氨基酸肽和蛋白質(zhì)

氨基酸肽和蛋白質(zhì)第一頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日蛋白質(zhì)是多聚酰胺，是由氨基酸組成的，組成蛋白質(zhì)的氨基酸通常有20種，稱之為天然氨基酸，都為L(zhǎng)-型a-氨基酸。蛋白質(zhì)是復(fù)雜的生物生物高分子，相對(duì)分子質(zhì)量通常都在10000以上，如胰島素的相對(duì)分子質(zhì)量為6000，但它的二聚體的相對(duì)分子質(zhì)量為12000，同時(shí)具有復(fù)雜的高級(jí)結(jié)構(gòu)，所以胰島素可視為最小的蛋白質(zhì)。從結(jié)構(gòu)上講，肽與蛋白質(zhì)沒(méi)有什么區(qū)別，肽也是由氨基酸以酰胺鍵組成，也同樣具有較穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，只不過(guò)分子較蛋白質(zhì)小。肽也具有多樣的和復(fù)雜的生理功能。它在生物體內(nèi)傳遞信息、調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝活動(dòng)和協(xié)調(diào)各機(jī)體的生理過(guò)程，在生命活動(dòng)中起著非常重要的作用。第二頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日第一節(jié)氨基酸

氨基酸的結(jié)構(gòu)與分類、理化性質(zhì)、氨基酸的分離分析（生物化學(xué)和食品化學(xué)已經(jīng)學(xué)過(guò)）第三頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日第二節(jié)肽

肽和蛋白質(zhì)都是重要的生命基礎(chǔ)物質(zhì)。從結(jié)構(gòu)上看它們是相同的，都是由氨基酸以酰胺鍵連接而成。構(gòu)成多肽與蛋白質(zhì)的氨基酸通常為a-氨基酸，約20種，都是L-型，只有在微生物代謝產(chǎn)物、植物及個(gè)別低等動(dòng)物來(lái)源的多肽中存在非天然的D型氨基酸。多肽與蛋白質(zhì)在基本結(jié)構(gòu)上是沒(méi)有區(qū)別的，只是分子大小的不同?，F(xiàn)在習(xí)慣的區(qū)分是將相對(duì)分子質(zhì)量10000以下的(即約含100個(gè)氨基酸殘基結(jié)構(gòu)單元)稱作肽，而大于此值則為蛋白質(zhì)。另外，由于蛋白質(zhì)的分子較大，因此，分子內(nèi)部各種能穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的因素(如氫鍵、鹽鍵等各種次級(jí)鍵及芳香基團(tuán)間的相互作用等)明顯大于多肽，蛋白質(zhì)比多肽具有更穩(wěn)定和更復(fù)雜的高級(jí)結(jié)構(gòu)。第四頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日肽和蛋白質(zhì)在生命科學(xué)、生物醫(yī)學(xué)及內(nèi)分泌學(xué)中占有非常重要的地位。細(xì)胞分化、免疫防御、腫瘤病變、抗御衰老與生殖控制等生理活動(dòng)無(wú)不與多肽密切相關(guān)。許多天然和合成的多肽在生物醫(yī)藥中的應(yīng)用是人們熟知的。例如，胰島素用于治療糖尿病、調(diào)鈣素用于骨質(zhì)疏松癥、促黃體激素釋放激素對(duì)于生殖系統(tǒng)疾病及一些多肽類抗菌素如Bleomycin對(duì)于腫瘤抑制等，都說(shuō)明了多肽類藥物的重要性。作為各種酶重要組分的蛋白質(zhì)，對(duì)于生命活動(dòng)的重要性更是不言而喻的。沒(méi)有這些重要生物催化劑的作用，生命活動(dòng)就將停止。因此，研究多肽和蛋白質(zhì)化學(xué)對(duì)于了解生命現(xiàn)象和改善生命活動(dòng)是非常重要的。第五頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日一、肽和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和特性

