上皮細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物在角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)特征,細(xì)胞生物學(xué)論文

上皮細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物在角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)特征,細(xì)胞生物學(xué)論文角質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞是鱗狀上皮細(xì)胞的主要組成成分，具有廣泛的生物學(xué)特性。常見的鱗狀上皮細(xì)胞有皮膚和口腔黏膜上皮細(xì)胞，當(dāng)其出現(xiàn)大面積損傷時(shí)創(chuàng)口本身不能正常愈合，只能通過組織移植來(lái)補(bǔ)償缺損的組織面。皮膚或口腔黏膜是容易接觸一些藥物或材料刺激的組織，因而討論皮膚或口腔黏膜組織對(duì)于臨床藥物和材料的反響是重要的研究課題。體外細(xì)胞檢測(cè)模型一般來(lái)自患者的原代培養(yǎng)細(xì)胞或來(lái)自腫瘤、遺傳物質(zhì)突變的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，但原代細(xì)胞培養(yǎng)獲得的細(xì)胞有限，傳代后組織特異性也逐步喪失，且組織來(lái)源不同的原代細(xì)胞培養(yǎng)所得出的測(cè)定數(shù)據(jù)差異較大，不是毒理學(xué)研究的理想細(xì)胞；轉(zhuǎn)化細(xì)胞容易獲得并易于維持，穩(wěn)定性高，可重復(fù)性好，但其具有腫瘤細(xì)胞的特性，例如生長(zhǎng)失去控制、接觸抑制喪失、細(xì)胞外形改變、核型異常等[1],也不是毒理學(xué)研究的理想模型，因而，急需建立新的外源性化合物安全性的評(píng)價(jià)模型。人胚胎干細(xì)胞〔hu-manembryonicstemcells,hESCs〕是健康和永生的單一胚胎細(xì)胞來(lái)源的人類樣本，既可真實(shí)反映人類生物學(xué)特征[2],又可通過單一胚胎細(xì)胞無(wú)限增殖和定向分化到達(dá)樣本高度標(biāo)準(zhǔn)化[3],可能成為預(yù)測(cè)受試物細(xì)胞毒性和遺傳毒性的體外替代實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚4],為體外安全性評(píng)價(jià)提供了新的希望。將hESCs誘導(dǎo)分化為角質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞當(dāng)前暫無(wú)標(biāo)準(zhǔn)化方式方法，研究發(fā)現(xiàn)通過構(gòu)成擬胚體〔embryonicbody,EB〕的方式方法獲得的角質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞增殖能力過低，不利于組織發(fā)育[5];2008年，Metallo等[6]用直接誘導(dǎo)法將hESCs誘導(dǎo)分化為上皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，并比擬了EB法和直接誘導(dǎo)法誘導(dǎo)hESCs5周后獲得的細(xì)胞角蛋白〔cytokeratin,CK〕14的陽(yáng)性表示出率〔15%vs.87%〕,發(fā)現(xiàn)直接誘導(dǎo)法具有顯著的優(yōu)勢(shì)。人永生化口腔上皮細(xì)胞系〔humanimmortalizedoralepithelialcells,HIOECs〕是用人乳頭瘤狀病毒E6、E7開放讀碼框架轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的正?？谇簧掀ぜ?xì)胞后建立的[7],HIOECs具有與口腔黏膜上皮細(xì)胞類似的形態(tài)和生化特性，所建模型可被用于評(píng)價(jià)藥物在口腔吸收機(jī)制的研究[8].人永生化皮膚角質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞HaCaT是由成人皮膚轉(zhuǎn)染猴空泡病毒40〔simianvirus,SV40〕后發(fā)生自分化的未成瘤的永生化皮膚角質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞系[9].本課題組前期實(shí)驗(yàn)亦通過直接誘導(dǎo)法將hESCs誘導(dǎo)分化為上皮樣細(xì)胞[10],但尚不清楚所得到的上皮樣細(xì)胞能否仍保持正常的染色體核型，其進(jìn)一步分化是趨向于發(fā)展為皮膚上皮還是口腔黏膜上皮，以及能否作為將來(lái)毒理學(xué)的檢測(cè)模型。