利用腸黏膜基因組差異表達研制抗應激添加劑演示文稿

利用腸黏膜基因組差異表達研制抗應激添加劑演示文稿第一頁，共四十八頁。利用腸黏膜基因組差異表達研制抗應激添加劑第二頁，共四十八頁。匯報提綱研究背景、目的

研究技術路線與方法結果與分析

結論

有待進一步研究的問題第三頁，共四十八頁。一、研究背景及目的應激夏季高溫對養(yǎng)豬生產(chǎn)的影響高溫與胃腸道損傷修復基因芯片在豬熱應激中的應用第四頁，共四十八頁。應激的種類飼管因素運輸因素

環(huán)境因素

防治因素

中毒因素

心理因素

其他因素

隨著全球性氣候變暖，高溫成為對家畜作用最廣泛和不可避免的應激因素。人工氣候室高溫模型符合試驗因子單一化研究應激機制。第五頁，共四十八頁。熱應激環(huán)境溫度超過豬的等熱區(qū)上限，豬體溫超過39.5℃，產(chǎn)熱大于散熱。免疫機能生產(chǎn)性能經(jīng)濟損失生理指標行為改變胃腸道損傷第六頁，共四十八頁。應激與應激性潰瘍應激性潰瘍：應激中機體為了保護心、腦等重要器官，全身血液重新分配，胃腸道血流量明顯減少。導致小腸黏膜急性損傷，因此，腸道是應激反應的中心器官。第七頁，共四十八頁。高溫與腸黏膜屏障的損傷修復小腸黏膜屏障結構的完整性免疫功能——第一道防御屏障生產(chǎn)性能——營養(yǎng)物質(zhì)吸收利用第八頁，共四十八頁。基因芯片在豬熱應激中的運用基因芯片（基因微陣列）cDNAmicroarrayAffymetrixGeneChip?PorcineGenomeArray，包含23,937個探針組，代表20,201個基因。應用豬全基因組已知核酸序列作為探針與互補的靶核苷酸序列雜交，對23937個探針以及雜交信號進行靈敏、準確的檢測分析，實時同步高通量評價豬的熱應激反應。第九頁，共四十八頁。實時同步高通量評價豬的熱應激基因芯片熱應激從豬熱應激及中藥兩個角度對多參數(shù)實時同步分析，探討熱應激機制并發(fā)掘藥物靶點，為多層次評價中藥作用提供工具。改善環(huán)境營養(yǎng)調(diào)控抗熱應激藥物（中藥添加劑）中藥第十頁，共四十八頁。研究目的、意義通過豬在人工氣候室連續(xù)10天26-40℃的循環(huán)變溫刺激，從小腸黏膜形態(tài)學、與損傷修復相關的EGF/EGFR等生長因子與mRNA水平以及信號通道等方面探討高溫對豬小腸黏膜結構損傷的影響及中藥調(diào)控機制，為開發(fā)抗熱應激中藥添加劑以及小腸損傷修復劑奠定基礎。第十一頁，共四十八頁。二、技術路線和方法實驗動物：48頭2月齡、體重7.15±0.61kg的中國實驗用小型豬（CEMP,農(nóng)大I系）。

人工氣候室：中國農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所動物營養(yǎng)國家重點開放實驗室。石香顆粒：功效為防治高溫引起的機體免疫力下降及生產(chǎn)性能下降。其中鹽酸小檗堿含量1.0mg/g。用法：飲水；用量：0.15g/kg·bw。連用10天。

主要藥味包括蒼術(RhizomaAtractylodis)、藿香(HerbaAgastachis)、黃柏(CortexPhellodendri)、石膏(GypsumFibrosum)等。第十二頁，共四十八頁。退熱及中樞鎮(zhèn)痛作用增強巨噬細胞吞噬功能增強細胞和體液免疫功能抗菌、鎮(zhèn)痛、解熱作用促進胃液分泌，解除胃腸痙攣燥濕健脾。用于脘腹脹滿，泄瀉，水腫.調(diào)節(jié)胃腸運動，調(diào)節(jié)黏膜免疫抗病原微生物、抗?jié)冏饔?、抗菌、清熱燥濕免疫調(diào)節(jié)作用蒼術藿香黃柏石膏石香顆粒第十三頁，共四十八頁。技術路線21000，41000個基因豬熱應激模型大鼠熱應激模型模型評價小腸形態(tài)結構觀察基因芯片分析關鍵的調(diào)節(jié)因子相關性分析IEC-6細胞熱應激模型細胞形態(tài)、活力、凋亡生長因子表達變化ERK1/2信號通路的變化相關性分析10個生長因子和ERK1/2信號通路第十四頁，共四十八頁。技術路線小腸形態(tài)學觀察高溫組體內(nèi)體外生產(chǎn)性能生理指標腸上皮細胞組織學觀察IEC-6形態(tài)學觀察ERK1/ERK2細胞活力/細胞周期中藥組對照組損傷指標觀察臨床觀察基因芯片評價生長因子mRNA信號通道Pathway分類EST分析功能分析（GO分類）高通量快速篩選平臺第十五頁，共四十八頁。三結果與分析NameAvg.TemperatureMin.TemperatureMaxTemperatureStandardDeviationEmissivityControl35.4°C27.4°C38.3°C0.740.95HeatStress37.4°C28.9°C39.5°C0.580.95（一）高溫模型及對豬小腸黏膜形態(tài)結構的損傷及中藥的修復作用第十六頁，共四十八頁。熱應激前后豬肛溫變化熱應激前后血清皮質(zhì)醇變化第十七頁，共四十八頁。直腸溫度及平均日增重Table.Rectaltemperatureandaveragedailygain注：同行小寫字母相同者代表組間差異不顯著；不同者代表組間差異顯著(P<0.05)第十八頁，共四十八頁。熱應激豬小腸黏膜的形態(tài)學變化左列為對照組中列為高溫組右列為中藥組上行為十二指腸中行為空腸下行為回腸第十九頁，共四十八頁。高溫對豬空腸上皮細胞結構的影響A為對照組，B為高溫組；10000×電鏡顯示，小腸微絨毛變短；細胞核沒有明顯變化；線粒體、轉運小泡及次級溶酶體數(shù)量增加。50000×電鏡顯示空腸上皮細胞內(nèi)線粒體數(shù)量增加，線粒體內(nèi)部脊突變短，腫脹，內(nèi)部已有空泡形成；次級溶酶體數(shù)量增加，從形態(tài)上顯示，膜包被的電子密度不同的多胞體結構清晰可見；在沒有脫落的空腸上皮細胞間緊密連接以及細胞核沒有明顯變化。