肽和蛋白質(zhì)都是由氨基酸通過(guò)酰胺鍵(-CONH-)聯(lián)結(jié)而成。例如，一個(gè)由丙氨酸(alanine)、半胱胺酸(cysteine)和纈氨酸(valine)組成的三肽結(jié)構(gòu)如下：第六頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日在三肽中含有兩個(gè)酰胺鍵。由于羰基與氮原子之間的鍵已具部分雙鍵性質(zhì)，限制自由旋轉(zhuǎn)。因此，這四個(gè)原子處于同一平面，這一結(jié)構(gòu)特征對(duì)于肽和蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象是非常重要的。第七頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日肽的分類：按結(jié)構(gòu)特征，肽分為：（1）直連肽，即（2）環(huán)肽:以硫硫鍵相連的環(huán)肽，如催產(chǎn)素第八頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日頭尾以酰胺鍵相連的環(huán)肽，如環(huán)肽類抗菌素除了上述常見(jiàn)的環(huán)肽之外，還有內(nèi)酯肽及側(cè)鏈環(huán)肽等。

第九頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日二、天然的生物活性多肽

迄今為止，對(duì)生物活性多肽的研究主要集中在動(dòng)物，特別是哺乳動(dòng)物來(lái)源的生物活性肽。它們?cè)诓溉槔锶缛祟惖乃袃?nèi)分泌臟器中都有分布。

從哺乳類動(dòng)物得到的多肽類激素種類很多，分布也非常廣泛，生理功能也非常顯著。但這類多肽的含量都非常少。例如，促黃體激素釋放激素(LH-RH)存在于下丘腦中，20世紀(jì)70年代初Schally與Guillernin等從數(shù)十萬(wàn)頭豬或羊的下丘腦中才分離純化得到毫克量的提抽物，并借此確定了LH-RH的結(jié)構(gòu)。下表所示的多肽激素根據(jù)它們來(lái)源不同的內(nèi)分泌腺及作用靶細(xì)胞的不同，大體可分為下丘腦、垂體、胃腸、胰腺及組織激肽等多肽激素研究的進(jìn)展表明，它們的分布是很廣泛的。有些生物活性肽如激肽類，不但存在于高等動(dòng)物中，也普遍存于低等動(dòng)物中。

第十頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日第十一頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日抗菌多肽具離子通道功能，有抗細(xì)菌和真菌活性。Nisin具有更復(fù)雜的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，它現(xiàn)被用作食品防腐劑。自1971年結(jié)構(gòu)被確定以來(lái)，Shiba等對(duì)其進(jìn)行了構(gòu)象研究并已化學(xué)合成。它是從霉菌中分離得到的富含D型氨基酸及非天然氨基酸的環(huán)肽。它不僅能抑制真菌和酵母的生長(zhǎng)，同時(shí)也具有抗炎癥活性，是重要的免疫抑制劑，被用于器官移植手術(shù)中。第十二頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日1、肽的分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定

一般地講，用于氨基酸、肽與蛋白質(zhì)的純化方法大致相同，如層析、電泳及離子交換等。近代在肽類化合物的分離方法中，最具實(shí)用價(jià)值的方法有以下幾種：（1）凝膠過(guò)濾：又稱分子篩，實(shí)際上它又可視為體積排阻層析，用作支撐物的是一類多孔的高分子。在這類柱分離中，肽類混合物中的小分子可以進(jìn)入多孔的支撐物，而大分子則不能進(jìn)入。因此，大分子先洗脫下來(lái)，而小分子則隨后流出，達(dá)到分類目的。如下圖。第十三頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日第十四頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日分子篩的種類：葡聚糖凝膠（dextran)：商品名Sephadex，有各種交聯(lián)度的葡聚糖凝膠，根據(jù)其適用范圍有SephadexG10-G20等各種不同型號(hào)。瓊脂糖凝膠：現(xiàn)在常用的商品有Sepharose與Biogel系列。第十五頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日(2)SDS電泳聚丙烯酰胺(polyacrylarnide)也是一種凝膠，它更多地被用作電泳支撐物。SDS電泳廣泛地用于肽與蛋白質(zhì)的分析鑒定。

