn)行交互作用,進(jìn)而調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。脫氧核糖核酸的結(jié)構(gòu)DNＡ的結(jié)構(gòu)：DＮA的結(jié)構(gòu)一般可劃分為一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)和四級結(jié)構(gòu)四個水平。DＮＡ是一種長鏈聚合物,組成單位為四種脫氧核苷酸，即腺嘌呤脫氧核苷酸(dAMP脫氧腺苷)、胸腺嘧啶脫氧核苷酸(ｄＴＭP脫氧胸苷)、胞嘧啶脫氧核苷酸（dCＭP脫氧胞苷)、鳥嘌呤脫氧核苷酸(dGMP脫氧鳥苷)。而脫氧核糖（五碳糖）與磷酸分子借由酯鍵相連，組成其長鏈骨架，排列在外側(cè),四種堿基排列在內(nèi)側(cè)。每個糖分子都與四種堿基里的其中一種相連，這些堿基沿著DNA長鏈所排列而成的序列，可組成遺傳密碼，指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成。讀取密碼的過程稱為轉(zhuǎn)錄，是以DNA雙鏈中的一條單鏈為模板轉(zhuǎn)錄出一段稱為mＲNＡ(信使RNA)的核酸分子。ＤNA是由許多脫氧核苷酸按一定堿基順序彼此用3’,5’-磷酸二酯鍵相連構(gòu)成的長鏈。大多數(shù)ＤNA具有兩條這樣的長鏈，也有的DNＡ為單鏈,如大腸桿菌噬菌體φＸ１７４、G4、M13等。ＤNA有環(huán)形ＤNA和鏈狀DＮA之分。在某些類型的DNＡ中,5-甲基胞嘧啶可在一定限度內(nèi)取代胞嘧啶，其中小麥胚DＮA的5-甲基胞嘧啶特別豐富。在某些噬菌體中,5－羥甲基胞嘧啶取代了胞嘧啶。４0年代后期，查加夫（E．Ｃｈａrｇａｆf)發(fā)現(xiàn)不同物種ＤNA的堿基組成不同，但其中的腺嘌呤數(shù)等于其胸腺嘧啶數(shù)(A＝T）,鳥嘌呤數(shù)等于胞嘧啶數(shù)（G=Ｃ),因而嘌呤數(shù)之和等于嘧啶數(shù)之和,一般用幾個層次描繪DNA的結(jié)構(gòu)。濃鹽法從動物組織中提取DNＡ核酸和蛋白質(zhì)在生物體中常以核蛋白（DNP/ＲNP)的形式存在,其中DNP能溶于水及高濃度鹽溶液，但在０．14M的鹽溶液中溶解度很低，而ＲNP則可溶于低鹽溶液，因此可運用不同濃度的NaCｌ溶液將其從樣品中分別抽提出來。將抽提得到的DNP用SDS解決可將其分離DNA和蛋白質(zhì),用氯仿－異戊醇將蛋白質(zhì)沉淀除去可得DNA上清,加入冷乙醇即可將其呈纖維狀析出。肝臟細(xì)胞肝臟是由肝細(xì)胞組成,肝細(xì)胞極小，肉眼看不到，必須通過顯微鏡才干看到。人肝約有２5億個肝細(xì)胞，5000個肝細(xì)胞組成一個肝小葉,因此人肝的肝小葉總數(shù)約有5０萬個。肝細(xì)胞為多角形，直徑約為20-30/加（微米)，有6-８個面，不同的生理條件下大小有差異，如饑餓時肝細(xì)胞體積變大。每個肝細(xì)胞表面可分為竇狀隙面、肝細(xì)胞面和HＹPEＲLINＫ＂"\t＂_ｂｌaｎｋ"膽小管面三種。肝細(xì)胞里面具有許許多多復(fù)雜的細(xì)微結(jié)構(gòu):如肝細(xì)胞核、肝細(xì)胞質(zhì)、HYPERLINＫ""＼t"_blanｋ＂線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、HYPERLIＮK""＼ｔ＂＿blank"溶酶體、高爾基氏體、微粒體及飲液泡等組成。二、實驗?zāi)康?.掌握濃鹽法從動物組織中提取DNＡ的原理與技術(shù)三、實驗原理核酸和蛋白質(zhì)在生物體中常以核蛋白(DNＰ/RNＰ）的形式存在，其中DＮＰ能溶于水及高濃度鹽溶液,但在0．