第七節(jié)高效毛細管電泳演示文稿

第七節(jié)高效毛細管電泳演示文稿2023/2/14第一頁，共三十八頁。2023/2/14優(yōu)選第七節(jié)高效毛細管電泳第二頁，共三十八頁。1.1、經(jīng)典電泳分析traditionalelectrophoresis

利用電泳現(xiàn)象對某些化學或生物物質(zhì)進行分離分析的方法和技術叫電泳法或電泳技術。按形狀分類：U型管電泳、柱狀電泳、板電泳；按載體分類：濾紙電泳、瓊脂電泳、聚丙烯酰胺電泳、自由電泳；傳統(tǒng)電泳分析：操作煩瑣，分離效率低，定量困難，無法與其他分析相比。1981年，Jorgenson和Luckas，用75μm內(nèi)徑石英毛細管進行電泳分析，柱效高達40萬/m，促進電泳技術發(fā)生了根本變革，迅速發(fā)展成為可與GC、HPLC相媲美的嶄新的分離分析技術——高效毛細管電泳。第三頁，共三十八頁。1.2、高效毛細管電泳分析

highperformancecapillaryelectrophoresis高效毛細管電泳在技術上采取了兩項重要改進：一是采用了0.05mm內(nèi)徑的毛細管；二是采用了高達數(shù)千伏的電壓。毛細管的采用使產(chǎn)生的熱量能夠較快散發(fā)，大大減小了溫度效應，使電場電壓可以很高。電壓升高，電場推動力大，又可進一步使柱徑變小，柱長增加，高效毛細管電泳的柱效遠高于高效液相色譜，理論塔板數(shù)高達幾十萬塊/米，特殊柱子可以達到數(shù)百萬。第四頁，共三十八頁。分離過程

電場作用下，毛細管柱中出現(xiàn)：電泳現(xiàn)象和電滲流現(xiàn)象。

帶電粒子的遷移速度=電泳+電滲流；兩種速度的矢量和。

正離子：兩種效應的運動方向一致，在負極最先流出；

中性粒子無電泳現(xiàn)象，受電滲流影響，在陽離子后流出；

陰離子：兩種效應的運動方向相反。ν電滲流>ν電泳時,陰離子在負極最后流出,在這種情況下,一則可以按類分離,除中性粒子外,同種類離子由于受到的電場力大小不一樣也同時被相互分離。第五頁，共三十八頁。高效毛細管電泳的特點1.儀器簡單、易自動化電源、毛細管、檢測器、溶液瓶2.分析速度快、分離效率高

在3.1min內(nèi)分離36種無機及有機陰離子，4.1min內(nèi)分離了24種陽離子；分離柱效：105～107/m理論塔板數(shù)；3.操作方便、消耗少

進樣量極少，水介質(zhì)中進行；4.應用范圍極廣有機物、無機物、生物、中性分子；生物大分子等；分子生物學、醫(yī)學、藥學、化學、環(huán)境保護、材料等；

第六頁，共三十八頁。二、高效毛細管電泳理論基礎

2.1、高效毛細管電泳(HPCE)基本原理

電泳是指帶電離子在電場中的定向移動，不同離子具有不同的遷移速度，遷移速度與哪些因素有關？當帶電離子以速度ν

在電場中移動時，受到大小相等、方向相反的電場推動力和平動摩擦阻力的作用。電場力：FE=qE

阻力：F=fν故：qE=fνq—離子所帶的有效電荷；E—電場強度；ν—離子在電場中的遷移速度；f—平動摩擦系數(shù)(對于球形離子：f=6πηγ；γ—離子的表觀液態(tài)動力學半徑；η—介質(zhì)的粘度；)第七頁，共三十八頁。所以，遷移速度：（球形離子）

