醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)

一、RNA干擾（RNAinterferenc，RNAi）的發(fā)現(xiàn)1990年，Napoli矮腳牽?；▽?shí)驗(yàn)PlantCell,1990

第1頁/共28頁第一頁，共29頁。1995年，郭蘇和導(dǎo)師坎菲思（KennethKemphues）《Potentandspecificgeneticinterferencebydouble-strandedRNAinCaenorhabditiselegans》1998年，安德魯·法爾（AndrewZ.Fire）克雷格·梅洛（CraigC.Mello）Nature,1998秀麗新小桿線蟲par-1基因Cell,1995第一篇以“RNA干擾”命名該現(xiàn)象及闡述機(jī)制的文章第2頁/共28頁第二頁，共29頁。2001年，托馬斯·塔什爾（ThomasTuschl）2001年，美國(guó)《科學(xué)》雜志評(píng)選年度十大科學(xué)進(jìn)展

ElbashirSMandTuschlT.Nature,2001第一篇探討哺乳動(dòng)物細(xì)胞中RNA干擾現(xiàn)象的文章《Duplexesof21-nucleotideRNAsmediateRNAinterferenceinculturedmammaliancells》2002年，美國(guó)《科學(xué)》雜志評(píng)選年度十大科學(xué)進(jìn)展之首

第3頁/共28頁第三頁，共29頁。2001年，BernsteinE分離鑒定果蠅Dicer《RoleforabidentateribonucleaseintheinitiationstepofRNAinterference》Nature,2001

2006年，JenniferDoudnaX射線衍射晶體分析技術(shù)《Structurebasisfordouble-StrandedRNAprocessingbyDicer》Science,2006純化并結(jié)晶

GiardiaintestinalisDicer

第4頁/共28頁第四頁，共29頁。2006年，美國(guó)斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院安德魯·法爾（AndrewZ.Fire）"fortheirdiscoveryofRNAinterference–genesilencingbydouble-strandedRNA"TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine2006AndrewZ.FireCraigC.Mello馬薩諸塞大學(xué)醫(yī)學(xué)院克雷格·梅洛（CraigC.Mello）獲得諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎(jiǎng)第5頁/共28頁第五頁，共29頁。二、RNA干擾(post-transcriptionalgenesilencing，PTGS)的一種形式。RNAi是指外源雙鏈RNA進(jìn)入細(xì)胞后，引起與其序列同源的特異基因mRNA

降解的現(xiàn)象－－屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默antisense－－復(fù)制、轉(zhuǎn)錄翻譯水平﹡knock-out－－DNA水平RNAi－－轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默優(yōu)點(diǎn)：①方便快捷②高特異性功能：分析特定基因在細(xì)胞內(nèi)的功能。③高效性④作用廣泛性第6頁/共28頁第六頁，共29頁?！癐mmuneSystem”oftheGenome

①

AntiviralDefense②

SuppressTransposonActivity③

ResponsetoAberrantRNAs第7頁/共28頁第七頁，共29頁。三、RNA干擾機(jī)制1、啟動(dòng)階段：dsRNA被Dicer逐步切割成siRNA（smallinterferingRNA）

2、效應(yīng)階段:①Risc形成：siRNA與蛋白質(zhì)聚集形成Risc（Risc，RNA-inducedsilencingcomplex）②Risc激活：siRNA雙鏈解開。③激活的Risc定位到同源mRNA上，降解該mRNARiscRiscRisc5`3`第8頁/共28頁第八頁，共29頁。四、RNA干擾過程中的關(guān)鍵元件1.dsRNA（doublestrandRNA）①RNA病毒：ssRNAdsRNARNA指導(dǎo)的RNA聚合酶（RNAdependentRNApolymerase,RdRp）RdRp3`OH5`p5`p3`OH3`OH5`pRdRp②人工導(dǎo)入dsRNA第9頁/共28頁第九頁，共29頁。2.DicerRNaseIII家族成員－－核酸內(nèi)切酶，特異性識(shí)別并切割dsRNAdsRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（dsRNA-bindingdomain,dsRBD）RNaseIII催化結(jié)構(gòu)域解旋酶結(jié)構(gòu)域（helicasedomain）dsRNAsiRNADicerafrontviewofthecrystalstructureofGiardiaintestinalisDicer

ATP依賴PAZ結(jié)構(gòu)域第10頁/共28頁第十頁，共29頁。3.siRNAduplex結(jié)構(gòu)：雙鏈3`端突出2個(gè)核苷酸21～25個(gè)核苷酸3`OH5`p5`p3`OH21nucleotides2ntoverhang第11頁/共28頁第十一頁，共29頁。4.Risc（RNA-inducingsilencingcomplex）RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物組分：siRNAAgo（Argonauteproteinfamily）－－結(jié)合募集siRNARNAhelicase（RNA解旋酶）－－形成單鏈siRNA……RiscRisc正義鏈反義鏈反義鏈激活的RiscATP依賴RNase（內(nèi)切酶、外切酶）－－切割目標(biāo)mRNA3`OH5`pRisc反義鏈降解第12頁/共28頁第十二頁，共29頁。5.RdRp（RNAdependentRNApolymerase）RNA依賴的RNA聚合酶放大效應(yīng)：微量siRNA，明顯干擾效應(yīng)可能機(jī)制：①siRNA重復(fù)利用②目的mRNA直接擴(kuò)增3`OH5`pRdRpRisc反義鏈激活的Risc5`3`DicersecondarysiRNAprimarysiRNA第13頁/共28頁第十三頁，共29頁。mechanismofRNAi第14頁/共28頁第十四頁，共29頁。脫靶效應(yīng)（off-target）②正義鏈干擾→正義鏈修飾③

