植物總DNA的提取及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)

與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起以核蛋白（DNP）的形式存在。在制備核酸時(shí)通常破壞細(xì)胞壁及細(xì)胞膜來(lái)使核蛋白釋放出來(lái)。植物總DNA包括細(xì)胞核DNA和細(xì)胞核外DNA,前者存在于細(xì)胞核內(nèi)，后者存在于細(xì)胞質(zhì)中有半自主性復(fù)制活性的細(xì)胞器內(nèi)，例如線粒體DNA(mtDNA)和葉綠體DNA(ctDNA)。背景知識(shí)核酸的存在形式第1頁(yè)/共27頁(yè)第一頁(yè)，共28頁(yè)。DNA為白色類似石棉樣的纖維狀物，

RNA的純品呈白色粉末或結(jié)晶。核酸和核苷酸大都呈酸味。DNA、RNA和核苷酸都是極性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑，它們的鈉鹽比游離酸易溶于水。在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。

核酸的理化性質(zhì)第2頁(yè)/共27頁(yè)第二頁(yè)，共28頁(yè)。細(xì)胞破碎抽提去蛋白質(zhì)沉淀核酸基本過(guò)程第3頁(yè)/共27頁(yè)第三頁(yè)，共28頁(yè)。①機(jī)械方法：超聲波處理法、研磨法、勻漿法；②化學(xué)試劑法：用SDS處理細(xì)胞；③酶解法：加入溶菌酶或蝸牛酶，破壞細(xì)胞壁。

細(xì)胞破碎

第4頁(yè)/共27頁(yè)第四頁(yè)，共28頁(yè)。SDS法SDS是有效的陰離子去垢劑,細(xì)胞中DNA與蛋白質(zhì)之間常借靜電引力或配位鍵結(jié)合,SDS能夠破壞這種價(jià)鍵。CTAB法CTAB是一種陽(yáng)離子去垢劑，它可以溶解膜與脂膜，使細(xì)胞中的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物釋放出來(lái)，并使蛋白質(zhì)變性，使DNA與蛋白質(zhì)分離。DNA提取第5頁(yè)/共27頁(yè)第五頁(yè)，共28頁(yè)。蛋白質(zhì)

常用苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）或氯仿：異戊醇（24：1）抽提。RNA常選用RNase消化，或是用LiCl來(lái)消除大分子的RNA。酚類物質(zhì)

提取液中加少量巰基乙醇，選取幼嫩的材料。多糖提取液中加1％PVP。DNA純化（去雜質(zhì)）第6頁(yè)/共27頁(yè)第六頁(yè)，共28頁(yè)。實(shí)驗(yàn)材料

新鮮蔬菜葉片(去葉脈)試劑

2×CTAB抽提液TE緩沖液(pH=8.0)

氯仿：異戊醇(24:1)

材料與試劑第7頁(yè)/共27頁(yè)第七頁(yè)，共28頁(yè)。①離心機(jī)②水浴鍋③研缽④微量移液器儀器用具第8頁(yè)/共27頁(yè)第八頁(yè)，共28頁(yè)。移液器－量程的選擇第9頁(yè)/共27頁(yè)第九頁(yè)，共28頁(yè)。1．取2g清洗涼干的新鮮葉片于研缽中，加1/3藥匙石英砂和4mL2倍的CTAB提取液，迅速研磨。2．將1mL研磨液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，置于65℃水浴中保溫20min，其間顛倒混勻2－3次。破碎細(xì)胞3.12000r/min離心5min，取上清液700μL轉(zhuǎn)到另一離心管中。加入等體積氯仿：異戊醇（24:1）混合液，充分顛倒混勻。12000r/min，離心5min。抽提去蛋白4．將上清液移入新的1.5mL離心管內(nèi)，加600μL異丙醇。顛倒混勻，可見(jiàn)DNA絮狀沉淀。沉淀核酸5．12000r/min，離心1min，倒掉上清液，將離心管倒置干燥。

