第二章基因工程制藥演示文稿

第二章基因工程制藥演示文稿第一頁，共四十五頁。優(yōu)選第二章基因工程制藥第二頁，共四十五頁。1、基因表達是指結構基因在生物體中的轉錄、翻譯以及所有加工過程。2、宿主細胞的分類：①原核細胞，常用的有大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌等；②真核細胞，常用的有酵母、絲狀真菌、哺乳動物細胞。知識回顧第三頁，共四十五頁。3、提高外源基因在E.coli表達效率：（1）外源基因的劑量（2）外源基因的表達效率（3）表達產物的穩(wěn)定性（4）細胞的代謝負荷（5）工程菌的培養(yǎng)條件知識回顧第四頁，共四十五頁。4、真核基因在大腸桿菌中的表達形式:⑴以融合蛋白的形式表達藥物基因⑵以非融合蛋白的形式表達藥物基因⑶分泌型表達藥物基因

知識回顧第五頁，共四十五頁。5、質粒的不穩(wěn)定性分裂不穩(wěn)定：指工程菌分裂時出現一定比例不含質粒子代菌的現象。結構不穩(wěn)定：指外源基因從質粒上丟失或堿基重排、缺失所致工程菌性能的改變。第六頁，共四十五頁。6、提高質粒穩(wěn)定性的方法選擇合適的宿主菌選擇合適的載體選擇壓力分階段控制培養(yǎng)控制培養(yǎng)條件固定化第七頁，共四十五頁。第六節(jié)基因工程藥物的分離純化

基因工程藥物或生物技術產品特點:(1)目的產物在初始原料中的含量較低;(2)含目的產物的初始物料組成復雜,除了目的產物外,還有大量的細胞、代謝、殘留培養(yǎng)基、無機鹽等，特別是產物類似物對目的產物的分離純化影響很大；第八頁，共四十五頁。(3)目的產物的穩(wěn)定性差，具有生物活性的物質對pH、溫度、金屬離子、有機溶劑、剪切力、表面張力等十分敏感，容易是其失活、變性；

種類繁多，包括大、中、小分子、結構簡單或復雜的有機化合物，以及結構復雜又性質各異的生物活性物質；

應用面廣，對其質量、純度要求高，甚至要求無菌、無熱源。第九頁，共四十五頁。一、建立分離純化工藝的根據1、含目的產物的起始物料的特點利用基因工程菌進行發(fā)酵生產的產物，其上游過程中的各種因素均對分離純化技術和工藝有直接影響。第十頁，共四十五頁。一、建立分離純化工藝的根據（1）菌種類型及其代謝特性：（2）原材料和培養(yǎng)基的來源及其質量；（3）生產工藝和條件：（4）初始物料的物理、化學和生物學特性：第十一頁，共四十五頁。一、建立分離純化工藝的根據2、物料中雜質的種類和性質物料中雜質的含量、性質、結構、相對分子質量、電荷性質及數量、生物學特性、穩(wěn)定性、溶解度、分配系數、揮發(fā)性、吸附性能等。第十二頁，共四十五頁。一、建立分離純化工藝的根據3、目的產物特性產物的化學、物理和生物學特性，包括化學組成、相對分子質量、等電點、電荷分布及密度、溶解度、穩(wěn)定性、疏水性、擴散性、擴散系數、分配系數、吸附性能、生物學活性、親和性、配基種類、表面活性等。第十三頁，共四十五頁。一、建立分離純化工藝的根據4、產品質量的要求產品質量標準和用途對產品純度、生物活性、比活的要求。包括允許的雜質種類和最大允許含量，特殊雜質的種類和最大允許量，以及雜質對使用的影響，產品劑型、貯存穩(wěn)定性等。第十四頁，共四十五頁。二、分離純化的基本過程

由于基因工程藥物是從轉化細胞、而不是從正常細胞生產的，所以對產品的純度要求也要高于傳統(tǒng)產品。基因工程藥物的分離純化一般不應超過4-5個步驟，包括細胞破碎、固液分離、濃縮與初步純化、高度純化直至得到純品以及成品加工。第十五頁，共四十五頁。

