第七原核基因的表達與調控演示文稿

第七原核基因的表達與調控演示文稿第一頁，共六十九頁。（優(yōu)選）第七原核基因的表達與調控第二頁，共六十九頁。隨著生物個體的發(fā)育，DNA分子能有序地將其所承載的遺傳信息，通過密碼子-反密碼子系統(tǒng)轉變成蛋白質，執(zhí)行各種生理生化功能?？茖W家把從DNA到蛋白質的過程稱為基因表達（geneexpression），對這個過程的調節(jié)就稱為基因表達調控（generegulation或genecontrol）。第三頁，共六十九頁。原核生物與真核生物基因表達調控機制具有驚人的相似性共同的起源與共同的分子基礎調控機理上調控層次上核酸分子間的互作核酸與蛋白質分子間的互作蛋白質分子間的互作transcriptionallevelpost—transcriptionalleveltranslationallevelpost—translationallevel第四頁，共六十九頁。轉錄水平上的調控是最為經濟,

靈活，又是最為重要，復雜的調控●在復雜的基因組內，確定需要基因轉錄的起始位點●精細調節(jié)基因表達的水平,以保證生物體對環(huán)境的適應●cisfactor&transfactor間嚴格而又靈活的互作●保證RNApolymerase的進行式轉錄（不中斷，準確終止）第五頁，共六十九頁。圖6-1基因表達的第一步是由RNA聚合酶拷貝DNA雙鏈中的模板鏈，生成與該序列完全互補的RNA鏈。第六頁，共六十九頁。基因表達調控主要表現在以下二方面：轉錄水平上的調控（transcriptionalregulation）；轉錄后水平上的調控（post-transcriptionalregulation），包括（1）mRNA加工成熟水平調控（differentialprocessingofRNAtranscrpt）；（2）翻譯水平調控（differentialtranslationofmRNA）。第七頁，共六十九頁。第八頁，共六十九頁?；靖拍睿翰倏v子：指原核生物中由一個或多個相關基因以及轉錄翻譯調控元件組成的基因表達單元。（如：乳糖操縱子，包括啟動子操縱基因和結構基因三部分，調控的最小單位）順式作用元件：調節(jié)下游基因的表達，如啟動子，增強子等，位于染色體上的一段DNA序列反式作用因子：可溶性蛋白，可作用于不同染色體上的順式作用元件，如阻遏蛋白等第九頁，共六十九頁。誘導物：也稱效應物，指小分子物質，誘導反應進行的物質，如乳糖。誘導和阻遏：誘導即有利于反應的順利進行；阻遏即阻止反應的進行。正調控和負調控：正調控即促進反應的進行；負調控即不利于反應的順利進行組成型基因和誘導型基因第十頁，共六十九頁。

原核生物的基因調控主要是轉錄調控，包括負轉錄調控和正轉錄調控。負轉錄調控：調節(jié)基因的產物是阻遏蛋白（repressor）阻遏蛋白作用于操縱區(qū)。負控誘導：阻遏蛋白不與誘導物結合時，結構基因不轉錄負控阻遏：阻遏蛋白與效應物結合時，結構基因不轉錄。正轉錄調控：調節(jié)基因的產物是激活蛋白（activator）正控誘導：誘導物的存在使激活蛋白處于活性狀態(tài)正控阻遏：誘導物分子的存在使激活蛋白處于非活性狀態(tài)第十一頁，共六十九頁。OperoncontrolmodelnegativepositiveInd.Rep.activeactiveinactiveinactive第十二頁，共六十九頁。6.2乳糖操縱子與負控誘導系統(tǒng)

大腸桿菌乳糖操縱子（lactoseoperon）包括3個結構基因：Z、Y和A，以及啟動子、控制子和阻遏子等。轉錄的調控是在啟動區(qū)和操縱區(qū)進行的。LacoperonIpoZYA第十三頁，共六十九頁。第十四頁，共六十九頁。3個結構基因各決定一種酶：Z編碼-半乳糖苷酶；Y編碼-半乳糖苷透過酶；A編碼-半乳糖苷乙酰基轉移酶。第十五頁，共六十九頁。β-半乳糖苷酶是一種β-半乳糖苷鍵的專一性酶，除能將乳糖水解成葡萄糖和半乳糖外，還能水解其他β-半乳糖苷（如苯基半乳糖苷）。β-半乳糖苷透過酶的作用是使外界的β-半乳糖苷透過大腸桿菌細胞壁和原生質膜進入細胞內。β-半乳糖苷乙酰基轉移酶的作用是把乙酰輔酶A上的乙?；D移到-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。第十六頁，共六十九頁。6.2.1酶的誘導—lac體系受調控的證據 一般情況下，lac+基因型大腸桿菌細胞內β-半乳糖苷酶和透過酶的濃度很低，每個細胞只有1～2個酶分子。但是，在乳糖培養(yǎng)基上酶的濃度很快達到細胞總蛋白量的6%或7%，超過105個酶分子/細胞。第十七頁，共六十九頁。