50000×10000×第二十頁，共四十八頁。熱應激豬空腸組織基因表達譜變化對照組高溫組RNA提取反轉錄cDNAcRNA合成芯片雜交生物學分析芯片驗證EST分析GOMAPPING分析PATHWAY分析中藥組驗證（二）高溫對豬空腸黏膜基因差異表達的影響第二十一頁，共四十八頁。差異基因比較結果AffymetrixGeneChip?PorcineGenomeArray含有23,937條探針代表已知豬的20,201個基因。高溫組與對照組比較（差異倍數(shù)＞±2.0）基因基因數(shù)量比例%表達基因1632171.6%不表達基因630327.6%表達上調(diào)930.41%表達下調(diào)1100.49%臨界基因1860.8%第二十二頁，共四十八頁。差異基因的聚類分析第二十三頁，共四十八頁。差異基因列表探針號變化倍數(shù)基因庫編號基因名稱第二十四頁，共四十八頁。熒光定量PCR驗證變化趨勢一致，芯片數(shù)據(jù)可靠第二十五頁，共四十八頁。差異基因GO分類圖細胞過程磷酸化過程細胞成分細胞蛋白結合發(fā)育刺激反應調(diào)節(jié)生物進程信號轉導激活蛋白復合物繁殖其它反應激活細胞器細胞器成分胞外區(qū)GO名總數(shù)百分率GO分類：細胞成分，生物進程，分子功能三大類。第二十六頁，共四十八頁。差異基因分子功能分析第二十七頁，共四十八頁。差異基因生物進程分析第二十八頁，共四十八頁。細胞組分分析第二十九頁，共四十八頁。差異基因的Pathway分析第三十頁，共四十八頁。主要的生長因子Epidermalgrowthfactor(EGF)表皮生長因子

Bonemorphogeneticproteins(BMPs)骨形成蛋白Erythropoietin(EPO)紅細胞生成素Fibroblastgrowthfactor(FGF)成纖維細胞生長因子Granulocyte-colonystimulatingfactor(G-CSF)粒系集落刺激因子Growthdifferentiationfactor-9(GDF9)生長分化因子-9Hepatocytegrowthfactor(HGF)肝細胞生長因子Insulin-likegrowthfactor(IGF)胰島素樣生長因子Growthdifferentiationfactor-15(GDF-15)生長分化因子-15Nervegrowthfactor(NGF)神經(jīng)生長因子Platelet-derivedgrowthfactor(PDGF)血小板衍生生長因子Vascularendothelialgrowthfactor(VEGF)血管內(nèi)皮生長因子第三十一頁，共四十八頁。差異基因net圖第三十二頁，共四十八頁。（三）體外IEC-6熱應激模型及高通量快速篩選抗應激添加劑模型的建立及評價熱應激和ERK1/2信號通路對大鼠IEC-6細胞生長因子表達的影響熱應激對大鼠空腸和IEC-6細胞ERK1/2蛋白的磷酸化水平的影響利用體外IEC-6熱應激評價平臺和差異顯示生長基因高通量篩選抗應激中藥活性部分——蒼術、藿香揮發(fā)油

第三十三頁，共四十八頁。熱應激對IEC-6細胞形態(tài)結構、增殖活力和凋亡的影響第三十四頁，共四十八頁。熱應激和ERK1/2信號對大鼠IEC-6細胞生長因子表達的影響第三十五頁，共四十八頁。大鼠空腸和IEC-6細胞ERK1/2的磷酸化水平第三十六頁，共四十八頁。高溫對IEC-6細胞活力、細胞增殖指數(shù)及

