分子醫(yī)學(xué)技能實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)三 瓊脂糖凝膠電泳法

分子醫(yī)學(xué)技能-實(shí)驗(yàn)三瓊脂糖凝膠電泳法瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳是分離鑒定和純化DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)方法。該技術(shù)操作簡(jiǎn)便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度離心法）所無法分離的DNA片段。當(dāng)用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶(Ethidiumbromide,EB)染色,在紫外光下至少可以檢出1-10ng的DNA條帶,從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置。此外,還可以從電泳后的凝膠中回收特定的DNA條帶,用于以后的克隆操作。原理：在pH值為8.0～8.3時(shí)，核酸分子堿基幾乎不解離，磷酸全部解離，核酸分子帶負(fù)電，在電泳時(shí)向正極移動(dòng)。采用適當(dāng)濃度的凝膠介質(zhì)作為電泳支持物，在分子篩的作用下，使分子大小和構(gòu)象不同的核酸分子泳動(dòng)率出現(xiàn)較大的差異，從而達(dá)到分離核酸片段檢測(cè)其大小的目的。核酸分子中嵌入熒光染料（如EB）后，在紫外燈下可觀察到核酸片段所在的位置。DNA顯色劑多用EB，它能和堿基間的氫鍵結(jié)合，在波長(zhǎng)為254nm~365nm的紫外光照射下呈橘紅色（530nm）的熒光。瓊脂糖電泳分離DNA的范圍瓊脂糖可以形成各種形狀、大小的孔隙度。瓊脂糖凝膠分離DNA片度大小范圍較廣,不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長(zhǎng)度從200bp至近50kb的DNA片段。瓊脂糖通常用水平裝置在強(qiáng)度和方向恒定的電場(chǎng)下電泳。電泳指示劑

核酸電泳常用的指示劑有兩種，溴酚藍(lán)（bromophenolblue,Bb）呈藍(lán)紫色；二甲苯晴（xylenecyanol,Xc）呈藍(lán)色，它攜帶的電荷量比溴酚藍(lán)少，在凝膠中的遷移率比溴酚藍(lán)慢。膠濃（%）溴酚藍(lán)二甲苯青0.61kb10.6kb2kb1.40.2kb1.6kb20.15kb影響凝膠電泳的因素DNA的分子大小、構(gòu)象線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對(duì)數(shù)成反比。超螺旋DNA移動(dòng)最快,開環(huán)其次、線狀雙鏈DNA移動(dòng)最慢。瓊脂糖濃度一個(gè)給定大小的線狀DNA分子,其遷移速度在不同濃度瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對(duì)數(shù)與凝膠濃度成線性關(guān)系。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。影響凝膠電泳的因素電源電壓

在低電壓時(shí),線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率達(dá)到最大,所加電壓不得超過5v/cm。

嵌入染料的存在

熒光染料溴化乙啶用于檢測(cè)瓊脂糖凝膠中的DNA,染料會(huì)嵌入到堆積的堿基對(duì)之間并拉長(zhǎng)線狀和帶缺口的環(huán)狀DNA，使其剛性更強(qiáng),還會(huì)使線狀DNA遷移率降低15％。

離子強(qiáng)度影響

電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時(shí)(如誤用蒸餾水配制凝膠),電導(dǎo)率最小,DNA幾乎不移動(dòng),在高離子強(qiáng)度的緩沖液中(如誤加10×電泳緩沖液),則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱,嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起凝膠熔化或DNA變性。MS1S2實(shí)驗(yàn)材料及試劑

瓊脂糖

電泳緩沖液：1TAE6加樣緩沖液：溴酚藍(lán)、二甲苯青、甘油EB染色液；溴化乙錠

實(shí)驗(yàn)操作及注意事項(xiàng)瓊脂糖凝膠板的制備（封板、梳子位置與高度、1%倒膠3mm、凝固后拔梳）倒緩沖液，加樣（樣品中加入1/5體積的上樣buffer）電泳（方向、電壓、時(shí)間）染色與檢測(cè)（EB10min，紫外檢測(cè)）注意事項(xiàng)倒膠時(shí)把握好膠的溫度，不要高于60℃，否則溫度太高會(huì)使制板變形膠一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要豎直向上，