細(xì)菌計(jì)數(shù)生長(zhǎng)篩選誘變第三節(jié)課件

1

第二章工業(yè)微生物基礎(chǔ)2第三節(jié)微生物菌種的分離選育和保藏

微生物菌種是工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)的基本條件。發(fā)酵的產(chǎn)量、發(fā)酵原料的利用率、生產(chǎn)周期等均與菌種有關(guān)。3細(xì)菌生長(zhǎng)（數(shù)量）測(cè)定方法借助顯微鏡觀察測(cè)定優(yōu)點(diǎn)：快速提問:有哪些缺點(diǎn)?缺點(diǎn)：不能區(qū)分細(xì)菌的死活另外主要的一種就是平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)。基礎(chǔ)知識(shí)52.計(jì)數(shù)器(血球計(jì)數(shù)板）測(cè)定法0.052cm2×250.1ml菌液6提問：數(shù)了125個(gè)小格中有90個(gè)細(xì)菌，樣品中的細(xì)菌濃度是多少？(90個(gè)÷125)*

400

/0.1ml=2880個(gè)/ml適用范圍：測(cè)定個(gè)體較大的細(xì)菌或原生動(dòng)物細(xì)菌個(gè)體若太小、過多，由于每一小格中細(xì)菌層層疊加，相互遮擋，難以準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。數(shù)數(shù)細(xì)菌（或其他微生物或細(xì)胞）數(shù)目，（一般數(shù)125個(gè)小格），折算樣品細(xì)菌濃度；73.比例計(jì)數(shù)法比例——樣品菌液與等體積的血液混合，觀測(cè)二者比例提問：如果平均每個(gè)視野中細(xì)菌數(shù)量/紅血球的數(shù)量比例為5.5：1，則細(xì)菌數(shù)量=？5.5×400萬個(gè)/ml=2.2×107個(gè)/mL樣品紅血球數(shù)已知(男性400~500萬個(gè)／ml，女性350~450萬個(gè)／ml)，平均400萬個(gè)/ml細(xì)菌紅血球95、平板計(jì)數(shù)法將待測(cè)樣品制成菌懸液；菌懸液用10倍稀釋法適當(dāng)稀釋；定量取稀釋液（0.2ml）涂平板培養(yǎng)，根據(jù)平板上生長(zhǎng)的菌落計(jì)數(shù)；特點(diǎn)：活菌計(jì)數(shù)，適用于單細(xì)胞微生物；要點(diǎn)：同一稀釋度涂布三皿以上取平均值計(jì)數(shù)；每支移液管或槍頭只能接觸一個(gè)稀釋度的菌液；10稀釋涂平板法活菌計(jì)數(shù)11稀釋涂平板法活菌計(jì)數(shù)13(1)采樣原理：微生物的生態(tài)特點(diǎn)

優(yōu)勝劣汰天然——特殊區(qū)域采樣例如篩選能降解石油的細(xì)菌？收集長(zhǎng)期被石油污染的土壤(天然選擇性固體培養(yǎng)基），必有適應(yīng)石油環(huán)境利用石油作為食物的細(xì)菌，將土壤樣品在實(shí)驗(yàn)室用石油降解菌選擇性培養(yǎng)基，對(duì)樣品中的石油降解菌進(jìn)行進(jìn)一步的選擇培養(yǎng)，篩選分離，富集，為下一步的馴化工作奠定基礎(chǔ)。

14（2）增殖培養(yǎng)給予有利的培養(yǎng)條件，如特殊的碳源、pH值、溫度。添加一些專性抑制劑，如在分離放線菌時(shí)，添加10%苯酚，以抑制霉菌和細(xì)菌的生長(zhǎng)。15（3）純種分離劃線法稀釋法17