本研究對(duì)得到的上皮樣細(xì)胞進(jìn)行了染色體核型的分析，在基因水平上討論了由hESCs誘導(dǎo)K-hESCs經(jīng)過中多能性標(biāo)志物及上皮相關(guān)標(biāo)志物的表示出變化；并以人原代牙齦上皮細(xì)胞〔humangingivalepithelialcells,HGECs〕、HIOECs和HaCaT作為對(duì)照細(xì)胞，通過實(shí)時(shí)定量熒光PCR方式方法檢測(cè)了其誘導(dǎo)末期人胚胎干細(xì)胞源角質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞〔keratinocytederivedfromhu-manembryonicstemcells,K-hESCs〕與對(duì)照細(xì)胞上皮相關(guān)標(biāo)志物基因表示出的差異性；在蛋白水平上，通過免疫組織化學(xué)方式方法討論了多種上皮細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物在K-hESCs和對(duì)照細(xì)胞中的表示出差異。1材料與方式方法1.1材料研究所用明膠、Matrigel購(gòu)自美國(guó)BD公司，胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)基〔mTeSR1〕購(gòu)自美國(guó)StemCell公司，中性蛋白酶購(gòu)自德國(guó)Roche公司，CK、波形蛋白〔vimentin,VIM〕抗體購(gòu)自美國(guó)SantaCruz公司，細(xì)胞培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)皿購(gòu)自美國(guó)Corning公司，通用型二步法檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)GBI公司，TritonX-100購(gòu)自美國(guó)Amresco公司，Gimsa染液購(gòu)自北京Solarbio公司；其他研究所用材料全部購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。1.2細(xì)胞培養(yǎng)1.2.1hESCs的培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞系H9〔H9-hESCs〕由新加坡國(guó)立大學(xué)提供，將其培養(yǎng)于Matri-gel上，培養(yǎng)液為胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)基，天天換液，細(xì)胞接近匯合時(shí)用1g/L的中性蛋白酶，37℃消化5min,機(jī)械刮除，800r/min離心5min,1∶6傳代。1.2.2HGECs的原代培養(yǎng)選擇擬行阻生牙鏟除術(shù)、無(wú)口腔黏膜疾病且冠周齦組織無(wú)炎癥表現(xiàn)的患者，術(shù)前征得患者同意，術(shù)中收集鏟除牙齒上附帶的牙齦組織，采用組織塊法在無(wú)血清上皮培養(yǎng)基〔de-finedkeratinocyteserum-freemediumandsupplement,D-KSFM〕中培養(yǎng)獲得HGECs.本研究獲得北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)〔批準(zhǔn)號(hào)：PKUSSIRB-202010055〕.1.2.3HIOECs及HaCaT培養(yǎng)分別使用D-KSFM和含10%〔體積分?jǐn)?shù)〕血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)HIOECs與HaCaT,傳代時(shí)均用胰酶37℃分別消化5min和1min,用含血清培養(yǎng)基中和，前者600r/min離心10min,后者1000r/min離心5min,1∶3傳代。1.3誘導(dǎo)hESCs分化為K-hESCs.H9-hESCs常規(guī)傳代后第2天，將hESCs完全培養(yǎng)基換成上皮分化誘導(dǎo)液〔體積分?jǐn)?shù)98%的DMEM/F12培養(yǎng)基，含有1N2補(bǔ)充成分、1mol/L維甲酸、25g/L骨構(gòu)成蛋白4〕,天天換液，連續(xù)誘導(dǎo)7天，第7天傳代。傳代時(shí)用1g/L的中性蛋白酶，37℃消化5min,機(jī)械刮除，D-KSFM重懸，200g離心4min,D-KSFM重懸輕吹勻，1∶3傳代至明膠鋪被的板子上，晃勻，隔天換液。P1代第10天時(shí)K-hESCs用胰酶37℃消化1min,含血清培養(yǎng)基中和，200g離心4min,D-KSFM重懸輕吹勻，1∶1傳代至明膠鋪被的板子上，晃勻，隔天換液。1.4Real-timePCR檢測(cè)方式方法。Trizol法提取細(xì)胞總RNA,取2LRNA檢測(cè)純度和濃度，20L體系逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,以GAPDH為內(nèi)參，PCR引物序列見表1,20L體系在7500實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)儀〔美國(guó)ABI公司〕上行定量PCR檢測(cè)。