中藥有效部分的影響組別GroupsG0/1期細胞G0/1cell(%)G期細胞Gcell(%)S期細胞Scell(%)增殖指數(shù)PI(%)細胞活力(OD570)對照組CG74.2±3.1b6.9±2.6a18.8±3.9a25.8±3.1a0.757±0.010a高溫組HTG84.4±3.5a4.7±1.8b10.9±1.7c15.6±3.5c0.737±0.005b蒼術油組RHAAG77.7±1.4b6.0±1.2a16.2±2.5ab22.2±1.4a0.750±0.008a藿香油組HAAG80.1±0.8a6.4±2.2a13.5±1.5c19.9±0.8b0.754±0.005a注：同列小寫字母相同者代表組間差異不顯著；不同者代表組間差異顯著(P<0.05)第三十七頁，共四十八頁。IEC-6在高溫中EGF/EGFRmRNA的變化及中藥調(diào)控第三十八頁，共四十八頁。中藥對IEC-6在高溫中P-ERK1/ERK2的影響第三十九頁，共四十八頁。小結1、熱應激導致大鼠IEC-6細胞形態(tài)損傷，降低細胞增殖活力，誘導細胞凋亡。2、熱應激誘導大鼠空腸和IEC-6細胞的ERK1/2信號蛋白磷酸化，并改變IEC-6細胞生長因子的表達水平。3、抑制ERK1/2蛋白磷酸化后，熱應激引起更為嚴重的細胞損傷，誘導更為嚴重的細胞凋亡。4、熱應激時ERK1/2信號參與生長因子表達的調(diào)節(jié)。5、體外細胞應激模型可以作為高通量篩選中藥有效部分的平臺第四十頁，共四十八頁。四.結論熱應激豬26～40℃循環(huán)高溫模型成立。石香顆粒通過調(diào)節(jié)豬體溫，減少小腸上皮細胞、腸絨毛損傷，石香顆粒通過維護小腸黏膜屏障的完整性和營養(yǎng)吸收功能，發(fā)揮抗熱應激作用。熱應激導致豬空腸基因表達差異。芯片HSPs、EGF、EGFR等生長因子mRNA驗證結果表明可靠。這些差異基因涉及機體內(nèi)分泌、免疫功能、細胞損傷和修復、細胞凋亡、信號轉導等。第四十一頁，共四十八頁。Pathway分析預測花生四烯酸代謝途徑、淀粉和蔗糖代謝途徑、亞麻仁油酸代謝途徑、細胞色素P450代謝途徑和MAPK信號通路在熱應激過程中發(fā)揮重要作用。豬小腸黏膜損傷修復的基因信號通道與EGF介導的細胞的損傷，修復相關。石香顆粒主要成分通過顯著促進對EGFR的表達，啟動基因轉錄，促進細胞增殖，損傷的修復。第四十二頁，共四十八頁。五.有待進一步研究的問題高溫對豬空腸的基因差異表達基因為203個；其中上調(diào)有的93個；下調(diào)的有110個。繼續(xù)進行高溫對豬熱應激影響機制的研究，開發(fā)抗熱應激和小腸黏膜損傷修復劑。第四十三頁，共四十八頁。第四十四頁，共四十八頁。第四十五頁，共四十八頁。與動物熱應激中腸黏膜屏障相關的SCI論文LiuFH,YinJD,DuM,YanPS,XuJQ,ZhuXY,YuJ.HeatStressinducedDamagetoPorcineSmallIntestinalEpitheliumassociatedwithDown-RegulationofEpithelialGrowthFactor(EGF)Signaling.JournalofAnimalScience.2009,6(87):1941-1949,IF2.466.YuJin,YinPeng,LiuFenghua..InvolvementofERK1/2signalingpathwayinheatstress-induceddamageandexpressionchangeofgrowthfactorsinratjejunumandIEC-6cells.International

Journal

of

Hyperthermia.2010，10;26(6):538–555.IF2.713.SongXZ,XuJQ,WangT,LiuFH.Chinesemedicinegranuleaffectstheabsorptionandtransportofglucoseinporcinesmallintestinalbrushbordermembranevesiclesunderheatstress.Asian-Australasianjournalofanimalsciences.2009,20：246-254.IF0.875SongXZ,XuJQ,WangT,LiuFH.TraditionalChinesemedicinedecoctionenhancesgrowthperformanceandintestinalglucoseabsorptioninheatstressedpigsbyup-regulatingtheexpressionsofSGLT1andGLUT2mRNA.2009.LivestockScience.128(2010)75–81)IF1.41JinYu,PengYin,FenghuaLiu,XiaoyuZhu,GuilinCheng,AnLu,WeiliLuan,JianqinXu.Effectofheatstressonporcinesmallintestine:astudyofmorphologicalandgeneexpression.ComparativeBiochemistryandPhysiology,PartA156(2010)119–128.IF2.196.JinYu,PengYin,FenghuaLiu,IntegratingmiRNAandmRNAExpressionProfilesinResponsetoHeatStress-