反義鏈seed-region活性→反義鏈修飾①劑量依賴→cocktail→smartpoolRiscRiscATP依賴（+）（-）（+）（-）Risc（-）mRNARisc（+）on-targetoff-target正義鏈干擾目標(biāo)mRNA非目標(biāo)mRNA第15頁/共28頁第十五頁，共29頁。反義鏈seed-region活性（+）（-）5`5`3`3`seedregion2~7核苷酸（-）RiscmRNAmRNAmRNARiscRisc3`3`5`5`3`5`目標(biāo)mRNA非目標(biāo)mRNA第16頁/共28頁第十六頁，共29頁。五、RNA干擾研究的一般技術(shù)路線1、目的基因的確定2、siRNA序列的設(shè)計(jì)3、獲得siRNA產(chǎn)物4、siRNA轉(zhuǎn)移5、RNA干擾效果檢測(cè)第17頁/共28頁第十七頁，共29頁。第18頁/共28頁第十八頁，共29頁。第19頁/共28頁第十九頁，共29頁。第20頁/共28頁第二十頁，共29頁。siRNA轉(zhuǎn)移（1）脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染（2）病毒介導(dǎo)的感染（3）電穿孔R(shí)NA干擾效果檢測(cè)（1）mRNA：RT-PCR、定量PCR、Northern。（2）蛋白質(zhì)：Western、ELISA、免疫熒光（3）生理生化表型參數(shù)：第21頁/共28頁第二十一頁，共29頁。六、微小RNA（microRNA，miRNA）1、miRNA：廣泛存在于真核細(xì)胞中的一組短小的、不編碼蛋白質(zhì)的RNA家族，由約22nt組成的單鏈RNA。2、miRNA的發(fā)現(xiàn)：《TheC.elegansheterochronicgenelin24encodessmall

RNAs

withantisensecomplementaritytolin-14》1993年，Leeetal，Cell線蟲，lin-4→lin-142000年，Reinhartetal，Nature線蟲，let-7《The21nucleotidelet-7RNAregulatesdevelopmentaltiminginCaenorhabditiselegans》擬南芥，水稻斑馬魚，果蠅鼠，人第22頁/共28頁第二十二頁，共29頁。3、miRNA的成熟：①

長(zhǎng)的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄本（pri-miRNA）②70nt莖環(huán)結(jié)構(gòu)miRNA前體（pre-miRNA）③miRNA雙鏈④miRNA單鏈-Risc復(fù)合物microRNA基因組pri-miRNApre-miRNApre-miRNAmiRNAduplexDicer單鏈miRNADroshaRNaseRisc活化miRNA胞核胞漿Exportin53`5`5`3`miRNAduplexRisc（+）（-）Risc（+）（-）第23頁/共28頁第二十三頁，共29頁。目標(biāo)mRNA3`5`4、miRNA與目標(biāo)mRNA的作用模式：①3`UTR不完全互補(bǔ)，抑制翻譯。②編碼區(qū)完全互補(bǔ)，降解mRNA。（類似siRNA與目標(biāo)mRNA的結(jié)合與降解）③上述兩種模式均具備。5`5、miRNA的生理功能：時(shí)空性表達(dá)（組織特異性和階段特異性）→控制個(gè)體發(fā)育3`5`3`lin-4：第一、二期let-7：第三、四期和成蟲期第24頁/共28頁第二十四頁，共29頁。

miRNA產(chǎn)生：基因組（正常）來源：內(nèi)源轉(zhuǎn)錄本直接來源：發(fā)夾狀pre-miRNA結(jié)構(gòu)：?jiǎn)捂溁パa(bǔ)性：不完全互補(bǔ)或完全互補(bǔ)特異性：相對(duì)較低

作用部位：3`UTR或編碼區(qū)

對(duì)基因的影響：抑制翻譯或降解目標(biāo)mRNA

生理功能：調(diào)節(jié)內(nèi)源基因的表達(dá)控制個(gè)體發(fā)育

siRNA病毒感染、轉(zhuǎn)座子移位、導(dǎo)入dsRNA（異常）病毒RNA或轉(zhuǎn)基因（外源）

長(zhǎng)鏈dsRNA

單鏈

完全互補(bǔ)較高

編碼區(qū)或UTR

降解目標(biāo)mRNA

抵抗病毒感染、抑制轉(zhuǎn)座子活性miRNA與siRNA的比較：第25頁/共28頁第二十五頁，共29頁。均為Dicer的切割產(chǎn)物：長(zhǎng)度均為22nt左右

siRNAduplexmiRNAdupl