在無葡萄糖有乳糖的培養(yǎng)基中，lac+細菌中將同時合成β-半乳糖苷酶和透過酶。

用32P標記的mRNA與模板DNA進行定量分子雜交，表明培養(yǎng)基中加入乳糖1～2分鐘后，編碼β-半乳糖苷酶和透過酶的lacmRNA量就迅速增加，去掉乳糖后，lacmRNA量立即下降。第十八頁，共六十九頁。第十九頁，共六十九頁。

實驗室常用兩種乳糖類似物—異丙基巰基半乳糖苷（IPTG）和巰甲基半乳糖苷（TMG），在酶活性分析中常用發(fā)色底物O-硝基半乳糖苷（ONPG）。因為它們都不是半乳糖苷酶的底物，所以又稱為安慰性誘導物（gratuitousinducer）。第二十頁，共六十九頁。第二十一頁，共六十九頁。用35S標記大腸桿菌細胞（培養(yǎng)基中沒有半乳糖），將這些帶有放射性的細菌轉移到不含35S的培養(yǎng)基中，加入誘導物后β-半乳糖苷酶便開始合成。分離純化β-半乳糖苷酶，發(fā)現這種酶無35S標記，說明這種酶是加入誘導物后新合成的。第二十二頁，共六十九頁。6.2.2操縱子模型及其影響因子

Jacob和Monod認為誘導酶（他們當時稱為適應酶）現象是個基因調控問題，而且可以用實驗方法進行研究，他們通過大量實驗及分析，建立了現在已經被人們廣泛接受的乳糖操縱子的控制模型。第二十三頁，共六十九頁。圖6-9Lac操縱子的調控模式。第二十四頁，共六十九頁。A.Z、Y、A基因產物由同一條多順反子mRNA分子所編碼。B.該mRNA分子的啟動區(qū)（P）位于阻遏基因（I） 與操縱區(qū)（O）之間，不能單獨起始半乳糖苷酶 和透過酶基因的高效表達。C.操縱區(qū)是DNA上的一小段序列（僅為26bp），是阻遏物的結合位點。D.當阻遏物與操縱區(qū)相結合時，lacmRNA的轉錄起始受到抑制。E.誘導物通過與阻遏物結合，改變其三維構象，使 之不能與操縱區(qū)相結合，誘發(fā)lacmRNA的合成。第二十五頁，共六十九頁。阻遏物lacI基因產物及功能lac操縱子阻遏物mRNA是由弱啟動子控制下永久型合成的，該阻遏蛋白有4個相同的亞基，每個亞基均含有347個氨基酸殘基，并能與1分子IPTG結合,每個細胞中有5～10個阻遏物分子。第二十六頁，共六十九頁。

β-半乳糖苷酶在乳糖代謝中的作用是把前者分解成葡萄糖及半乳糖。如果將葡萄糖和乳糖同時加入培養(yǎng)基中，大腸桿菌在耗盡外源葡萄糖之前不會誘發(fā)lac操縱子（圖6-11）。第二十七頁，共六十九頁。第二十八頁，共六十九頁。6.2.3lac操縱子的調控區(qū)域—P、O區(qū)

P區(qū)（即啟動子區(qū)）一般是從I基因結束到mRNA轉錄起始位點下游5-10bp，而O區(qū)（即阻遏物結合區(qū)）位于-7～+28位，該區(qū)的堿基序列有對稱性，其對稱軸在+11位堿基對。第二十九頁，共六十九頁。圖6-16不同操縱子啟動區(qū)及O區(qū)相對位置的比較。第三十頁，共六十九頁。6.2.4lac操縱子中的其他問題