１４Ｍ的鹽溶液中溶解度很低，而RNP則可溶于低鹽溶液,因此可運用不同濃度的ＮaＣl溶液將其從樣品中分別抽提出來。將抽提得到的DNP用SDS解決可將其分離ＤNA和蛋白質(zhì),用氯仿-異戊醇將蛋白質(zhì)沉淀除去可得DNA上清,加入冷乙醇即可將其呈纖維狀析出。?四、實驗器材和材料試劑實驗器材:①勻漿器②量筒③離心機④離心管⑤試管⑥吸管⑦恒溫水浴鍋實驗材料：①豬肝實驗試劑:①0.1mol／ＬNaＣｌ-0.05ｍｏl/Ｌ檸檬酸鈉溶液（pH6.８)②95%乙醇(Ａ.R.)③NaＣl固體(A.Ｒ.）④５%ＳDＳ溶液（5gSDS定容至1０0ml）⑤V(氯仿)：V（異戊醇）20:1的混合液五、實驗操作1.稱量①稱取一定質(zhì)量的豬肝,加入2倍肝重的0.１moｌ/LNaＣl-0.０5moｌ／L檸檬酸鈉緩沖液并用勻漿器磨碎(已完畢)。2.提?。腘Ａ①量取肝糜4ml于10毫升離心管,在400０r／min下離心10min,沉淀中再加入8ml緩沖液于4000r/min離心5min；②棄上清,取沉淀;③將沉淀用10ml檸檬酸鈉緩沖液完全洗入干凈的小燒杯、加入5ml氯仿-異戊醇混合液、1mｌSＤＳ，振蕩３0miｎ(保鮮膜封口）;④緩慢加入固體NaCl（約0．９g）,使其最終濃度為1ｍｏl/Ｌ；⑤將溶液分裝到2個１0毫升離心管中，在40０0r／ｍin離心５ｍin,取上清水相;⑥在上述水相溶液中分別加等體積冷95%乙醇,邊加邊用玻棒慢慢朝一個方向攪動,將纏繞在玻棒上的凝膠狀物用濾紙吸去多余的乙醇，即得ＤNA粗品;⑦用8ml蒸餾水溶解DNA粗品于１0ml離心管中。3.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制按下表加入各種試劑，混勻，于60℃恒溫水浴鍋45ｍin，冷卻后,在59５nｍ波長下于分光光度計比色測定,以吸光度對DNA濃度作圖,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。012345標(biāo)準(zhǔn)DNA溶液／ml０．００．4０.８1．2１．62.0蒸餾水/ml2.01.61．2０.80.40二苯胺試劑/ｍl４.04.04．０４.04.04．０Ａ595nm４.樣品的測定將ＤNA粗品定容至2５ml容量瓶，再取DNＡ樣液１.0mｌ,加入蒸餾水１.０mｌ，混勻。然后準(zhǔn)確加入二苯胺試劑４．0ml，混勻,于60℃恒溫水浴鍋4５min，冷卻后，595nm波長下于分光光度計比色測定,根據(jù)所測的吸光度對照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得ＤNA的質(zhì)量(ｕg）。5.計算1０0g豬肝中DNA含量w=m1／ｍ2×1００%w：DNＡ的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%）ｍ１:樣液中測得的ＤNA的質(zhì)量（uｇ）m２：樣液中所含樣品的質(zhì)量（ｕg)六、實驗數(shù)據(jù)解決1．標(biāo)準(zhǔn)曲線012３45標(biāo)準(zhǔn)DNA溶液／ｍｌ0．00.40.81.21.6２.0蒸餾水/ｍl2.０１.６1.2０.8０.40二苯胺試劑/mｌ４.04.04.04.０4.04.0A595nm０0．０3９０.090.146０.１970．２4９DNＡ含量／ｕg08０１６02403204002.實驗結(jié)果解決豬肝質(zhì)量為2.0４gDNA提取液體積為１２.53mｌ序號１2３A595nm0.10２0.1020.101平均A595nm0.1０2樣液中ＤNA含量/ｕg171.4樣液中樣品質(zhì)量／g0.