馴化選擇性培養(yǎng)基（石油）濃度升高（4）篩選23、414小考1中考高考18有兩種制備思路：？1）選擇性——？待選的細(xì)菌能優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)選擇性培養(yǎng)基19①投毒法常用物質(zhì)為染料、膽汁酸鹽、金屬鹽類、酸、堿和抗生素。例如欲分離古細(xì)菌，培養(yǎng)基中通常加入青霉素（由于古細(xì)菌的細(xì)胞壁不同于普通細(xì)菌，因而不會(huì)被對(duì)破壞普通細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的青霉素殺死），古細(xì)菌就唯一分離并存活下來。膽汁酸鹽——抑制革蘭氏陽性菌提問：它能選擇性生長(zhǎng)那種細(xì)菌？革蘭氏陰性細(xì)菌毒——選擇性的抑制劑待選細(xì)菌有抗性21（2）理化因素控制法理化因素——特殊的溫度、氧氣、pH、鹽度等環(huán)境條件主要用于篩選極端環(huán)境微生物。如嗜鹽、嗜熱、嗜冷、嗜酸、嗜堿等的細(xì)菌，同時(shí)也被用于選擇性培養(yǎng)好氧或厭氧細(xì)菌。嗜冷菌嗜熱菌22（1）漸變－誘導(dǎo)法(休眠的酶基因復(fù)活+自然突變)方法：待降解物通常為有機(jī)毒物或惰性物。567N選擇性培養(yǎng)基（待降解物，如石油）濃度升高5n篩選與誘導(dǎo)馴化可以同時(shí)進(jìn)行特點(diǎn):操作簡(jiǎn)便，馴化的潛力有限，慢。結(jié)果二、誘變及基因工程育種23誘變劑：溫度、紫外線、核輻射、酸、堿、化學(xué)誘變劑等等。（2）突變—誘變法提問：哪些因素可以引起基因突變呢？提問：

基因突變的分子機(jī)制？DNA堿基丟失、增多、錯(cuò)配等點(diǎn)突變→染色體畸變基因突變有這樣幾個(gè)特點(diǎn)。25Ⅵ.可逆性修復(fù)成功

Ⅴ.穩(wěn)定性修復(fù)失敗產(chǎn)生的變異性狀是穩(wěn)定的、可遺傳的。利用基因突變的特點(diǎn)，可以通過人工誘變進(jìn)行細(xì)菌的基因改造。26常用的誘變劑：紫外線、5—溴尿嘧啶、亞硝酸、卟啶染料等。誘變的步驟Ⅰ.制出發(fā)菌株的單細(xì)菌懸浮液提問：為什么？如何在整個(gè)過程中盡量使細(xì)菌分散呢？誘變劑與細(xì)菌充分接觸；向細(xì)菌培養(yǎng)液中加入玻璃珠，并保持在誘變過程中始終進(jìn)行振蕩攪拌形成出發(fā)細(xì)菌的單細(xì)菌懸浮液；B．方法29（3）基因重組法不同個(gè)體基因重新組合

A．形式自發(fā)基因重組與人工基因重組自發(fā)基因重組a.真核生物為雜交；精卵細(xì)胞質(zhì)融合過程中所有遺傳物質(zhì)的重組b.原核生物為轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合；部分遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移和重組30Ⅰ.轉(zhuǎn)化Transformation

（引進(jìn)）供體細(xì)菌研碎物中的DNA片段直接吸收進(jìn)入活的受體細(xì)菌并發(fā)生基因重新組合的方式。受體細(xì)菌獲得了供體細(xì)菌的部分遺傳性狀—“轉(zhuǎn)運(yùn)同化”如：抗性質(zhì)粒引進(jìn)31目前發(fā)現(xiàn)自然狀態(tài)下許多其它細(xì)菌、放線菌、真菌和高等動(dòng)植物中都也有轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。32Ⅱ.接合

