液相色譜方法開發(fā)

液相色譜方法開發(fā)第一頁(yè)，共四十二頁(yè)，2022年，8月28日提綱：一.HPLC的應(yīng)用二.方法開發(fā)過程

1）選擇HPLC檢測(cè)器

2）方法開發(fā)的具體步驟

3）梯度洗脫方法第二頁(yè)，共四十二頁(yè)，2022年，8月28日一.HPLC的廣泛應(yīng)用

據(jù)2008年統(tǒng)計(jì)，世界上化合物總數(shù)多達(dá)5000多萬(wàn)種在全部有機(jī)化合物中僅有20％左右的樣品適用于GC分析而HPLC可對(duì)80％左右的有機(jī)化合物進(jìn)行分離和分析第三頁(yè)，共四十二頁(yè)，2022年，8月28日HPLC的廣泛應(yīng)用HPLC特別適用于高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性和熱穩(wěn)定性差的化合物以及生物活性物質(zhì)的分離和分析并且可以做制備

在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)、生命科學(xué)、化工、環(huán)保等領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用潛力。第四頁(yè)，共四十二頁(yè)，2022年，8月28日HPLC的應(yīng)用領(lǐng)域在食品研究中的分析應(yīng)用食品中的天然成分碳水化合物類脂化合物、甘油三酸酯、膽固醇脂肪酸和有機(jī)酸蛋白、肽、氨基酸食品添加劑酸味劑、甜味劑、香精、乳化劑抗氧化劑、防腐劑顏料和染料（色素〕維生素污染物霉菌（黃曲霉毒素〕農(nóng)藥殘留和獸藥殘留多環(huán)芳烴（PAHS〕和亞硝酸第五頁(yè)，共四十二頁(yè)，2022年，8月28日HPLC的應(yīng)用領(lǐng)域

在醫(yī)藥研究中分析應(yīng)用藥物分析有USP、BP、CP等標(biāo)準(zhǔn)

常用藥物研究中的應(yīng)用：解熱鎮(zhèn)痛藥、鎮(zhèn)靜藥、安定藥、心血管藥、磺胺類消炎藥等。甾體藥物研究中的應(yīng)用：腎上腺皮質(zhì)激素、雄性激素、雌性激素和孕激素等?？咕仡愃幬镅芯恐械膽?yīng)用：青霉素、頭孢菌素、慶大毒素、四環(huán)素、氯霉素、諾氟沙星等。中草藥研究中的應(yīng)用：生物堿、甙類(皂甙、強(qiáng)心甙、黃酮甙等)、萜類手性藥物研究中的應(yīng)用：光學(xué)異構(gòu)體的拆分(如解毒劑D-青霉胺毒性小，L-異構(gòu)體毒性很強(qiáng))醫(yī)療藥物的檢測(cè)、新藥研究、藥物代謝、藥代動(dòng)力學(xué)研究。

在獸藥研究中分析應(yīng)用

第六頁(yè)，共四十二頁(yè)，2022年，8月28日HPLC的應(yīng)用領(lǐng)域

在生物化學(xué)和生物工程中的應(yīng)用氨基酸、多肽合成和蛋白質(zhì)的分析研究核堿、核苷、核苷酸和核酸的分析研究生物胺的分析研究（兒茶酚胺類)

在精細(xì)化工分析中的應(yīng)用醇、醛和酮、醚的分離分析酸和酯的分離分析表面活性劑的分析聚合物的分析研究藥物、農(nóng)藥、染料、炸藥等工業(yè)產(chǎn)品第七頁(yè)，共四十二頁(yè)，2022年，8月28日HPLC的應(yīng)用領(lǐng)域化妝品行業(yè)要控制和分析：防腐劑、防曬劑、性激素以及維生素等；在公安、刑警破案工作需要投毒藥物、毒品分析等在環(huán)境污染分析中的應(yīng)用廢氣、廢水、廢渣中多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯、農(nóng)藥殘留、酚類和胺類的檢測(cè)