1、lac基因產物數量上的比較

在完全被誘導的細胞中，β-半乳糖苷酶、透過酶及乙?；D移酶的拷貝數比例為1：0.5：0.2，這個比例在一定程度上反映了以β-半乳糖苷作為唯一碳源時細胞的需要。不同的酶在數量上的差異是由于在翻譯水平上受到調節(jié)所致。第三十一頁，共六十九頁。①lacmRNA可能與翻譯過程中的核糖體相脫離，從而終止蛋白質鏈的翻譯。因此，存在著從mRNA的5'末端到3'末端的蛋白質合成梯度。第三十二頁，共六十九頁。②在lacmRNA分子內部，A基因比Z基因更易受內切酶作用發(fā)生降解，因此，在任何時候Z基因的完整拷貝數要比A基因多。第三十三頁，共六十九頁。2、操縱子的融合與基因工程

pur操縱子在染色體上位于lac操縱子沿轉錄方向的下游，中間只隔了一個控制細胞對T6噬菌體敏感性的tsx基因。pur操縱子被“嫁接”到lac啟動子上，形成融合基因。因為lac啟動子是一個很強的啟動子，通過它可以使較弱啟動子的轉錄增強。第三十四頁，共六十九頁。6.3色氨酸操縱子與負控阻遏系統(tǒng)trp體系參與生物合成，它不受葡萄糖或cAMP-CRP的調控。色氨酸的合成主要分5步完成，有7個基因參與整個合成過程（圖6-17）。第三十五頁，共六十九頁。圖6-17細菌中色氨酸生物合成途徑。第三十六頁，共六十九頁。第三十七頁，共六十九頁。6.3.1trp操縱子的阻遏系統(tǒng)trpR基因突變常引起trpmRNA的永久型合成，該基因產物因此被稱為輔阻遏蛋白（aporepressor）。除非培養(yǎng)基中有色氨酸，否則這個輔阻遏蛋白不會與操縱區(qū)結合。輔阻遏蛋白與色氨酸相結合形成有活性的阻遏物，與操縱區(qū)結合并關閉trpmRNA轉錄。第三十八頁，共六十九頁。

效應物分子色氨酸是trp操縱子所編碼的生物合成途徑的末端終產物。 當培養(yǎng)基中色氨酸含量較高時，它與游離的輔阻遏蛋白相結合，并使之與操縱區(qū)DNA緊密結合；當培養(yǎng)基中色氨酸供應不足時，輔阻遏物失去色氨酸并從操縱區(qū)上解離，trp操縱子去阻遏。第三十九頁，共六十九頁。第四十頁，共六十九頁。6.3.2弱化子與前導肽1、弱化子

在trpmRNA5’端有一個長162bp的mRNA片段被稱為前導區(qū)，其中123～150位堿基序列如果缺失，trp基因表達可提高6-10倍。mRNA合成起始以后，除非培養(yǎng)基中完全沒有色氨酸，轉錄總是在這個區(qū)域終止，產生一個僅有140個核苷酸的RNA分子，終止trp基因轉錄。這個區(qū)域被稱為弱化子，該區(qū)mRNA可通過自我配對形成莖-環(huán)結構。第四十一頁，共六十九頁。第四十二頁，共六十九頁。2、前導肽分析前導序列發(fā)現，它包括起始密碼子AUG和終止密碼子UGA，能產生一個含有14個氨基酸的多肽，這個假設的多肽被稱為前導肽。在前導序列的第10和第11位上有相鄰的兩個色氨酸密碼子。組氨酸操縱子含有7個相鄰的組氨酸密碼子，苯丙氨酸操縱子也有7個苯丙氨酸密碼子，這些密碼子參與了操縱子中的轉錄弱化機制。第四十三頁，共六十九頁。3、mRNA前導區(qū)的序列分析

trp前導區(qū)的堿基序列已經全部測定，引人注目的是其中4個分別以1、2、3和4表示的片段能以兩種不同的方式進行堿基配對，有時以1-2和3-4配對，有時只以2-3方式互補配對。第四十四頁，共六十九頁。第四十五頁，共六十九頁。

RNaseT1降解實驗（此酶不能水解配對的RNA）表明，純化的trp前導序列中確有1-2和3-4的配對方式，由此定位的3-4配對區(qū)正好位于終止密碼子的識別區(qū)，當這個區(qū)域發(fā)生破壞自我配對的堿基突變時有利于轉錄的繼續(xù)進行（圖6-23）。第四十六頁，共六十九頁。第四十七頁，共六十九頁。4、轉錄弱化作用

培養(yǎng)基中色氨酸濃度低，負載有色氨酸的tRNATrp就少，翻譯通過兩個相鄰色氨酸密碼子的速度就慢，當4區(qū)被轉錄完成時，核糖體才進行到1區(qū)（或停留在兩個相鄰的trp密碼子處），前導區(qū)2-3配對，不形成3-4配對的終止結構，轉錄繼續(xù)進行。第四十八頁，共六十九頁。