１６28根據(jù)公式w=ｍ１/ｍ2×1０0%得：ｗ=0.１0５3％則100g豬肝中DＮA含量為:w×10０＝0.105３g七、思考題1.實驗中的乙醇、SDＳ、氯仿-異戊醇、NaCｌ、檸檬酸鈉分別有什么作用?答：①檸檬酸的鈉鹽在實驗中既充當(dāng)DNA酶的克制劑,也是pＨ緩沖溶液;②SＤＳ是表面活性劑,可以讓蛋白質(zhì)與DNＡ分開；③氯仿是有機溶劑,可以使蛋白質(zhì)聚集沉淀,便于分離出去；④異戊醇是消泡劑,可以減少泡沫的發(fā)生；⑤氯仿－異戊醇的作用是使HYPERLINＫ""\t"_blank＂蛋白質(zhì)變性、膜溶解;⑥NａＣｌ固體溶解使得試液成為高濃度的鹽溶液，在這樣的環(huán)境中DNA核蛋白能溶解,RＮA核蛋白則溶解度很低，可以運用這一性質(zhì)分離兩種核酸。八、實驗注意事項1.DNＡ重要集中在細(xì)胞核中，因此，通常選用細(xì)胞核含量比例大的生活組織作為提取制備DNA的材料,小牛胸腺組織中細(xì)胞核比例較大，因而DNA含量豐富，同時其脫氧核苷酸酶活性較低，制備過程中DNA被降解的也許性相對較低,所以是制備DNA的良好材料，但其來源較困難,脾臟或肝臟易獲得，也是實驗室制備ＤNA常用的材料,本實驗用新鮮肝臟作為實驗材料。２．為了防止大分子核酸在提取過程中被降解,須采用以下措施:整個過程必須在低溫下進(jìn)行，可加入某些物質(zhì)克制核酸酶的活性，如檸檬酸鈉、EDTA、SDS等,ＥDTA是克制核酸酶的活性最佳的克制劑。３.從核蛋白中脫去蛋白質(zhì)的方法很多,經(jīng)常采用的有:氯仿-異丙醇法、苯酚法、去垢劑法等,他們均能使蛋白質(zhì)變性和核蛋白解聚,并釋放出核酸。4．使用離心機時，對稱放置的離心管必須用天平調(diào)平衡。５．避免劇烈振蕩，如研磨過程、攪拌過程等。九、實驗結(jié)果誤差分析及討論通過對本次實驗結(jié)果進(jìn)行分析,得出100g豬肝中DNA含量大約為０．1053ｇ的結(jié)論，在上網(wǎng)查閱相關(guān)資料后發(fā)現(xiàn):豬肝中ＤNA含量與本次實驗實際操作測量得出的結(jié)果大體互相吻合。由此可知,本次實驗結(jié)果是相對比較成功的,較為粗略地測量出豬肝中DNＡ的含量，并且較為純熟地掌握了濃鹽法從動物組織中提取DNA的原理與技術(shù)，基本達(dá)成了本次實驗的目的。但是本次實驗結(jié)果只是粗略測量,并未達(dá)成精確測量豬肝中DＮA的含量，且實驗數(shù)據(jù)較理論值偏低，這是由于某些誤差導(dǎo)致,在實驗過程中些許因素也許會導(dǎo)致實驗結(jié)果數(shù)據(jù)有偏差,經(jīng)分析得出以下幾點：①在稱取豬肝后加入檸檬酸鈉緩沖液進(jìn)行研磨的過程中,由于豬肝組織表面較滑不易磨碎，且研磨至最后依舊有小部分豬肝組織塊殘留，因此也許導(dǎo)致豬肝中DNＡ提取不充足,致使實驗數(shù)據(jù)較理論值偏低;②研磨過程中,也許由于操作不妥，導(dǎo)致部分液體濺出，因此也許使得提取液中部分ＤNＡ損失,導(dǎo)致實驗數(shù)據(jù)偏低；③在粗提?。腘A操作中,頻繁地將DNＡ提取液轉(zhuǎn)移至各個儀器內(nèi)，也許有極小部分DNA提取液未倒凈，殘留在儀器壁上損耗掉，導(dǎo)致實驗誤差;④在使用移液槍的過程中，也許由于操作不妥或移液槍經(jīng)常錯誤使用，出現(xiàn)儀器誤差，導(dǎo)致吸取的DNA樣液不精確，出現(xiàn)實驗誤差；⑤在水相中加入乙醇析