基因工程藥物分離純化的一般流程發(fā)酵液細胞分離胞內產物胞外產物細胞破碎固液分離包含體細胞碎片分離變性復性濃縮初步分離高度純化制劑產品第十六頁，共四十五頁。三、分離純化的技術1）技術條件要溫和，能保持目的產物的生物活性；

2）選擇性要好，能從復雜的混合物中有效的地將目的產物分離出來，達到較高純化倍數；

3）收率要高；

4）兩個技術之間要能直接銜接，不需要對物料加以處理或調整，這樣可減少工藝步驟；

5）整個分離純化過程要快，能夠滿足高生產率的要求。第十七頁，共四十五頁。3-1、細胞破碎與固液分離

（1）細胞收集：離心和膜過濾（2）細胞破碎：機械法高壓勻漿、超聲波、高速珠磨、高壓擠壓等。非機械法酶溶、化學滲透、熱處理、滲透壓沖擊法。（3）固液分離：分離細胞碎片是比較困難。一般用離心和膜過濾。第十八頁，共四十五頁。3-2、目的產物的分離純化

分離純化目的產物主要依賴于色譜分離技術。色譜技術分為：

IonexchangechromatographyHydrophobicinteractionchromatographyAffinitychromatographyGelFiltrationchromatography第十九頁，共四十五頁。

表1產物的主要特性及在分離純化中的作用產物特性作用

等電點決定離子交換的種類及條件

相對分子質量選擇不同孔徑及分級分離范圍的介質

疏水性與疏水、反相介質結合的程度

特殊反應性產物的氧化、還原及部分催化性能的抑制

聚合性是否采用預防聚合、解聚及分離去除聚合體生物特異性決定親和配基溶解性決定分離體系及蛋白濃度穩(wěn)定性決定工藝采用的溫度及流程時間微不均一性影響產物的回收第二十頁，共四十五頁。

