第十二章細胞增殖及其調控

細胞增殖(cellproliferation)的意義◆細胞增殖(cellproliferation)是細胞生命活動的重要特征之一,是生物繁育的基礎?！魡渭毎锛毎鲋硨е律飩€體數量的增加。第一頁，共八十二頁?！舳嗉毎镉梢粋€單細胞(受精卵)分裂發(fā)育而來，細胞增殖是多細胞生物繁殖基礎?！舫审w生物仍然需要細胞增殖，主要取代衰老死亡的細胞，維持個體細胞數量的相對平衡和機體的正常功能?！魴C體創(chuàng)傷愈合、組織再生、病理組織修復等，都要

依賴細胞增殖。第二頁，共八十二頁。第一節(jié)

細胞周期概述

●細胞周期●細胞周期的過程●細胞周期同步化一、細胞周期(cellcycle)概述

第三頁，共八十二頁。細胞周期◆概念：從一次細胞分裂結束開始，經過物質積累，直到下一次分裂結束所經歷的過程，分為分裂間期和分裂期。◆細胞周期時相組成◆細胞周期時間◆根據增殖狀況，細胞分類三類第四頁，共八十二頁。細胞周期時相組成◆間期(interphase):G1期(從有絲分裂完成到DNA復制之前的時期)，S期(DNA復制的時期),G2期(從DNA復制完成到有絲分裂開始這段時期)◆M期:有絲分裂期(Mitosis)。細胞沿著G1→S→G2→M→G1周期性運轉，在間期細胞體積增大(生長)，在M期細胞先是核分裂，接著胞質分裂，完成一個細胞周期。第五頁，共八十二頁。間期分裂期第六頁，共八十二頁。細胞周期時間不同細胞的細胞周期時間差異很大·S+G2+M的時間變化較小，細胞周期時間長短主要差別在G1期·有些分裂增殖的細胞缺乏G1、G2期(如動物胚胎細胞分裂)第七頁，共八十二頁。第八頁，共八十二頁。一些真核細胞的細胞周期細胞類型細胞周期早期蛙卵胚胎細胞酵母細胞腸上皮細胞培養(yǎng)的哺乳類成纖維細胞人肝細胞第九頁，共八十二頁。根據增殖狀況，細胞分類三類◆周期中細胞(cyclingcell)保持持續(xù)分裂能力,再進入細胞周期◆終末分化細胞永久失掉了分裂的能力◆靜止期細胞(Go細胞)

暫時脫離細胞周期,不進行增殖,但給予適當刺激后,可以重新進入周期開始分裂。如某些免疫淋巴細胞,肝,腎細胞等。第十頁，共八十二頁。第十一頁，共八十二頁。（二）細胞周期的過程◆G1期◆S期◆G2期◆M期第十二頁，共八十二頁。G1期

從有絲分裂完成到DNA復制前的一段時期,叫合成前期,此期主要合成細胞生長所需要的多種蛋白質、rRNA、碳水化合物、等，在G1的后期，DNA合成酶的活性大大增。同時染色質去凝集。第十三頁，共八十二頁。S期·DNA復制與組蛋白合成同步，使新合成的DNA能及時包裝成核小體?！NA在復制時，不同的序列復制先后不同，具有時間順序：常染色體

先異染色體后能轉錄的DNA先不能轉錄的DNA后GC含量高先AT含量高后

第十四頁，共八十二頁。G2期

DNA復制完成，在G2期主要合成ATP、一定數量的蛋白質和RNA分子，包括微管蛋白和成熟促進因子MPF等，為有絲分裂做準備。第十五頁，共八十二頁。

即細胞分裂期，從染色體的凝縮、分離并平均分配到兩個子細胞為止。真核細胞的細胞分裂主要包括兩種方式，即有絲分裂(mitosis)和減數分裂(meiosis)。遺傳物質和細胞內其他物質分配給子細胞。M期第十六頁，共八十二頁。細胞周期檢驗點(checkpoint)◆細胞周期檢驗點是細胞周期調控的一種機制,主要是確保周期每一時相事件的有序、全部完成并與外界環(huán)境因素相聯系