在無(wú)機(jī)離子分析中應(yīng)用飲用水、酸雨、土壤中陰離子和陽(yáng)離子分析

第八頁(yè)，共四十二頁(yè)，2022年，8月28日第九頁(yè)，共四十二頁(yè)，2022年，8月28日第十頁(yè)，共四十二頁(yè)，2022年，8月28日二.方法開發(fā)的過程Adaptedfrom:Snyder,L.R.;Kirkland,J.J.;Glajch,J.L;PracticalHPLCMethodDevelopment2ndEd.,Wiley-Interscience,NewYork,1997,p.21.得到樣品信息，確定分離目標(biāo)2.確定特定HPLC過程、樣品預(yù)處理等的需求3.選擇合適的檢測(cè)器4.選擇HPLC方法；初步分離；建立最佳分離條件5.優(yōu)化分離條件6.檢查特定過程的問題及需要7.定量校正8.日常使用的確認(rèn)第十一頁(yè)，共四十二頁(yè)，2022年，8月28日第一步干什么?想辦法得到各種信息向同行了解是否做過此類樣品，或有否類似樣品的分析方法查文獻(xiàn)和方法，如CA,AA,AOAC,EPA---儀器制造商的文獻(xiàn)，如Dionex,Waters對(duì)色譜柱有足夠的了解掌握分離機(jī)理，自己開發(fā)方法充分了解您自己的樣品第十二頁(yè)，共四十二頁(yè)，2022年，8月28日分析時(shí)要了解哪方面的情況？靈敏度的要求有多高?樣品的本底是否很復(fù)雜?有多少組份要分析?對(duì)分析的精確度、準(zhǔn)確度等有多高要求?是否因是日常檢驗(yàn)，而要求方法容易使用?第十三頁(yè)，共四十二頁(yè)，2022年，8月28日分離(制備)時(shí)要了解哪方面的情況？要分離（即制備）的樣品量有多大?要分離的組份在樣品中的含量很高?還是微量?是否需要保持生物活性?對(duì)分離產(chǎn)物純度的要求有多高?純度或活性的鑒定如何完成?第十四頁(yè)，共四十二頁(yè)，2022年，8月28日使用文獻(xiàn)方法注意點(diǎn)色譜柱填料的種類、品牌是否相同?注意文獻(xiàn)方法的流動(dòng)相是否損害色譜柱?如色譜填料品牌不同，需要調(diào)整流動(dòng)相注意色譜柱的規(guī)格：內(nèi)徑、柱長(zhǎng)需要調(diào)整流速、進(jìn)樣量注意梯度條件了解系統(tǒng)的滯后體積（梯度）第十五頁(yè)，共四十二頁(yè)，2022年，8月28日1）選擇HPLC檢測(cè)器對(duì)樣品有響應(yīng)并有一個(gè)輸出信號(hào)應(yīng)該提供在檢測(cè)器響應(yīng)值與樣品濃度之間的線性關(guān)系；并且所設(shè)計(jì)的校正技術(shù)應(yīng)該促進(jìn)這種關(guān)系但是：由于受HPLC系統(tǒng)其他部件的影響會(huì)產(chǎn)生響應(yīng)與濃度之間關(guān)系的與線性偏離現(xiàn)象并不是所有的檢測(cè)器是線性的受HPLC系統(tǒng)其他部件的影響，檢測(cè)器的表現(xiàn)可能與其最佳水平有較大的差距第十六頁(yè)，共四十二頁(yè)，2022年，8月28日2）方法開發(fā)一般的具體步驟先用一根短的色譜柱用相對(duì)較高的流速使用盡可能純度高的標(biāo)準(zhǔn)品先用高強(qiáng)度的洗脫液調(diào)節(jié)k’值改變保留值調(diào)節(jié)a值改變選擇性通過改變流動(dòng)相的pH值，使樣品成中性加入“對(duì)離子”，使樣品呈中性調(diào)節(jié)柱長(zhǎng)度改變柱效及分離速度第十七頁(yè)，共四十二頁(yè)，2022年，8月28日反相色譜的方法開發(fā)開發(fā)過程實(shí)例色譜條件∶色譜柱：C18，4.6mm×15mm流動(dòng)相：乙腈/水，乙腈從100%逐漸降低（或走梯度）舉例中用不同的溶劑強(qiáng)度，60/40、50/50、40/60，由強(qiáng)漸弱流速：1ml/min第十八頁(yè)，共四十二頁(yè)，2022年，8月28日方法開發(fā)的其他因素流速對(duì)柱效的影響不同內(nèi)徑的色譜柱有自己的最佳流速樣品的進(jìn)樣量(濃度)對(duì)柱效的影響樣品的進(jìn)樣體積對(duì)柱效的影響溶劑粘度對(duì)柱效的影響 以上因素均影響分離度第十九頁(yè)，共四十二頁(yè)，2022年，8月28日3）液相色譜的方法開發(fā)