表2基因工程藥物生產中常用的分離純化方法

方法目的

離心/過濾去除細胞、細胞碎片、顆粒性雜質陰離子交換層析去除雜志蛋白、脂質、DNA、病毒

40nm微孔濾膜過濾進一步去除病毒陽離子交換層析去除牛血清蛋白或轉鐵蛋白等超濾去除沉淀物及病毒疏水層析去除殘余的雜蛋白凝膠過濾與多聚體分離

0.22μm微孔濾膜過濾除菌第二十一頁，共四十五頁。1）具有良好的穩(wěn)定性和重復性；

2）盡可能減少組成工藝的步驟；

3）組成工藝的各技術或步驟之間要能相互適應和協(xié)調，工藝和設備相適應。

4）在工藝過程中盡可能少用試劑，以免增加分離純化步驟，或干擾產品質量；

3-3、分離純化工藝應遵循的原則第二十二頁，共四十五頁。5）分離純化工藝所用的時間盡可能短，尤其是對穩(wěn)定性差的產物；

6）工藝和技術必須高效，收率高，易操作，對設備條件要求低，能耗低；

7）具有較高的安全性。3-3、分離純化工藝應遵循的原則第二十三頁，共四十五頁。第七節(jié)基因工程藥物的質量控制一、原材料的質量控制

確保編碼藥品的DNA序列的正確性，重組微生物來自單一克隆，所用質粒純而穩(wěn)定，以保證產品質量的安全性和一致性。第二十四頁，共四十五頁。一、原材料的質量控制（1）明確目的基因的來源、克隆經過，并以限制性內切酶圖譜和核苷酸序列等予以確證；（2）提供表達載體的名稱、結構、遺傳特性及其各組成部分（如啟動子、復制子）的來源與功能，構建中所用位點的酶切圖譜，抗生素抗性標志物；第二十五頁，共四十五頁。（3）提供宿主細胞的名稱、來源、傳代歷史、檢定結果及其生物學特性；（4）闡明載體引入宿主細胞的方法及載體在宿主細胞內的狀態(tài)，如是否整合到染色體內及在其中的拷貝數，并證明宿主細胞與載體結合后的遺傳穩(wěn)定性；一、原材料的質量控制第二十六頁，共四十五頁。（5）提供插入基因與表達載體兩側端控制區(qū)的核苷酸序列，詳細敘述在生產過程中，啟動與控制克隆基因在宿主細胞中表達的方法及水平等。一、原材料的質量控制第二十七頁，共四十五頁。在工程菌菌種貯存中，要求種子克隆純而穩(wěn)定；在培養(yǎng)過程中，要求工程菌所含的質粒穩(wěn)定，始終無突變；在重復生產發(fā)酵中，工程菌表達穩(wěn)定；始終能排除外源微生物污染。二、培養(yǎng)過程的質量控制第二十八頁，共四十五頁。（1）生產基因工程產品應有種子批系統(tǒng)，并證明種子批不含致癌因子，無細菌、病毒、真菌和支原體等污染，并由原始種子批建立生產用工作細胞庫；（2）原始種子批須確證克隆基因DNA序列，詳細敘述種子批來源、方式、保存及預計使用期，保存與復蘇時宿主載體表達系統(tǒng)的穩(wěn)定性；二、培養(yǎng)過程的質量控制第二十九頁，共四十五頁。（3）對生產種子，應詳細敘述細胞生長與產品生成的方法和材料，并控制微生物污染；（4）提供培養(yǎng)生產濃度與產量恒定性數據，依據宿主細胞-載體系統(tǒng)穩(wěn)定性，確定最高允許傳種代數；二、培養(yǎng)過程的質量控制第三十頁，共四十五頁。（5）培養(yǎng)過程中，應測定被表達基因分子的完整性及宿主細胞長期培養(yǎng)后的基因型特征；以宿主細胞-載體穩(wěn)定性與產品恒定性，規(guī)定持續(xù)培養(yǎng)時間，并定期評價細胞系統(tǒng)和產品；二、培養(yǎng)過程的質量控制第三十一頁，共四十五頁。（6）培養(yǎng)周期結束時，應檢測宿主宿主細胞載體系統(tǒng)的特性，如質?？截悢?、宿主細胞中表達載體存留程度，含插入基因載體的酶切圖譜等。二、培養(yǎng)過程的質量控制第三十二頁，共四十五頁。三、純化工藝中的質量控制1、產品要有足夠的生理和生物學試驗數據，確證提純物分子批間保持一致性；外源蛋白質、DNA與熱原質都控制在規(guī)定限度以下。

2、在精制過程中能清除宿主細胞蛋白質、核算、糖類、病毒、培養(yǎng)基成分及精制工序本身引入的化學物質，并有檢測方法。第三十三頁，共四十五頁。四、目標產品的質量控制

電泳方法：SDS,等電聚焦，免疫電泳免疫學方法：RIA,RIDELISA,Immunoblotting

受體結合實驗（ReceptorBinding）各種高效液相分析法（HPLC）肽圖分析法

EdmanN末端序列分析法圓二色譜（CD）

NMR1、產品的鑒別表3重組蛋白質藥物產品常用的鑒別方法第三十四頁，共四十五頁。（1）肽圖分析法（2）氨基酸成分分析（3）部分氨基酸序列分析：N-端15個氨基酸（4）重組蛋白質的濃度測定和相對分子質量測定（5）蛋白質二硫鍵分析1、產品的鑒別第三十五頁，共四十五頁。2、純度分析（1）目的蛋白質含量測定（2）雜質：分蛋白類雜質和非蛋白類雜質。3、生物化學測定4、穩(wěn)定性考察5、產品一致性的保證1、產品的鑒別第三十六頁，共四十五頁。

雜質和污染物檢測方法

內毒素鱟試劑、家兔熱源法宿主細胞蛋白免疫分析、SD、CE

其他蛋白雜質（如培養(yǎng)基）SDS、HPLC、CE、免疫分析殘余DNADNA雜交、紫外光譜、蛋白結合蛋白變異肽譜、HPLC、IEF、CE

甲?；琢虬彼犭淖V、HPLC、IEF、CE表4基因工程產物中常見雜質和污染物及其檢測方法第三十七頁，共四十五頁。

甲硫氨酸氧化肽譜、氨基酸分析、HPLC、質譜、Edman分析產物變性或聚合脫氨基SDS、凝膠排阻色譜、

IEF、HPLC、

Edman分析、CE

親和配基脫落SDS、免疫分析氨基酸取代氨基酸分析、肽譜、CE、

Edman分析、質譜微生物（細菌、酵母、真菌）微生物學檢查支原體