檢驗點嚴格監(jiān)視著細胞周期事件的發(fā)生、發(fā)展是否嚴格按程序進行，決定細胞能否進入下一時期。如DNA損傷未修復前不能進入S期

第十七頁，共八十二頁。◆細胞周期檢驗點及其作用

G1期檢驗點（靠近G1末期）：酵母——Start；動物細胞——限制點RestrictionPoint：主要監(jiān)測細胞的大小和環(huán)境狀態(tài)，如果條件合適，就會激發(fā)DNA復制，使控制系統(tǒng)向前移動。是細胞周期的主要控制點，決定細胞能否分裂。第十八頁，共八十二頁。G2檢驗點（在G2期結束點）檢測細胞的大小，細胞所處的狀態(tài)，以及細胞內DNA是否復制完畢，如果這些條件合適，就會進入有絲分裂中－后期檢驗點：紡錘體裝配檢驗點（在中期末）監(jiān)測所有的染色體是否都與紡錘體相連，并排列在赤道板上；檢測MPF是否失活，否則不能進行有絲分裂和胞質分裂第十九頁，共八十二頁。Checkpointandtheeventscheckedfor染色體是否與紡錘體相連第二十頁，共八十二頁。（三）細胞周期長短測定◆脈沖標記DNA復制和細胞分裂指數觀察測定法◆流式細胞儀測定法(FlowCytometry)◆縮時攝像技術，可以得到準確的細胞周期時間及分裂間期和分裂期的準確時間。第二十一頁，共八十二頁。細胞周期各階段的時間TG2－G2期時間，TM－M期時間，TS－S期時間，TC－細胞周期時間，TG1＝TC－（TG2＋TM＋

TS）第二十二頁，共八十二頁。G2MG0G1s0200400600

8001000G0G1sG2MDNAAnalysisDNAcontentCount2N4NNormalCellCycle

流式細胞儀測定法(FlowCytometry)第二十三頁，共八十二頁。細胞數量DNA含量流式細胞分選儀測定法第二十四頁，共八十二頁。（四）細胞周期同步化◆自然同步化，如有一種粘菌的變形體plasmodia，某些受精卵早期卵裂

◆人工選擇同步化

◆藥物誘導法第二十五頁，共八十二頁。果蠅受精卵中早期分裂是同步進行的且分裂速度很快,在一個共同的細胞質中,只有細胞核分裂而無相應的細胞分裂第二十六頁，共八十二頁。人工選擇同步化·細胞分裂收獲法：用于單層貼壁生長細胞。優(yōu)點是細胞未經任何藥物處理，細胞同步化效率高。缺點是分離的細胞數量少?！っ芏忍荻入x心法：根據不同時期的細胞在體積和重量上存在差別進行分離。優(yōu)點是方法簡單省時，效率高，缺點是對大多數種類的細胞并不適用。第二十七頁，共八十二頁。第二十八頁，共八十二頁。藥物誘導法·

DNA合成阻斷法：采用DNA合成抑制劑抑制DNA合成。高濃度的胸腺嘧啶能夠阻斷DNA合成所需的核苷酸的合成，即不能合成DNA，細胞不能進入S期，最終將細胞群阻斷于G1/S交界處。一般采用兩次DNA合成抑制劑處理。優(yōu)點是同步化效率高，幾乎適合于所有體外培養(yǎng)的細胞體系。缺點是誘導過程可造成細胞非均衡生長。第二十九頁，共八十二頁。TdR阻斷法進行細胞同步化第三十頁，共八十二頁。分裂中期阻斷法：通過抑制微管聚合來抑制細胞分裂器的形成，將細胞阻斷在細胞分裂中期。優(yōu)點是操作簡便，效率高。缺點是這些藥物的毒性相對較大。常用藥物是秋水仙素。第三十一頁，共八十二頁?！魲l件依賴性突變株在細胞周期同步化中的應用：將與細胞周期調控有關的條件依賴性突變株轉移到限定條件下培養(yǎng)，所有細胞便被同步化在細胞周期中某一特定時期。第三十二頁，共八十二頁。（五）特異的細胞周期特異的細胞周期是指那些特殊的細胞所具有的與標準的細胞周期相比有著鮮明特點的細胞周期。