物質(zhì)離子在電場中差速遷移是電泳分離的基礎。淌度μ

：單位電場強度下的平均電泳速度。

第八頁，共三十八頁。2.2、電滲現(xiàn)象與電滲流electroosmosisandelectroosmoticflow1.電滲流現(xiàn)象

當固體與液體接觸時，固體表面由于某種原因帶一種電荷，則因靜電引力使其周圍液體帶有相反電荷，在液-固界面形成雙電層，二者之間存在電位差。

當液體兩端施加電壓時，就會發(fā)生液體相對于固體表面的移動，這種液體相對于固體表面的移動的現(xiàn)象叫電滲現(xiàn)象。電滲現(xiàn)象中整體移動著的液體叫電滲流（electroosmoticflow，簡稱EOF）。

第九頁，共三十八頁。2.HPCE中的電滲現(xiàn)象與電滲流

石英毛細管柱，內(nèi)充液pH>3時，表面電離成-SiO-,管內(nèi)壁帶負電荷，形成雙電層。

在高電場的作用下，帶正電荷的溶液表面及擴散層向陰極移動，由于這些陽離子實際上是溶劑化的，故將引起柱中的溶液整體向負極移動，速度ν電滲流。第十頁，共三十八頁。3.HPCE中電滲流的大小與方向電滲流的大小用電滲流速度ν電滲流表示，取決于電滲淌度μ和電場強度E。即

ν電滲流=μE電滲淌度取決于電泳介質(zhì)及雙電層的Zeta電勢，即

μ=ε0εξε0—真空介電常數(shù)；ε—介電常數(shù)；ξ—毛細管壁的Zeta電勢。

ν電滲流=ε0εξ

E實際電泳分析，可在實驗測定相應參數(shù)后，按下式計算

ν電滲流=Lef/teoLef—毛細管有效長度；teo—電滲流標記物（中性物質(zhì)）的遷移時間。第十一頁，共三十八頁。HPCE中電滲流的方向

電滲流的方向取決于毛細管內(nèi)表面電荷的性質(zhì)：內(nèi)表面帶負電荷，溶液帶正電荷，電滲流流向陰極；內(nèi)表面帶正電荷，溶液帶負電荷，電滲流流向陽極；石英毛細管；帶負電荷，電滲流流向陰極；改變電滲流方向的方法：（1）毛細管改性表面鍵合陽離子基團；（2）加電滲流反轉(zhuǎn)劑內(nèi)充液中加入大量的陽離子表面活性劑，將使石英毛細管壁帶正電荷，溶液表面帶負電荷。電滲流流向陽極。第十二頁，共三十八頁。4.HPCE中電滲流的流形電荷均勻分布，整體移動，電滲流的流動為平流，塞式流動（譜帶展寬很?。灰合嗌V中的溶液流動為層流，拋物線流型，管壁處流速為零，管中心處的速度為平均速度的2倍（引起譜帶展寬較大）。第十三頁，共三十八頁。5.HPCE中電滲流的作用

電滲流的速度約等于一般離子電泳速度的5～7倍；

各種電性離子在毛細管柱中的遷移速度為：

ν+=ν電滲流+ν+ef陽離子運動方向與電滲流一致；

ν-=ν電滲流-ν-ef陰離子運動方向與電滲流相反；

ν0=ν電滲流中性粒子運動方向與電滲流一致；（1）可一次完成陽離子、陰離子、中性粒子的分離；（2）改變電滲流的大小和方向可改變分離效率和選擇性，如同改變LC中的流速；（3）電滲流的微小變化影響結(jié)果的重現(xiàn)性；在HPCE中，控制電滲流非常重要。第十四頁，共三十八頁。2.3、HPCE中影響電滲流的因素

factorsinfluencedelectroosmosis1.電場強度的影響

電滲流速度和電場強度成正比，當毛細管長度一定時，電滲流速度正比于工作電壓。2.毛細管材料的影響

不同材料毛細管的表面電荷特性不同，產(chǎn)生的電滲流大小不同；第十五頁，共三十八頁。3.電解質(zhì)溶液性質(zhì)的影響（1）溶液pH的影響

對于石英毛細管，溶液pH增高時，表面電離多，電荷密度增加，管壁zeta電勢增大，電滲流增大，pH=7，達到最大；pH<3，完全被氫離子中和，表面電中性，電滲流為零。分析時，采用緩沖溶液來保持pH穩(wěn)定。（2）陰離子的影響在其他條件相同，濃度相同而陰離子不同時，毛細管中的電流有較大差別，產(chǎn)生的焦耳熱不同。緩沖溶液離子強度，影響雙電層的厚度、溶液黏度和工作電流，明顯影響電滲流大小。緩沖溶液離子強度增加，電滲流下降。第十六頁，共三十八頁。第十七頁，共三十八頁。4.溫度的影響