（合作）

Ⅲ.轉(zhuǎn)導(dǎo)（間諜竊?。?/p>

噬菌體－細(xì)菌病毒通過噬菌體的攜帶而轉(zhuǎn)移導(dǎo)入的基因重組現(xiàn)象稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)。轉(zhuǎn)導(dǎo)是1951年辛德爾(Zinder)和萊德貝爾格(1Jederberg)在研究鼠沙門氏傷寒桿菌重組時(shí)發(fā)現(xiàn)的。細(xì)菌有性生殖33B.人工基因重組—遺傳工程遺傳工程是70年代初發(fā)展起來的生物技術(shù)。定義：對(duì)遺傳物質(zhì)進(jìn)行改造（人工干預(yù)下的雜交、轉(zhuǎn)化、接合、轉(zhuǎn)導(dǎo)）的技術(shù)。工程：類似工程設(shè)計(jì)那樣有很高的預(yù)見性、精確性與嚴(yán)密性。34遺傳工程的方法遺傳工程方法包括兩個(gè)水平的研究：一種是細(xì)胞水平；另一種是基因水平。所以，又可把它分為細(xì)胞工程和基因工程。細(xì)胞工程——兩個(gè)細(xì)胞原生質(zhì)體融合體外切割導(dǎo)入遺傳物質(zhì)基因片段受體細(xì)胞基因工程——兩個(gè)細(xì)胞DNA片段剪接拼接狹義的講，遺傳工程就是基因工程。原理：限制性核酸內(nèi)切酶35在特殊培養(yǎng)基上（如含有青霉素）篩選目的細(xì)菌質(zhì)粒載體（具有抗性基因）如抵抗青霉素長(zhǎng)出必然是重組成功的細(xì)菌外源基因片段36例如：降解石油的工程細(xì)菌

70年代美國(guó)生物學(xué)家查克撿巴蒂(Chakrabarty)針對(duì)海洋輸油，造成浮油污染，影響海洋生態(tài)等問題進(jìn)行了研究。石油成分復(fù)雜，是由飽和、不飽和、直鏈、支鏈、芳香……烴類組成，不溶于水。而海水含鹽量高，雖發(fā)現(xiàn)90多種微生物有不同程度降解烴類的能力，但不一定能在海水中大量繁殖生存，而且降解速率也較饅，查氏將能降解脂(含質(zhì)粒A)的一種假單胞菌作受體細(xì)菌，分別將能降解芳烴(質(zhì)粒B)、芳烴(質(zhì)粒C)和多環(huán)芳烴(質(zhì)粒D)的質(zhì)粒，用遺傳工程方法人工轉(zhuǎn)入受體細(xì)菌，獲得多質(zhì)粒“超級(jí)細(xì)菌”，可除去原油中2／3的烴。浮油在一般條件下降解需一年以上時(shí)間，用“超級(jí)細(xì)菌”只需幾小時(shí)即可把浮油去除，速度快效率高。見下圖。37基因工程方法看似簡(jiǎn)單，但在具體實(shí)施上有較大的難度。A.細(xì)菌的質(zhì)粒本身容易丟失或轉(zhuǎn)移

B.質(zhì)粒具有不相容性（只有在一定條件下，屬于不同的不相容種群的質(zhì)粒才能穩(wěn)定地共存于同一宿主中。）38三、原生質(zhì)體融合

通過人為方法,使遺傳性狀不同的兩個(gè)細(xì)胞的原生質(zhì)體融合,繼而遺傳重組,借以獲得兼有雙親性狀,遺傳性穩(wěn)定的融合子的過程。39●主要步驟：

1）選擇親本2）制備原生質(zhì)體3）原生質(zhì)體融合4）原生質(zhì)體再生5）篩選40四、菌種保藏●菌種衰退現(xiàn)象：形態(tài)、生長(zhǎng)速度、代謝產(chǎn)物、致病性、抗逆性等●復(fù)壯：通過分離純化和測(cè)定，從衰退群體中篩選未退化的個(gè)體。41菌種衰退的防止：1）減少傳代次數(shù)2）良好培養(yǎng)條件3）利用不易衰退的細(xì)胞傳代4）菌種的有效保藏42保藏條件：低溫、干燥、無氧、低營(yíng)養(yǎng)、保護(hù)劑43工業(yè)上常用的菌種保藏方法1、斜面冰箱保藏法2、沙土管保藏法3、石蠟油封保藏法4、甘油