◆爪蟾早期胚胎細胞的細胞周期◆酵母細胞的細胞周期◆植物細胞的細胞周期◆細菌的細胞周期第三十三頁，共八十二頁。爪蟾早期胚胎細胞的細胞周期·細胞分裂快,G1期、G2期非常短,S期也短(所有復制子都激活),

以至認為僅含有S期和M期，無需臨時合成其它物質，子細胞在G1、G2期并不生長，越分裂體積越小·細胞周期調控因子和調節(jié)機制與一般體細胞標準的細胞周期基本是一致的第三十四頁，共八十二頁。爪蟾早期胚胎細胞的細胞周期第三十五頁，共八十二頁。酵母細胞的細胞周期

酵母細胞的細胞周期與標準的細胞周期在時相和調控方面相似。·酵母細胞周期明顯特點:酵母細胞周期持續(xù)時間較短；封閉式細胞分裂，即細胞分裂時核膜不解聚紡錘體位于細胞核內；在一定環(huán)境下，也進行有性繁殖第三十六頁，共八十二頁。芽殖酵母的細胞周期起始點過后，細胞出芽進入S期紡錘體裝配與S期DNA復制同時進行。第三十七頁，共八十二頁。裂殖酵母的分裂周期第三十八頁，共八十二頁。均等分裂，細胞生長僅是細胞長度的增加起始點有明顯形態(tài)學標志裂殖酵母芽殖酵母第三十九頁，共八十二頁。植物細胞的細胞周期植物細胞的細胞周期與動物細胞的標準細胞周期非常相似，含有G1期、S期、G2期和M期四個時期?！ぶ参锛毎缓行捏w，但在細胞分裂時可以正常組裝紡錘體。·植物細胞以形成中間板的形式進行胞質分裂第四十頁，共八十二頁。植物細胞的細胞周期第四十一頁，共八十二頁。細菌的細胞周期慢生長細菌細胞周期過程與真核細胞周期過程有一定相似之處。其DNA復制之前的準備時間與G1期類似。分裂之前的準備時間與G2期類似。再加上S期和M期，細菌的細胞周期也基本具備四個時期。

第四十二頁，共八十二頁?？焖偕L時，細胞周期有較大的變化，細菌分裂一次僅需35min。而完成一次DNA復制需要40min,DNA復制前準備（G1）約10min；分裂前準備（G2）約20min；一個周期70min?！ぜ毦诳焖偕L情況下，如何協(xié)調快速分裂和最基本的DNA復制速度之間的矛盾?

在上一次細胞分裂結束時，細胞內的DNA已經復制到一半。第四十三頁，共八十二頁。第四十四頁，共八十二頁。二、有絲分裂(mitosis)●前期(prophase)●前中期(prometaphase)●中期(metaphase)●后期(anaphase)

●末期(telophase)第四十五頁，共八十二頁。第四十六頁，共八十二頁。前期(prophase)◆標志前期開始的第一個特征是染色質開始濃縮形成有絲分裂染色體◆第二個特征細胞骨架解聚，有絲分裂紡錘體開始裝配◆Golgi體、ER等細胞器解體，形成小的膜泡這種染色體由兩條染色單體(chromatid)構成 ·在前期末，染色體主縊痕部位形成一種蛋白復 合物稱為動粒(kinetochore)第四十七頁，共八十二頁。