1.5免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)將細(xì)胞均勻接種在無(wú)菌的載玻片上，待貼壁生長(zhǎng)至適宜密度后，95%〔體積分?jǐn)?shù)〕乙醇固定30min,PBS沖洗，0.1%〔體積分?jǐn)?shù)〕Triton-X100室溫處理15min,PBS沖洗；10%〔質(zhì)量分?jǐn)?shù)〕H2O2室溫處理10min,PBS沖洗；滴加一抗，4℃過夜。第2天滴加二抗試劑，室溫孵育30min,PBS沖洗；DAB室溫顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。SOX2[SRY-relatedhigh-mobility-group〔HMG〕-boxprotein-2]、OCT4〔octamer-bindingtranscriptionfactor-4〕、CK1、P63以核內(nèi)有著色顆粒為陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)，余以細(xì)胞漿內(nèi)有著色顆粒為陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)。采用半定量分析斷定陽(yáng)性表示出強(qiáng)度，無(wú)著色顆?；蜿?yáng)性細(xì)胞數(shù)少于5%為陰性〔-〕,著色且著色總面積在5%~10%為弱陽(yáng)性〔+〕,著色總面積在11%-50%為中等陽(yáng)性〔++〕,著色總面積大于50%者為強(qiáng)陽(yáng)性〔+++〕.1.6二倍體檢測(cè)生長(zhǎng)狀態(tài)良好的K-hESCs,參加0.012mg/L秋水仙素培養(yǎng)8h,收集細(xì)胞，參加預(yù)溫至37℃的0.075mmol/LKCl溶液5mL,置37℃15min,用3∶1甲醇冰醋酸固定3次，滴到預(yù)冷的載玻片上，70℃3h烤片。Gimsa染色10min,水洗，顯微鏡下觀察染色體并進(jìn)行核型分析。1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析利用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用多組間比擬的單因素方差分析、成組設(shè)計(jì)多個(gè)樣本比擬的秩和檢驗(yàn)〔Kruskal-Wallis法〕及完全隨機(jī)設(shè)計(jì)兩獨(dú)立樣本的秩和檢驗(yàn)分析方式方法，P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)和鑒定2.1.1細(xì)胞形態(tài)原代培養(yǎng)的HGECs呈鋪路石樣嚴(yán)密排列的上皮樣細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞大小一致，形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞核清楚明晰〔圖1A〕;HIOECs為分散生長(zhǎng)的多角形上皮樣細(xì)胞，細(xì)胞大小較一致，生長(zhǎng)較慢〔圖1B〕;HaCaT細(xì)胞呈克隆狀聚集生長(zhǎng)，細(xì)胞為多角形，長(zhǎng)滿后也為鋪路石樣，生長(zhǎng)較快〔圖1C〕.未分化的H9-hESCs在Matrigel上細(xì)胞成團(tuán)克隆狀生長(zhǎng)，飽滿厚實(shí)，排列嚴(yán)密，形似鳥巢，細(xì)胞之間界線不清，胞體體積小，核大，有1個(gè)或幾個(gè)核仁，細(xì)胞增殖并保持未分化狀態(tài)〔圖1D〕.用上皮分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)得到的P1代細(xì)胞以組織塊貼壁細(xì)胞為中心呈現(xiàn)克隆狀生長(zhǎng)，細(xì)胞呈鋪路石狀，排列嚴(yán)密；以小圓形、多角形為主的上皮樣細(xì)胞，克隆的細(xì)胞較小且排列較嚴(yán)密，克隆周圍的細(xì)胞較大且大小較一致，細(xì)胞核清楚明晰〔圖1E〕,類似于HGECs,我們將其稱為人胚胎干細(xì)胞源角質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞K-hESCs.從P1代第8天開場(chǎng)，克隆周圍的細(xì)胞開場(chǎng)收縮卷邊，細(xì)胞變大、變長(zhǎng)且細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡和顆粒，細(xì)胞間連接變稀疏，到第15天左右大多數(shù)細(xì)胞凋亡。