梯度洗脫法第二十頁(yè)，共四十二頁(yè)，2022年，8月28日液相色譜泵穩(wěn)定平滑并且重現(xiàn)性好的流速可靠且充分的溶劑混合準(zhǔn)確及重現(xiàn)的自動(dòng)溶劑混合準(zhǔn)確及重現(xiàn)的梯度形成有效的流速范圍制備色譜或微柱、窄柱色譜要考慮滯后體積梯度分析更為關(guān)注目的：在任何情況下保持最高精度第二十一頁(yè)，共四十二頁(yè)，2022年，8月28日梯度的洗脫方式高壓梯度及低壓梯度第二十二頁(yè)，共四十二頁(yè)，2022年，8月28日梯度：高壓混合高壓梯度使用多臺(tái)色譜泵，在泵后混合配置靈活、簡(jiǎn)單，脫氣簡(jiǎn)單易調(diào)節(jié)梯度的滯后體積第二十三頁(yè)，共四十二頁(yè)，2022年，8月28日梯度：低壓混合低壓梯度用單泵產(chǎn)生梯度，泵前（低壓端）混合對(duì)脫氣要求高不易調(diào)節(jié)梯度的滯后體積如設(shè)計(jì)不當(dāng)，梯度的

準(zhǔn)確性受影響滯后體積（系統(tǒng)

體積）設(shè)計(jì)合理第二十四頁(yè)，共四十二頁(yè)，2022年，8月28日梯度滯后：系統(tǒng)體積的影響死體積/譜帶展寬體積(無(wú)色譜柱時(shí))滯后(系統(tǒng))體積滯后(系統(tǒng))體積溶劑輸送系統(tǒng)(泵)檢測(cè)器進(jìn)樣器色譜柱梯度混合器溶劑輸送系統(tǒng)(泵)高壓梯度注意∶滯后體積包括進(jìn)樣器、阻尼器、混合器及其管路比例閥檢測(cè)器進(jìn)樣器ABCD色譜柱溶劑輸送系統(tǒng)(泵)低壓梯度阻尼器混合器第二十五頁(yè)，共四十二頁(yè)，2022年，8月28日梯度滯后大小的影響滯后體積太大會(huì)引起梯度變化的延遲例如：滯后體積為2.0ml，流速1.0ml/min實(shí)際梯度會(huì)比設(shè)置值晚2分鐘響應(yīng)，沒有問題對(duì)微柱色譜影響更大，同上例但流速0.1ml/min實(shí)際梯度會(huì)比設(shè)置值晚20分鐘響應(yīng)，不能接受滯后體積的不同會(huì)使方法轉(zhuǎn)換麻煩滯后體積比文獻(xiàn)大或小都會(huì)使方法不能重現(xiàn)滯后體積的變化會(huì)導(dǎo)致梯度重現(xiàn)性不好普通分析型液相色譜的滯后體積為1~4ml（4元泵<400μl，高壓泵<150μl

）第二十六頁(yè)，共四十二頁(yè)，2022年，8月28日滯后體積變化的影響設(shè)計(jì)不好的HPLC系統(tǒng)，滯后體積隨反壓變化滯后體積隨反壓變化的后果：梯度的準(zhǔn)確性不好，造成：方法的適應(yīng)性不好用靜態(tài)梯度混合器；固定滯后體積可明顯改善梯度特性梯度百分比保留時(shí)間梯度曲線好的梯度滯后曲線保留時(shí)間梯度百分比不好的梯度滯后曲線固定滯后體積，改善了梯度性能普通的低壓梯度系統(tǒng)第二十七頁(yè)，共四十二頁(yè)，2022年，8月28日色譜柱反壓變化對(duì)梯度實(shí)驗(yàn)的影響withoutpulsedamperBack-pressure:

60bar,85barand

105barVariation:<1%5681012-100200400600900mAUMinutesMethylparabeneEthylparabenePropylparabeneButylparabene5681012-100200400600900mAUMinutesMethylparabeneEthylparabenePropylparabeneButylparabenePumpwithpulsedamperBack-pressure:

60bar,85barand

105barVariation:>2%Acclaim120,C18,5μm,4.6x100mm;0.5mL/min;25°C;5μLinjectionvolume;UVdetectionat256nm;Eluent(A)Waterand(B)Acetonitril;Gradient:30%bto100%Bin10min;Methyl-,Ethyl-,Propyl-andButylparabene,10mg/Leach第二十八頁(yè)，共四十二頁(yè)，2022年，8月28日梯度洗脫的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)單位時(shí)間的分離能力增加檢測(cè)靈敏度提高缺點(diǎn)儀器設(shè)備要求高不適合某些檢測(cè)方式(RI)柱需再生平衡定量分析的重復(fù)性較低？第二十九頁(yè)，共四十二頁(yè)，2022年，8月28日一般流出問題早流出峰的分離度差.遲流出峰的峰寬增加而峰高降低.由于k’范圍寬，所以分析時(shí)間長(zhǎng).強(qiáng)保留組分造成柱污染.等梯度洗脫

-在洗脫樣品的整個(gè)過程中，流動(dòng)相的組成保持不變.第三十頁(yè)，共四十二頁(yè)，2022年，8月28日AnalyticalEducationCenterH5929A11-09梯度洗脫-一個(gè)解決方案優(yōu)點(diǎn)

改善分離度

提高檢測(cè)性能

能夠分離復(fù)雜樣品

縮短分析時(shí)間

降低由于強(qiáng)保留組分而使色譜柱性能變差的可能性其他應(yīng)用

柱清洗

方法開發(fā)中的嘗試運(yùn)行

梯度洗脫-在分離過程中改變流動(dòng)相組成.第三十一頁(yè)，共四十二頁(yè)，2022年，8月28日梯度平衡時(shí)間的影響（一）10分鐘的梯度，6分鐘的平衡時(shí)間色譜圖不重復(fù)第三十二頁(yè)，共四十二頁(yè)，2022年，8月28日梯度平衡時(shí)間的影響（二）平衡時(shí)間∶6分鐘平衡時(shí)間∶7分鐘平衡時(shí)間∶8分鐘平衡時(shí)間∶9分鐘

平衡時(shí)間從6到7分鐘，第一個(gè)峰的保留時(shí)間有明顯的變化，說明6到7分鐘的平衡時(shí)間不足，而8到9分鐘變化不大因而大于這個(gè)時(shí)間時(shí)，平衡充足。第三十三頁(yè)，共四十二頁(yè)，2022年，8月28日高效液相經(jīng)常使用粒徑5um的色譜柱，用過一段時(shí)間后，柱壓會(huì)略有升高，尤其是做中藥。常用來(lái)洗色譜柱的溶劑為甲醇，當(dāng)色譜柱用甲醇洗過之后，再用含乙腈的流動(dòng)相平衡，會(huì)使柱壓迅速升高，色譜柱滲漏，這是由于甲醇和乙腈匯合產(chǎn)生局部高壓。因此，這種情況下，應(yīng)慢慢升高流速，可以從0.6ml/min開始，一步步的平穩(wěn)柱壓，防止色譜柱漏液。第三十四頁(yè)，共四十二頁(yè)，2022年，8月28日梯度洗脫裝置分兩種：

高壓梯度：用兩臺(tái)高壓輸液泵將兩種溶劑分別輸入，

低壓梯度：在常壓下將兩種或多種溶劑先混合，然后用高壓泵將流動(dòng)相輸入到色譜柱中。梯度洗脫優(yōu)點(diǎn)：提高分離度、縮短分離時(shí)間、降低最小檢測(cè)量和提高分離精度。在使用梯度洗脫時(shí)需要注意的地方：1.注意各溶劑間的互溶性；2.對(duì)溶劑的純度要求更高（影響重現(xiàn)性）；3.注意梯度變化導(dǎo)致系統(tǒng)壓力的變化，防止超出限度。