間期動物細胞含一個MTOC，即中心體，在S期末，兩個中心粒在各自垂直的方向復制出一個中心粒，形成兩個中心體。當前期開始時，2個中心體移向細胞兩極，并同時組織微管生長，由兩極形成的微管通過微管結合蛋白在正極末端相連，最后形成有絲分裂紡錘體。第四十八頁，共八十二頁。前中期(prometaphase)◆核膜破裂成小的膜泡，這一過程是由核纖層蛋白中特異的Ser殘基磷酸化導致核纖層解體◆紡錘體微管與染色體的動粒結合，捕捉住染色體，每個已復制的染色體有兩個動粒，朝相反方向，保證與兩極的微管結合；紡錘體微管捕捉住染色體后，形成三種類型的微管◆不斷運動的染色體開始移向赤道板。細胞周期也由前中期逐漸向中期運轉。第四十九頁，共八十二頁。中期(metaphase)◆所有染色體排列到赤道板(MetaphasePlate)上，標志著細胞分裂已進入中期◆是什么機制確保染色體正確排列在赤道板上？

第五十頁，共八十二頁。后期(anaphase)

◆排列在赤道面上的染色體的姐妹染色單體分離產生向極運動。◆后期(anaphase)大致可以劃分為連續(xù)的兩個階段，即后期A和后期B?！ず笃贏，動粒微管去裝配變短，染色體產生兩極運動。·后期B，極間微管長度增加，兩極之間的距離逐漸拉長，介導染色體向極運動。第五十一頁，共八十二頁。末期(telophase)◆染色單體到達兩極，即進入了末期（telophase）,到達兩極的染色單體開始去濃縮◆核膜開始重新組裝◆Golgi體和ER重新形成并生長◆核仁也開始重新組裝，RNA合成功能逐漸恢復,有絲分裂結束。第五十二頁，共八十二頁。胞質分裂(Cytokinesis)

動物細胞胞質分裂◆胞質分裂(cytokinesis)開始于細胞分裂后期，在赤道板周圍細胞表面下陷，形成環(huán)形縊縮，稱為分裂溝(furrow)。分裂溝的位置與紡錘體和鈣離子濃度的變化有關 ◆胞質分裂開始時，大量肌動蛋白和肌球蛋白在中體處組裝成微絲并相互組成微絲束，環(huán)繞細胞，稱為收縮環(huán)。收縮環(huán)收縮、收縮環(huán)處細胞膜融合并形成兩個子細胞第五十三頁，共八十二頁。植物細胞胞質分裂