P2代細(xì)胞貼壁量較少，分散生長(zhǎng)，細(xì)胞增殖速度變慢，細(xì)胞形態(tài)改變，表現(xiàn)為胞體變大、核模糊、出現(xiàn)空泡、死亡脫落〔圖1F〕.2.1.2細(xì)胞鑒定細(xì)胞免疫化學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，原代培養(yǎng)的HGECs,CK表示出陽(yáng)性〔圖2A〕,VIM表示出陰性〔圖2B〕;H9-hESCs的SOX2及OCT4表示出陽(yáng)性〔圖2C和2D〕.9種上皮相關(guān)標(biāo)志物在hESCs、K-hESCs〔P0代及P1代〕和HaCaT中的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果見表2和圖3.2.2Real-timePCR結(jié)果在H9-hESCs誘導(dǎo)為K-hESCs的經(jīng)過中，胚胎干細(xì)胞多能性標(biāo)志物OCT4和NANOG基因的表示出直線下降，角質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞干性標(biāo)志物CK18和p63基因的表示出整體呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，而CK14基因的表示出在P0代略微下降，在P1代呈不斷上升趨勢(shì)。H9-hESCs與P1代第7天時(shí)的K-hESCs相比，OCT4、NANOG、CK18、p63、CK14的表示出差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔配對(duì)t檢驗(yàn)，P分別為0.016、0.023、0.011、0.030、0.013,圖4〕.比擬角質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞標(biāo)志物p63、CK18、CK14在K-hESCs〔P1代第7天時(shí)〕、HGECs、HIOECs及HaCaT中的基因表示出差異。由圖5可見，與K-hESCs相比，基因p63在HGECs和HIOECs中的表示出差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔P=0.245、P=0.439〕,但基因p63在HaCaT中的表示出遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于K-hESCs〔P=0.036〕;CK18在K-hESCs中表示出最高，但與HGECs、HIOECs、HaCaT相比，差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔F=0.575,P=0.640〕;CK14在HGECs中表示出最高，與K-hESCs相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔P0.001,且其在HIOECs和HaCaT中的表示出與K-hESCs相比差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔P=0.001、P0.001〕.2.3二倍體檢測(cè)K-hESCs染色體核型為正常女性〔46,XX〕,無(wú)構(gòu)造異?！矆D6〕.3討論2006年誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞〔inducedpluripotentstemcells,iPS〕的出現(xiàn)被以為有宏大的潛在應(yīng)用價(jià)值，在建立體外病理模型方面有一定的方便性，但與胚胎干細(xì)胞相比，iPS要多經(jīng)歷分離、純化、擴(kuò)增、誘導(dǎo)去分化、挑選、建庫(kù)、擴(kuò)增等步驟才能誘導(dǎo)定向分化，這一體外經(jīng)過復(fù)雜而漫長(zhǎng)，細(xì)胞傳代數(shù)過高對(duì)細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性、表觀遺傳特性和生物學(xué)特性都構(gòu)成了極大的不穩(wěn)定，iPS細(xì)胞即被證明帶有本身的表觀遺傳印記和端粒異常，有數(shù)百個(gè)基因存在異常表示出[11-13].本文旨在建立健康安全評(píng)價(jià)檢測(cè)模型，對(duì)細(xì)胞本身的正常性要求較高，因而，以為胚胎干細(xì)胞較iPS更具優(yōu)勢(shì)。上皮細(xì)胞主要包括上皮干細(xì)胞及其子代短暫擴(kuò)大細(xì)胞、終末分化細(xì)胞。華而不實(shí)干細(xì)胞存在于上皮基底層，有無(wú)限的增殖潛能，正常情況下處于靜止?fàn)顟B(tài)；短暫擴(kuò)大細(xì)胞具有低的自我更新能力和高的終末分化可能性，短暫擴(kuò)大細(xì)胞僅分裂增殖3~5次即到終末分化狀態(tài)。處于不同分化階段的細(xì)胞具有不同的表型。1整合素〔integrin-1〕的表示出是維持角質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞未分化狀態(tài)所需要的，1整合素能夠區(qū)分角質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞干細(xì)胞和短暫擴(kuò)大細(xì)胞。Michel等[14]對(duì)CK19和1整合素進(jìn)行研究后提出，細(xì)胞經(jīng)染色后，若CK19和1整合素同時(shí)呈陽(yáng)性且具有未完全分化狀態(tài)特征的干細(xì)胞，則可視為角質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞的祖細(xì)胞。