混合溶劑的粘度常隨組成的變化而變化。在梯度洗脫時(shí)，常會(huì)出現(xiàn)壓力變化，例如純水或甲醇的粘度都比較小，但是，當(dāng)二者以相近的比例混合時(shí)，粘度會(huì)增大很多，此時(shí)的柱壓是純水或甲醇為流動(dòng)相時(shí)的兩倍。因此要防止梯度洗脫過程中壓力超過輸液泵或色譜柱所能承受的最大壓力。第三十五頁(yè)，共四十二頁(yè)，2022年，8月28日4.低壓梯度混合后易產(chǎn)生氣泡，要注意脫氣。一般低壓梯度是需要在線脫氣機(jī)來(lái)完成的，因各流路溶劑混合后會(huì)產(chǎn)生很多氣泡；而高壓梯度可不用脫氣機(jī)脫氣。5.梯度操作容易出現(xiàn)鬼峰，應(yīng)作空白試驗(yàn)。空白對(duì)照至少做三次。6.選擇梯度操作時(shí)，幾相之間相變化要盡量小,否則不易平衡。7.梯度洗脫應(yīng)選用對(duì)流動(dòng)相組成變化不敏感的選擇性檢測(cè)器（如紫外吸收檢測(cè)器或熒光檢測(cè)器），而不能使用對(duì)流動(dòng)相組成變化敏感的通用型檢測(cè)器（如示差折光檢測(cè)器）。第三十六頁(yè)，共四十二頁(yè)，2022年，8月28日8.要注意水相中鹽的濃度，防止在有機(jī)相提升過程中鹽的析出。特別要注意溶劑的互溶性，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動(dòng)相。有些溶劑在一定的比例內(nèi)互溶，超出一定的范圍后就不會(huì)互溶。例如：乙腈和1mol/L的醋酸銨（pH5.16）做梯度洗脫，乙腈含量超過70%時(shí)就會(huì)出現(xiàn)不溶，甲醇和已烷混合，甲醇含量高于30%時(shí)就會(huì)分層等。當(dāng)有機(jī)溶劑和緩沖溶液混合時(shí)還可能析出鹽的結(jié)晶體，尤其使用磷酸鹽時(shí)需特別小心。9.每次梯度洗脫后必須對(duì)色譜柱進(jìn)行再生處理，將柱子平衡到初始狀態(tài)。梯度結(jié)束后用初始流動(dòng)相沖洗，可用10～30倍柱容積的初始流動(dòng)相洗脫色譜柱，使固定相與初始流動(dòng)相達(dá)到完全平衡！柱子再生。（梯度周期）第三十七頁(yè)，共四十二頁(yè)，2022年，8月28日9.要檢測(cè)的峰盡量在有機(jī)相和水相的比例穩(wěn)定時(shí)出峰，這樣出峰時(shí)間的重現(xiàn)性較好；10.有機(jī)相的比例不是越高越好，只要樣品峰能滿足要求即可，有機(jī)相比例相差越大，梯度要平衡的時(shí)間越長(zhǎng)；11.低壓混合，流速慢，做質(zhì)譜時(shí)，盡量不要跑梯度，平衡時(shí)間比較長(zhǎng)（除非你要測(cè)多個(gè)成分，比如中藥指紋圖譜），如果非要跑，一定要盡量減小死體積。第三十八頁(yè)，共四十二頁(yè)，2022年，8月28日12.梯度淋洗和氣相色譜中的程序升溫相似，給色譜分離帶來(lái)很大的方便，它對(duì)于復(fù)雜混合物，特別是保留強(qiáng)度差異很大的混合物的分離，是重要的手段。但離子色譜電導(dǎo)檢測(cè)器是一種總體性質(zhì)的檢測(cè)器，因此梯度淋洗一般只在含氫氧根離子的淋洗液中采用抑制電導(dǎo)檢測(cè)時(shí)才能實(shí)現(xiàn)。13.初始平衡時(shí)間盡量長(zhǎng)點(diǎn)