培養(yǎng)基中色氨酸濃度高，核糖體順利通過兩個相鄰的色氨酸密碼子，在4區(qū)被轉錄之前就到達2區(qū)，3-4區(qū)自由配對形成莖-環(huán)狀終止子結構，轉錄停止。所以，弱化子對RNA聚合酶的影響依賴于前導肽翻譯中核糖體所處的位置。第四十九頁，共六十九頁。圖6-24trp操縱子前導序列的變構與轉錄的弱化。第五十頁，共六十九頁。

一般認為，阻遏物從有活性向無活性的轉變速度較慢，需要有一個能更快地做出反應的系統(tǒng)，以保持培養(yǎng)基中適當的色氨酸水平。弱化子能較快地通過抗終止的方法來增加trp基因表達，迅速提高內源色氨酸濃度。第五十一頁，共六十九頁。那么，為什么還要有阻遏體系呢？阻遏物的作用是在有大量外源色氨酸存在時，阻止非必需的先導mRNA的合成，它使這個合成系統(tǒng)更加經濟。第五十二頁，共六十九頁。6.4轉錄后調控6.4.1翻譯起始的調控

遺傳信息的翻譯起始于mRNA上的核糖體結合位點（RBS）----起始密子AUG上游的一段非翻譯區(qū)。在RBS中有SD序列，與核糖體16SrRNA的3’端互補配對，促使核糖體與mRNA相結合。

RBS的結合強度取決于SD序列的結構及與AUG之間的距離。SD與AUG之間相距一般以4～10核苷酸為佳，9核苷酸最佳。第五十三頁，共六十九頁。圖7-2真核基因表達調控的主要步驟示意圖第五十四頁，共六十九頁。7.1.1基因家族（genefamily）

真核細胞中許多相關的基因常按功能成套組合，被稱為基因家族。 同一家族中的成員有時緊密地排列在一起，成為一個基因簇，也可能分散在同一染色體的不同部位，甚至位于不同的染色體上，具有各自不同的表達調控模式。第五十五頁，共六十九頁。1、簡單多基因家族簡單多基因家族中的基因一般以串聯方式前后相連。細菌中所有rRNA和部分tRNA都來自這個分子量為30S（約6500個核苷酸）的前rRNA。

在真核生物中，前rRNA轉錄產物的分子量為45S，（約有14000個核苷酸），包括18S，28S和5.8S三個主要rRNA分子。第五十六頁，共六十九頁。2、復雜多基因家族復雜多基因家族一般由幾個相關基因家族構成，基因家族之間由間隔序列隔開，并作為獨立的轉錄單位。海膽組蛋白基因家族（圖7-4）：編碼不同組蛋白的基因處于一個約為6000bp的片段中，分別被間隔序列所隔開。這5個基因組成的串聯單位在整個海膽基因組中可能重復多達1000次。第五十七頁，共六十九頁。7.1.2真核基因的斷裂結構1、外顯子與內含子

“intron”是指存在于原始轉錄物或基因組DNA中，但不存在于成熟mRNA、rRNA或tRNA中的那部分核苷酸序列。大多數真核基因都是由蛋白質編碼序列和非蛋白質編碼序列兩部分組成的。第五十八頁，共六十九頁。7.1.3真核生物DNA水平上的基因表達調控DNA水平的調控是真核生物發(fā)育調控的一種形式，包括基因丟失、擴增、重排和移位等。第五十九頁，共六十九頁。7.3反式作用因子第六十頁，共六十九頁。轉錄因子的結構轉錄因子定義：指具有同真核啟動子特定DNA序列結合活性的蛋白質分子，或者是指具有已知DNA結合域結構特征的蛋白質分子，其主要功能是激活或抑制基因的轉錄反應。轉錄因子可被分為兩大類：通用轉錄因子和特異轉錄因子。通用轉錄因子是所有基因轉錄都需要的，特異轉錄因子是那些能提高或降低基因轉錄速率的蛋白質，它們?yōu)檎婧思毎峁┝朔浅＞_的轉錄調控。轉錄因子的結構：轉錄激活域DNA結合域N1281C88147222圖：酵母轉錄因子GCN4結構域第六十一頁，共六十九頁。轉錄因子由四個功能區(qū)域組成：DNA結合域（DNA-bindingdomain）轉錄激活域(transcriptionalactivationdomain)核定位信號區(qū)(nuclear