毛細管內(nèi)溫度的升高，使溶液的黏度下降，電滲流增大。溫度變化來自于“焦耳熱”；

焦耳熱：毛細管溶液中有電流通過時，產(chǎn)生的熱量；

HPCE中的焦耳熱與背景電解質(zhì)的摩爾電導、濃度及電場強度成正比。溫度每變化1，將引起背景電解質(zhì)溶液黏度變化2%～3%；第十八頁，共三十八頁。5.添加劑的影響（1）加入濃度較大的中性鹽，如K2SO4，溶液離子強度增大，使溶液的黏度增大，電滲流減小。（2）加入表面活性劑，可改變電滲流的大小和方向；加入不同陽離子表面活性劑來控制電滲流。加入陰離子表面活性劑，如十二烷基硫酸鈉（SDS），可以使壁表面負電荷增加，zeta電勢增大，電滲流增大；（3）加入有機溶劑如甲醇、乙腈，使電滲流增大。第十九頁，共三十八頁。2.4、淌度mobility

淌度：帶電離子在單位電場下的遷移速度；

淌度不同是電泳分離的基礎。1.絕對淌度(absolutemobility)μab無限稀釋溶液中帶電離子在單位電場強度下的平均遷移速度，簡稱淌度?？稍谑謨灾胁殚?。2.有效淌度(effectivemobility)μef

實際溶液中的淌度(實驗中測定的)。μef=∑aiμi

ai—溶質(zhì)i的解離度；μi—溶質(zhì)i在解離狀態(tài)下的絕對淌度3.表觀淌度

μap離子在實際分離過程中的遷移速度（表觀遷移速度）：

νap=μapE第二十頁，共三十八頁。2.5、影響分離效率的因素—區(qū)帶展寬

factorsinfluencedtheefficiency—bandbroadening

1.縱向擴散的影響

在HPCE中，縱向擴散引起的峰展寬：σ2=2Dt由擴散系數(shù)和遷移時間決定。大分子的擴散系數(shù)小，可獲得更高的分離效率，大分子生物試樣分離的依據(jù)。2.進樣的影響

當進樣塞長度太大時，引起的峰展寬大于縱向擴散。分離效率明顯下降；理想情況下，進樣塞長度：

Winj=(24Dt)1/2實際操作時進樣塞長度小于或等于毛細管總長度的1%～2%。第二十一頁，共三十八頁。3.焦耳熱與溫度梯度的影響

電泳過程產(chǎn)生的焦耳熱可由下式計算：m—電解質(zhì)溶液的摩爾電導；I—工作電流：cm—電解質(zhì)濃度；

散熱過程中，在毛細管內(nèi)形成溫度梯度（中心溫度高），破壞了塞流，導致區(qū)帶展寬。改善方法：（1）減小毛細管內(nèi)徑；（2）控制散熱；第二十二頁，共三十八頁。4.溶質(zhì)與管壁間的相互作用

存在吸附與疏水作用，造成譜帶展寬；蛋白質(zhì)、多肽帶電荷數(shù)多，有較多的疏水基，吸附問題特別嚴重，是目前分離分析該類物質(zhì)的一大難題。細內(nèi)徑毛細管柱，一方面有利于散熱，另一方面比表面積大，又增加了溶質(zhì)吸附的機會。減小吸附的方法和途徑：加入兩性離子代替強電解質(zhì)，兩性離子一端帶正電，另一端帶負電，帶正電一端與管壁負電中心作用，濃度約為溶質(zhì)的100-1000倍時，抑制對蛋白質(zhì)吸附，又不增加溶液電導，對電滲流影響不大。第二十三頁，共三十八頁。5.其他影響因素