第十六頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日（3）高效液相層析高效液相層析的特點(diǎn)是指層析是在高壓下進(jìn)行的，分離速度快而且是高效的，它的支撐物類型很廣，只要具有大的有效的表面積的物質(zhì)都可用作固定相，可以是交換樹(shù)脂，也可以是凝膠，但最常用的硅膠，特別是衍生化了的烷基硅膠，即是反向高效液相層析(RP-HPLC)，這是目前被廣泛用于多肽類化合物的分離技術(shù)。在此，它的固定相為非極性的烷基化硅膠，而移動(dòng)相為極性洗脫液，通常為各種pH與離子濃度的緩沖液，為了改進(jìn)洗脫效果，通常加入一些有機(jī)溶劑作改進(jìn)劑，常用的溶劑，如乙腈、甲醇等，其中，尤以乙腈為佳，因?yàn)樗ざ鹊筒⑶揖哂辛己玫娜芙庑阅?。這樣極性大的肽先洗脫下來(lái)，而極性小的則隨后。RP-HPLC是分離多肽混合物的有效手段。如果選擇好適當(dāng)條件，則可將性質(zhì)非常類似結(jié)構(gòu)差別很小的肽類混合物分開(kāi)。

第十七頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日其他一些常用于多肽類化合物分離的技術(shù)如等電聚焦(isoelectricfocusing)、毛細(xì)管電泳(capillaryelectrophoresis)及SDS電泳等同樣也廣泛地應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分離鑒定，較詳細(xì)的敘述見(jiàn)蛋白質(zhì)部分。

第十八頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日2、肽的合成從19世紀(jì)80年代E．Fischer與T．Curtius第一次成功地合成多肽開(kāi)始，迄今已有一百多年歷史。近年來(lái)，由于有機(jī)合成化學(xué)與近代分析技術(shù)的進(jìn)步，使得多肽合成化學(xué)更趨成熟。特別是固相合成技術(shù)的發(fā)展圾隨之而實(shí)現(xiàn)的機(jī)械化、自動(dòng)化，使得快速、方便地合成多肽成為現(xiàn)實(shí)。大多數(shù)肽類化合物在自然界存在很少，而且還存在一些結(jié)構(gòu)上的不穩(wěn)定性，而化學(xué)合成的多肽或修飾的多肽類化合物可以克服這些缺點(diǎn)，可以提使種類繁多的多肽類藥物，在生命科學(xué)的發(fā)展中起了重要作用。第十九頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日要實(shí)現(xiàn)一個(gè)簡(jiǎn)單二肽的合成，通常步驟是：首先將作為羧基組分的氨基酸的氨基加以保護(hù)，同時(shí)將作為氨基組分的氨基酸的羧基加以保護(hù)。反應(yīng)如下：其次，活化羧基組分中的羧基：活化羧基的方法很多，可通過(guò)形成酰鹵、酸酐或各種類型的活化酯或其他活性衍生物以實(shí)現(xiàn)羧基的活化。

第二十頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日（1）氨基的保護(hù)。在種類繁多的氨基保護(hù)基中，最常用的還是氨基甲酸酯(urethane或carbamate)。其中最常用的與最具代表性的有芐氧羰?；?benzyloxycarbonyl，Z)，叔丁氧羰?；?t-butyloxycarbonyl,BOC)及芴甲氧羰?；?9-fluorenylmethoxycarbonyl，F(xiàn)moc)。（2）羧基的保護(hù)。相對(duì)于氨基保護(hù)而言，羧基的保護(hù)基種類要簡(jiǎn)單得多。在最簡(jiǎn)單的情況下通過(guò)與堿金屬成鹽就可保護(hù)。通常都是酯化成甲酯、乙酯、叔丁酯或芐酯等保護(hù)。甲酯或乙酯可通過(guò)皂化脫除，而芐酯則用催化氫解脫除。叔丁酯的脫除則通常用酸解(HCl、CF3COOH等)實(shí)現(xiàn)。