將沉淀回溶于20μLTE緩沖液待測(cè)。操作步驟第10頁(yè)/共27頁(yè)第十頁(yè)，共28頁(yè)。1)選取新鮮材料，研磨迅速?gòu)氐?，研磨好的材料?yīng)與CTAB抽提液充分混勻；2)若提取產(chǎn)物有顏色，可能是材料中含有較多的多酚類物質(zhì)，添加巰基乙醇（2－5％），盡可能選取幼嫩的材料；3）收集CTAB與核酸形成的復(fù)合物時(shí)不要離心過(guò)度，否則沉淀再溶解難；4）為了獲得具有生物活性的天然核酸，在分離制備過(guò)程中必須采用溫和的條件，避免過(guò)酸過(guò)堿、劇烈地?cái)嚢?，防止熱變性，同時(shí)還要避免核酸降解酶類的降解。注意事項(xiàng)第11頁(yè)/共27頁(yè)第十一頁(yè)，共28頁(yè)。DNA分子在高于等電點(diǎn)的PH溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。在一定電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度與相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)成反比。電泳原理第12頁(yè)/共27頁(yè)第十二頁(yè)，共28頁(yè)。瓊脂糖是一種線性多糖聚合物。濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強(qiáng)。瓊脂糖濃度(%)線型DNA分子的分離范圍(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2第13頁(yè)/共27頁(yè)第十三頁(yè)，共28頁(yè)。儀器和試劑儀器電泳儀電泳槽灌膠模具等第14頁(yè)/共27頁(yè)第十四頁(yè)，共28頁(yè)。Tris-硼酸（TBE）Tris-乙酸（TAE）Tris-磷酸（TPE）常用電泳緩沖液第15頁(yè)/共27頁(yè)第十五頁(yè)，共28頁(yè)。電泳指示劑溴酚蘭在堿性液體中呈紫蘭色，一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成上樣緩沖液。作用：①增加樣品比重，以確保DNA均勻沉入加樣孔內(nèi)。②形成肉眼可見(jiàn)的指示帶，預(yù)測(cè)核酸電泳的速度和位置。③使樣品呈色，使加樣操作更方便。上樣緩沖液第16頁(yè)/共27頁(yè)第十六頁(yè)，共28頁(yè)。溴化乙錠（EB）是一種熒光染料，EB分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對(duì)之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光。其熒光強(qiáng)度與DNA的含量成正比。據(jù)此可粗略估計(jì)樣品DNA濃度。瓊脂糖凝膠EB染色，肉眼可見(jiàn)核酸電泳帶，其DNA量一般>5ng。核酸染色劑注意事項(xiàng)：EB是致癌物質(zhì)，切勿用手接觸，更不要污染環(huán)境。第17頁(yè)/共27頁(yè)第十七頁(yè)，共28頁(yè)。DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)第18頁(yè)/共27頁(yè)第十八頁(yè)，共28頁(yè)。不同種類DNAMarker第19頁(yè)/共27頁(yè)第十九頁(yè)，共28頁(yè)。1.凝膠制備

制備0.8%瓊脂糖凝膠。稱取適量瓊脂糖加入20mL0.5×TBE，加熱至瓊脂糖全部熔化，冷卻至50-60℃時(shí)，加入EB至終濃度0.5μg/mL。緩慢倒入膠板，待膠凝固后拔出梳子。2.加樣

取10μlDNA樣液與2μl上樣buffeer混勻，用微量移液器小心加入樣品槽。3.電泳

接通電源，切記靠近加樣孔的一端為負(fù)，電壓為1~5V/cm（長(zhǎng)度以兩個(gè)電極之間的距離計(jì)算）,待溴酚蘭移動(dòng)到一定位置，停止電泳。4.觀察拍照四、操作步驟第20頁(yè)/共27頁(yè)第二十頁(yè)，共28頁(yè)。第21頁(yè)/共27頁(yè)第二十一頁(yè)，共28頁(yè)。第22頁(yè)/共27頁(yè)第二十二頁(yè)，共28頁(yè)。第23頁(yè)/共27頁(yè)第二十三頁(yè)，共28頁(yè)。第24頁(yè)/共27頁(yè)第二十四頁(yè)，共28頁(yè)。紫外儀上觀察電泳帶及其位置。繪制核酸電泳示意圖。作業(yè)第25頁(yè)/共27頁(yè)第二十五頁(yè)，共28頁(yè)。1.結(jié)合原理，簡(jiǎn)述CTAB法分離提取植物總DNA的基本過(guò)程。2.為了獲得高質(zhì)量的植物總DNA，在分離提取過(guò)程中應(yīng)注意那些問(wèn)題？What?!How?!思考第26頁(yè)/共27頁(yè)第二十六頁(yè)，共28頁(yè)。感謝您的觀看。第27頁(yè)/共27頁(yè)第二十七頁(yè)，共28頁(yè)。內(nèi)容總結(jié)脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)。脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)。第1頁(yè)/共