（1）電分散作用對譜帶展寬的影響當溶質(zhì)區(qū)帶與緩沖溶液區(qū)帶的電導不同時，也造成譜帶展寬；盡量選擇與試樣淌度相匹配的背景電解質(zhì)溶液。（2）“層流”現(xiàn)象對譜帶展寬的影響一般情況下，HPCE中不存在層流，但當毛細管兩端存在壓力差時，出現(xiàn)拋物線形的層流；產(chǎn)生的原因：毛細管兩端液面高度不同。實際操作時，保持毛細管兩端緩沖溶液平面高度相同。第二十四頁，共三十八頁。三、高效毛細管電泳儀

highperformancecapillaryelectrophoresisapparatus第二十五頁，共三十八頁。儀器2第二十六頁，共三十八頁。儀器3第二十七頁，共三十八頁。3.1、儀器流程與主要部件

processandmainassembly

電壓：0～30kV；分離柱不涂敷任何固定液；紫外或激光誘導熒光檢測器；（可檢測到：10-19～10-21

mol/L）第二十八頁，共三十八頁。1.高壓電源（1）0～30

kV穩(wěn)定、連續(xù)可調(diào)的直流電源；（2）具有恒壓、恒流、恒功率輸出；（3）電場強度程序控制系統(tǒng)；（4）電壓穩(wěn)定性：0.1%；（5）電源極性易轉(zhuǎn)換；2.毛細管柱

（1）材料：石英：各項性能好；玻璃：光學、機械性能差；（2）規(guī)格：內(nèi)徑20～75μm，外徑350～400μm；長度<=1m第二十九頁，共三十八頁。3.緩沖液池

化學惰性，機械穩(wěn)定性好；4.檢測器要求：具有極高靈敏度，可柱端檢測；檢測器、數(shù)據(jù)采集與計算機數(shù)據(jù)處理一體化；

類型檢測限/mol特點紫外-可見10-13～10-15加二極管陣列，光譜信息熒光10-15～10-17靈敏度高，樣品需衍生激光誘導熒光10-18～10-20靈敏度極高，樣品需衍生電導10-18～10-19離子靈敏，需專用的裝置；第三十頁，共三十八頁。3.2、毛細管電泳的進樣方式

injectionmethodof

HPCE

進樣量：毛細管長度的1%-2%；納升級、非常?。?.流體力學進樣方式

（1）進樣端加壓（2）出口端抽真空（3）虹吸進樣第三十一頁，共三十八頁。

毛細管一端插入樣品瓶，加電壓；2.電動進樣方式

進樣不均：電歧視現(xiàn)象，淌度大的離子比淌度小的進樣量大；離子丟失：淌度大且與電滲流方向相反的離子可能進不去；

特別適合黏度大的試樣；3.擴散進樣試樣通過擴散作用進入分離柱端口處。第三十二頁，共三十八頁。四、高效毛細管電泳分離模式八種分離類型，介紹常用的幾種；根據(jù)試樣性質(zhì)不同，采用不同的分離類型；每種機理的選擇性不同；第三十三頁，共三十八頁。4.1、毛細管區(qū)帶電泳capillaryzoneelectrophoresis，CZE

帶電粒子的遷移速度=電泳和電滲流速度的矢量和。正離子：兩種效應的運動方向一致，在負極最先流出；中性粒子：無電泳現(xiàn)象，受電滲流影響，在陽離子后流出；

陰離子：兩種效應的運動方向相反；ν電滲流>ν電泳時,陰離子在負極最后流出,在這種情況下,不但可以按類分離,同種類離子由于差速遷移被相互分離。

最基本、應用廣的分離模式；第三十四頁，共三十八頁。4.2、毛細管凝膠電泳capillarygelelectrophoresis，CGE

將聚丙烯酰胺等在毛細管柱內(nèi)交聯(lián)生成凝膠。其具有多孔性，類似分子篩的作用，試樣分子按大小分離。能夠有效減小組分擴散，所得峰型尖銳，分離效率高。蛋白質(zhì)、DNA等的電荷