‘第二十一頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日（3）側(cè)鏈基團(tuán)的保護(hù)。在天然氨基酸中，有些還帶有功能側(cè)鏈，如半胱氨酸的巰基、絲氨酸與酪氨酸的羥基、精氨酸的胍基和組氨酸的咪唑基等。這些功能團(tuán)一般都需要加以保護(hù)。這些保護(hù)基團(tuán)的選擇應(yīng)與a-氨基與羧基的保護(hù)基團(tuán)協(xié)調(diào)配合。（4）肽鍵的形成。正如前述，幾乎所有肽鍵形成的方法都是活化羧基組分中的羧基，以利于氨基的親核進(jìn)攻。早期應(yīng)用的方法如酰氯(RCOCl)、疊氮(RCON3)由于存在一些缺點(diǎn)，現(xiàn)已較少應(yīng)用?，F(xiàn)在形成肽鍵的常用方法有活化酯法、酸酐法及縮合劑。第二十二頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日（5）肽的固相合成。上述的肽鍵形成方法對(duì)于液相或固相肽合成都是相同的，但在實(shí)現(xiàn)的方式或手段上卻是不同的。固相合成是以一種不溶的高分子為載體，實(shí)現(xiàn)在半雜相情況下的縮合，用過(guò)量的反應(yīng)物與縮合劑以使縮合反應(yīng)接近完全，過(guò)量縮合劑與反應(yīng)物則用簡(jiǎn)單的洗滌方法除去。連接在不溶的高分子物上的肽再經(jīng)過(guò)重復(fù)的操作方式增長(zhǎng)。以合成一個(gè)含A、B、C、D、E、F的六肽為例，其合成流程如圖11-6所示。

第二十三頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日第二十四頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日第三節(jié)蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)在生命科學(xué)中的重要性是不言而喻的，在生物體的各種組織中都廣泛存在。它是生物催化劑一酶；保護(hù)性蛋白——抗體；調(diào)節(jié)蛋白——DNA結(jié)合蛋白和激素；結(jié)構(gòu)蛋白——膠原及傳送蛋白——血紅蛋白等的主要組分。近年來(lái)，我國(guó)科學(xué)工作者從天然產(chǎn)物中分離到許多具有重要生理功能的蛋白質(zhì)，特別是從葫蘆科植物如栝樓、苦瓜子和王瓜中分離到許多活性蛋白。其中天花粉蛋白的結(jié)構(gòu)鑒定與生理活性研究是我國(guó)科學(xué)工作者通力協(xié)作所取得的重大成果。本章即從它的分離、提純、結(jié)構(gòu)測(cè)定等的實(shí)際方法來(lái)了解如何從天然產(chǎn)物中分離生物活性蛋白質(zhì)，這是很具代表性的工作；同時(shí)也了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)定方法的最新進(jìn)展。第二十五頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日本節(jié)以天花粉蛋白為實(shí)例，對(duì)天然產(chǎn)物中蛋白質(zhì)的提取、分離、純化、純度鑒定、結(jié)構(gòu)測(cè)定和結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系作系統(tǒng)的論述。天花粉蛋白是從中草藥栝樓的根中提取的。栝樓根又稱天花粉，其中的蛋白質(zhì)是我國(guó)獨(dú)創(chuàng)的計(jì)劃生育和治療宮外孕、葡萄胎、惡性葡萄胎、死胎、植入性胎盤等的良藥。1989年，美國(guó)又發(fā)現(xiàn)天花粉蛋白能抑制HIV的復(fù)制和繁殖，用于治療艾滋病。業(yè)已證明天花粉蛋白也是一個(gè)單鏈核糖體失活蛋白屬RNAN一糖苷酶型。它能專一性水解28SrRNA第4324位腺苷酸的N-C糖苷鍵，釋放出一個(gè)腺嘌呤堿基，使核糖體失活，這類蛋白質(zhì)廣泛存在于天然產(chǎn)物中。第二十六頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日一、分離純化