P63主要與上皮細(xì)胞的分化和增殖有關(guān)，之前被以為是干細(xì)胞標(biāo)志物，但近期的研究表示清楚，P63在體內(nèi)不僅表示出于基底層而且還表示出于基底上層，即表示出于正在增殖的和有增殖能力的細(xì)胞[15],因而推斷P63更應(yīng)該是短暫擴(kuò)大細(xì)胞而非干細(xì)胞標(biāo)志物[16-18].CK18在細(xì)胞進(jìn)入分化和復(fù)層前，持續(xù)地在單層細(xì)胞中表示出，有些細(xì)胞CK18的表示出下調(diào)被CK14取代[19].CK14早期表示出時(shí)可作為復(fù)層細(xì)胞的基底細(xì)胞標(biāo)志物表示出于單層細(xì)胞上[19].CK10通常表示出于角化復(fù)層鱗狀上皮的基底上層，即終末分化時(shí)將要角化的細(xì)胞，為角化標(biāo)志，其表示出與上皮細(xì)胞角化狀態(tài)密切相關(guān)。低相對(duì)分子質(zhì)量CK〔AE1〕對(duì)腺上皮表示出敏感性較高，高相對(duì)分子質(zhì)量CK〔AE3〕對(duì)鱗狀上皮表示出敏感性較高。本研究誘導(dǎo)hESCs分化而成的K-hESCs呈現(xiàn)正常的46條女性染色體核型。Real-timePCR檢測(cè)結(jié)果表示清楚，在基因水平上，單層上皮干細(xì)胞標(biāo)志物CK18、短暫擴(kuò)大細(xì)胞標(biāo)志物p63的表示出呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，復(fù)層上皮基底層標(biāo)志物CK14呈現(xiàn)先略微降低后上升的趨勢(shì)，提示K-hESCs經(jīng)歷了由hESCs向單層上皮干細(xì)胞分化繼而轉(zhuǎn)向復(fù)層上皮終末分化發(fā)展的趨勢(shì)。免疫組織化學(xué)染色顯示，K-hESCs在分化經(jīng)過中，CK18、P63表示出先上升后下降，CK14表示出增加，與基因水平一致；除此之外，單層細(xì)胞表皮干細(xì)胞標(biāo)志物CK19、1整合素的表示出增高，間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物〔上皮干細(xì)胞標(biāo)志物〕波形蛋白〔VIM〕及角化標(biāo)志物CK1、CK10的表示出增高，能夠推斷P1代第7天時(shí)K-hESCs正處于角化細(xì)胞祖細(xì)胞階段，其鱗狀上皮標(biāo)志物AE3的免疫組織化學(xué)表示出高于腺上皮的標(biāo)志物AE1的表示出，提示所得角化細(xì)胞祖細(xì)胞更偏向于鱗狀上皮細(xì)胞的祖細(xì)胞。Real-timePCR檢測(cè)結(jié)果顯示，P1代第7天時(shí)K-hESCs上皮干細(xì)胞標(biāo)志物CK18的基因表示出與HGECs、HIOECs、HaCaT相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔P0.05〕,而復(fù)層上皮細(xì)胞基底層標(biāo)志物CK14的表示出顯著低于HGECs、HIOECs、HaCaT〔P0.01〕,提示P1代第7天時(shí)K-hESCs處于未完全成熟階段。P1代第7天時(shí)K-hESCs的p63表示出與HGECs及HIOECs差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔P0.05〕,而與HaCaT有明顯差異〔P0.01〕,提示P1代第7天時(shí)K-hESCs可能更偏向于將來(lái)分化為口腔黏膜上皮。綜上，本研究可在體外有效誘導(dǎo)hESCs分化為上皮樣角質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞K-hESCs,誘導(dǎo)所得P1代第7天時(shí)的K-hESCs具有正常核型，類似于單層鱗狀上皮干細(xì)胞向終末分化初始階段的角質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞，該階段細(xì)胞由上皮干細(xì)胞靜止?fàn)顟B(tài)被激活，處于分化初始高增殖活力階段，有望作為口腔臨床藥物的毒理檢測(cè)模型。以下為參考文獻(xiàn)[1]RolletschekA,BlyszczukP,WobusAM.Embryonicstemcell-derivedcardiac,neuronalandpancreaticcellsasmodelsystemstostudytoxicologicaleffects[J].ToxicolLett,2004,149〔1-3〕:361-369.[2]AmitM,CarpenterMK,InokumaMS,etal.Clonallyderivedhu-manembryonicstemcelllinesmaintainpluripotencyandprolifera-tivepotentialforprolongedperiodsofculture