一般蛋白質(zhì)的分離純化可以按溶解度不同進(jìn)行初步的分離，如用無(wú)機(jī)鹽[最常用(NH4)2S04]或有機(jī)溶劑(如丙酮、乙醇等)沉淀；按分子大小的不同進(jìn)行分離，如各種類型的分子篩(Sephadex葡聚糖凝膠、Bio-gd生物凝膠)、SDS(十二烷基硫酸鈉)凝膠電泳，各種不同孔徑的透析袋或超濾膜；按電荷性質(zhì)不同進(jìn)行分離純化，如各種類型的離子交換樹(shù)脂和等電聚焦等方法；根據(jù)生物活性的不同，如親和層析；也可以用結(jié)晶方法；高效液相色譜等方法進(jìn)一步純化。第二十七頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日1、丙酮分級(jí)沉淀(精制天花粉蛋白)采集10Kg新鮮天花粉塊根，去皮，搗碎，榨汁，過(guò)濾，得2000mL原汁。將上清液冷卻到5℃以下，用2mol/L鹽酸調(diào)pH到4左右，即有沉淀析出。然后在5℃以下再慢慢加入1600mL(用原汁體積的0．8倍)冰冷的丙酮，有沉淀析出。用冷凍離心機(jī)離心20min(0-5℃，1500r/min),除去沉淀。上清液A在5℃以下再加入800mL冰冷的丙酮，有沉淀析出，在同樣條件下離心，得沉淀和上清液B。所得沉淀用l00mL蒸餾水溶解，對(duì)流水透析36～48h，離心，棄去沉淀，清液C冷凍干燥，得10-15g干粉即為精制天花粉蛋白，得率為0.1％-0.15％。上清液B內(nèi)含有熱原性糖蛋白、游離氨基酸和多糖等，從中還可以回收丙酮(如圖11-7)。第二十八頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日第二十九頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日2、結(jié)晶天花粉蛋白的制備

1g精制天花粉蛋白溶于10mL蒸餾水，離心，除去不溶物質(zhì)。上清液裝人透析袋在冰箱中用pH=8.6巴比妥緩沖液透析。一星期內(nèi)有長(zhǎng)方片狀結(jié)晶生長(zhǎng)，得300mg左右結(jié)晶天花粉蛋白。第三十頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日3、層析方法（1）葡聚糖凝膠（Sephadex）層析：從天花粉壓汁后的殘?jiān)杏蒙睇}水提取和硫酸銨沉淀法得到栝樓蛋白的粗提物，再經(jīng)SephadexG-75分離得到兩個(gè)峰。第二個(gè)峰（主峰）含有栝樓蛋白。如圖11-8。第三十一頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日（2）羧甲基葡聚糖凝膠法:這種凝膠把羧甲基(-O-CH2-COONa+)陽(yáng)離子交換基團(tuán)接到葡聚糖上使這種凝膠既具有離子交換作用，又具有分子篩作用，分離效果較好。例如，丙酮沉淀天花粉蛋白用羥甲基葡聚糖凝膠分離后主要可得4個(gè)峰，如圖11-9。第三十二頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日二、純度的鑒定1、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳法(簡(jiǎn)稱SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法)鑒定分子大小按常法用SDS凝膠電泳法鑒定天花粉蛋白。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)經(jīng)SDS處理后，帶有負(fù)電荷，在電泳中向正極移動(dòng)，其電泳遷移率只與相對(duì)分子質(zhì)量大小有關(guān)，借此可以鑒定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量與均一性。電泳用0.1mol/L,pH=7.2磷酸鹽緩沖液系統(tǒng)，凝膠濃度為10％丙烯酰胺，用考馬斯亮藍(lán)R250染色，其結(jié)果如圖11-10結(jié)晶天花粉蛋白只出現(xiàn)一條色帶，顯示其分子是均一的。另外，用分子篩如葡聚糖凝膠分離結(jié)晶天花粉蛋白也只顯一峰，也證明其分子大小是均一的。

第三十三頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日第三十四頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日2、從電荷性質(zhì)方面鑒定

采用pH=4.3氫氧化鉀-乙酸系統(tǒng)，聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳(丙烯酰胺的濃度為15％)所得結(jié)果見(jiàn)圖11-11。結(jié)晶天花粉蛋白只有一條色帶，粗制天花粉蛋白由十幾條色帶。粗制天花粉蛋白經(jīng)羧甲基葡聚糖凝膠分離后，其峰1、2、3、4和5在此系統(tǒng)中電泳位置不同(圖11-12)，說(shuō)明這些蛋白質(zhì)等電點(diǎn)不同。第三十五頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日第三十六頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日第三十七頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日3、免疫血清法鑒定

一般特異性蛋白質(zhì)都有抗原性，注射到各種動(dòng)物(如羊、兔等)體內(nèi)，能在這些動(dòng)物血清中產(chǎn)生專一性的抗體。天花粉蛋白也有強(qiáng)抗原性，如把粗制天花粉蛋白多次注射到兔或羊等動(dòng)物體內(nèi)，1～2個(gè)月后它們的血清中會(huì)含天花粉蛋白抗體，取這種免疫血清做免疫電泳。用離子強(qiáng)度為0.05、pH=8.8的巴比妥緩沖液配成0．3％瓊脂糖溶液，鋪于3cm×7.5cm的玻片上，在凝膠板上兩邊挖兩個(gè)小孔，分別加粗制天花粉蛋白和結(jié)晶天花粉蛋白溶液，在pH=8.8巴比妥緩沖液中電泳后，在中間開(kāi)一條窄槽，加粗制天花粉蛋白免疫血清，在密閉缸中任其擴(kuò)散?？贵w與抗原結(jié)合產(chǎn)生白色沉淀形成一條弧線，然后徹底洗去粗制天花粉蛋白免疫血清，用氨基黑10B染色，其結(jié)果見(jiàn)圖11-13。粗制天花粉蛋白顯示有五六條弧線，結(jié)晶天花粉蛋白只有一弧線，證明天花粉蛋白在免疫特性上也是均一的。第三十八頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日第三十九頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日4、N末端氨基酸的鑒定按常法用二甲氨基萘磺酰氯(dansylchloride)和4-N，N-二甲胺基偶氮苯-4′-異硫氰酸酯(4-N,N-dimethylaminoazobenzene-4'-isothiocyanate，DABITC)分別測(cè)定天花粉蛋白的N末端，結(jié)果都證明為單一的天冬氨酸(圖11-14)。第四十頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日第四十一頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日5、C末端氨基酸的檢定按常法用羧肽酶、肼解、乙內(nèi)酰硫脲等法測(cè)定天花粉蛋白的C末端，不能得到肯定的結(jié)論。肼解法結(jié)果，出現(xiàn)甲硫氨酸、丙氨酸、甘氨酸等，都有可能是C末端氨基酸；乙內(nèi)酰硫脲法出現(xiàn)丙氨酸和甲硫氨酸；羧肽酶A顯示丙氨酸和甲硫氨酸兩個(gè)C末端氨基酸的可能。最后根據(jù)計(jì)算機(jī)輔助的羧肽酶法測(cè)定C末端是不均一的，有兩個(gè)：一是甲硫氨酸；二是丙氨酸。這類末端微觀不均一性的情況在植物性蛋白并不是獨(dú)有的。第四十二頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日6、氨基酸測(cè)定每一種均一性蛋白質(zhì)應(yīng)該有恒定的氨基酸組成，按常法將不同批號(hào)的結(jié)晶天花粉蛋白用5.7mol／L鹽酸在封管中105℃水解24h，減壓濃縮除去鹽酸后，經(jīng)氨基酸分析儀分析其氨基酸組成恒定。7、結(jié)晶用結(jié)晶的方法來(lái)純化蛋白質(zhì)，也是一種重要手段。天花粉蛋白在巴比妥緩沖液中得單斜晶系晶體，而在檸檬酸緩沖液中(pH=5．4)可獲得正交晶系單晶。第四十三頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日8、生物活性每一種均一性蛋白質(zhì)應(yīng)該有一定的生物活性(當(dāng)然要在不變性失活情況下)，結(jié)晶天花粉蛋白的生物活性ED50為0.31mg／kg。9、毛細(xì)管電泳

如用毛細(xì)管電泳可以證明天花粉蛋白與栝樓蛋白不同。把天花粉蛋白和栝樓蛋白混合后做毛細(xì)管電泳得到明顯的兩個(gè)峰。如圖11-15。10、高效液相色譜(HPLC)

栝樓蛋白用HPLC檢定得到很好的一個(gè)峰，如圖11-16。第四十四頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日11、質(zhì)譜20世紀(jì)80年代末90年代初，由于質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，一種被稱為電噴霧電離質(zhì)譜(electrosprayionizati0MS，ESI—MS)；另一種被稱為基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrixassistedlaserdesorptionionization-timeofflight-MS，MALDI-TOF-MS)，解決了極性大、熱不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)、多肽離子化和相對(duì)分子量測(cè)定問(wèn)題，只要蛋白質(zhì)在相對(duì)分子質(zhì)量方面不均一用質(zhì)譜方法立即能夠檢出，如天花粉蛋白C端不均勻，一個(gè)為Met，另一個(gè)為Ala。用質(zhì)譜方法檢出兩個(gè)峰，其他方法都無(wú)法檢出，因此質(zhì)譜已成為蛋白質(zhì)純度檢定和生物大分子結(jié)構(gòu)測(cè)定的一種非常有效的方法，如圖11-17。發(fā)明這兩種質(zhì)譜的科學(xué)家都獲得2002年諾爾化學(xué)獎(jiǎng)。第四十五頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日第四十六頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日三、蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)

蛋白質(zhì)可以是簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)，其結(jié)構(gòu)全部由氨基酸組成，如胰島素、血清白蛋白、天花粉蛋白等；也可以是結(jié)合蛋白，除了氨基酸外還有其他輔基如核蛋白結(jié)合核酸；脂蛋白結(jié)合脂類，如磷脂、膽固醇；糖蛋白結(jié)合糖類。蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)除了上述簡(jiǎn)單蛋白外，結(jié)合蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、氨基酸組成、N端、C端等都是非常重要的數(shù)據(jù)。

第四十七頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日四、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定

在用各種方法鑒定蛋白質(zhì)純度是均一后(純度在95％以上)，可以測(cè)定蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定目前已有很多方法，如化學(xué)方法利用Edman降解從N端開(kāi)始逐個(gè)測(cè)定，用基因方法和物理方法如質(zhì)譜、核磁共振等。本節(jié)主要介紹Edman降解法，其基本反應(yīng)是通過(guò)三個(gè)步驟偶聯(lián)、裂解、轉(zhuǎn)化和PTH氨基酸檢定。第四十八頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日1、偶聯(lián)蛋白質(zhì)和多肽的自由a-氨基經(jīng)與異硫氰酸苯酯(PITC)試劑偶聯(lián)后，與其緊挨的第二個(gè)殘基的鍵合力大大減弱，很容易斷裂。反應(yīng)如下：第四十九頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日2、裂解在無(wú)水條件下酸裂解，僅僅切下反應(yīng)的那個(gè)殘基。緊挨的第二個(gè)氨基酸殘基暴露出自由的a一氨基，又可與PITC進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)。第五十頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日3、轉(zhuǎn)化ATZ-氨基酸不穩(wěn)定，在三氟乙酸水溶液(25％)條件下可轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的PTH-氨基酸(圖11-21)。第五十一頁(yè)，共五十八頁(yè)，2022年，8月28日4、PTH-氨基酸的鑒定可以通過(guò)薄層層析、氣相色譜、高效液相色譜及質(zhì)譜等各種手段進(jìn)行分析。近年來(lái)，由于高效液相色譜技術(shù)具有分析速度快、靈敏度高、定性定量準(zhǔn)確等諸多優(yōu)點(diǎn)，并且儀器自身結(jié)構(gòu)也日臻完善，被廣泛應(yīng)用于PTH-氨基酸的鑒定。通常選用C-18反相柱進(jìn)行分離。蛋白質(zhì)化學(xué)方法的順序測(cè)定現(xiàn)在一般都用儀器，可以詳見(jiàn)夏其昌主編的《蛋白質(zhì)化學(xué)研究技術(shù)與進(jìn)展)一書(shū)(1997年，北京，科學(xué)出版社)。在沒(méi)有順序儀的實(shí)驗(yàn)室也可以用手工DABITC／PITC雙偶合法測(cè)定，該法具有簡(jiǎn)便有效快速等優(yōu)點(diǎn)。