◆與動物細胞胞質分裂不同的是，植物細胞胞質分裂是因為在細胞內形成新的細胞膜和胞壁而將細胞分開第五十四頁，共八十二頁。植物細胞胞質分裂第五十五頁，共八十二頁。1、中心體（二）與有絲分裂直接相關的亞細胞結構2、動粒與著絲粒動粒又稱著絲點，是附著于著絲粒上的一種細胞器，其外側用于紡錘體微管附著，內側與著絲粒相互交織。第五十六頁，共八十二頁。第五十七頁，共八十二頁。動粒動粒微管復制好的染色體著絲粒區(qū)染色單體第五十八頁，共八十二頁。3、紡錘體紡錘體是細胞分裂過程中的一種與染色體分離直接相關的細胞器，由微管和微管結合蛋白組成，兩端為星體。功能是將遺傳物質均等分配到兩個子細胞。紡錘體微管類型動粒微管：一端固定在著絲粒上。另一端在中心體上或其附近，每個著絲點有從中心體長出15－30條微管與之結合極性微管：不與染色體相互作用，一端在中心體內，另一端游離。第五十九頁，共八十二頁。微管中心體極性微管紡錘極紡錘體的裝配：移動素類蛋白KRPs,細胞質動力蛋白第六十頁，共八十二頁。第六十一頁，共八十二頁。第六十二頁，共八十二頁。星體微管動粒微管極微管紡錘極動粒復制好的染色體第六十三頁，共八十二頁。（三）有絲分裂過程染色體運動的動力機制1、染色體列隊與染色體列隊相關的蛋白：Mad蛋白和Bub蛋白，可使動粒敏化，促使微管與動粒接觸。Mad2和Bud1位于前中期染色體的動粒上，如果染色體被紡錘體微管捕獲，Mad2和Bud1蛋白很快從動粒上消失。反之，則不消失，后期不能啟動。第六十四頁，共八十二頁。Mad蛋白和Bub蛋白使動粒敏感化，使動粒與微管接觸染色體列隊第六十五頁，共八十二頁。染色體列隊假說牽拉假說：認為染色體向赤道方向運動，是由于動粒微管牽拉的結果，動粒微管越長，拉力越大，當染色體兩側動粒微管的作用力達到平衡時，染色體被穩(wěn)定在赤道板上。外推假說：認為染色體向赤道方向運動，是由于星體的排斥力將染色體外推的結果，染色體距離中心體越近，星體的外推力越強。第六十六頁，共八十二頁。第六十七頁，共八十二頁。染色體分離后期A和后期B階段假說后期A：動粒微管的縮短，將染色體逐漸拉向兩極。動粒微管的縮短是微管蛋白亞單位去聚合結果。是動力蛋白沿動粒微管向極部運動的結果。后期B：極微管在正端添加微管蛋白亞單位進行聚合延長，使兩極的極微管產生重疊的區(qū).KRPs在來自兩極的極性微管間搭橋。KRPs向微管正極行走，使極微管間產生滑動，形成將兩極分開的力.胞質動力蛋白在星體微管和細胞膜之間搭橋，向星體微管負極運動，進一步將兩極拉長.第六十八頁，共八十二頁。后期A后期B◆力產生的機制：◆后期A，微管去聚合假說◆后期B，紡錘體微管滑動假說◆染色體分離的力●拉力：由動粒微管去裝配產生●推力：由極微管的聚合所產生第六十九頁，共八十二頁。第三節(jié)細胞周期的調控美國科學家利蘭·哈特韋爾、英國科學家迪莫西·亨特和保羅·納斯因發(fā)現了細胞周期的關鍵分子的調節(jié)作用獲得2001年醫(yī)學生理諾貝爾獎。利蘭·哈特韋爾發(fā)現控制細胞周期的“start”基因。迪莫西·亨特發(fā)現細胞周期的關鍵調節(jié)物質CDK（細胞周期蛋白依賴激酶）保羅·納斯發(fā)現了調節(jié)CDK功能的cyclin（細胞周期蛋白）第七十頁，共八十二頁。一、MPF（成熟促進因子）的發(fā)現◆細胞融合與PCC(Prematurechromosomalcondense)1970年，Rao和Johnson將細胞進行同步化培養(yǎng)出不同時期的細胞，將M期細胞與其他間期細胞在仙臺病毒介導下融合，并繼續(xù)培養(yǎng)一段時間，發(fā)現與M期細胞融合的間期細胞發(fā)生了形態(tài)各異的染色體凝集，稱為染色體超前凝集（PCC）；不同時期的間期細胞與M期細胞融合，產生的PCC形態(tài)各異。G1+MPCC細單線狀S+MPCC為粉末狀G2+MPCC雙線狀第七十一頁，共八十二頁。人M期細胞與袋鼠（Ptk）G1、S、G2期細胞融合誘導PCC：提示M期細胞存在誘導PCC的因子；稱為細胞促分裂因子(MPF)第七十二頁，共八十二頁。MPF的發(fā)現及其生化實質◆MPF的發(fā)現注射實驗★用非洲爪蟾分裂中期的卵細胞質提取物注射到非洲爪蟾的卵母細胞，能使卵母細胞進入分裂中期，使核破裂，并形成紡錘體★用細胞間期的提取物注射卵母細胞，不能使卵母細胞進入分裂中期第七十三頁，共八十二頁。注射實驗表明：成熟卵細胞質中，含有促卵母細胞成熟的因子，稱做MPF。MPF在細胞周期中波動很大，在有絲分裂前急劇升高，有絲分裂后急劇下降，且普遍存在于動物細胞注射來自M期細胞的細胞質容易檢測到的紡錘體注射來自間期細胞的細胞質卵母細胞進入M期卵母細胞不進入M期卵母細胞卵母細胞第七十四頁，共八十二頁。MPF的純化工作：進展緩慢，1988年，Maller實驗室的Lohka等人分離得到微克級的純化MPF，證明其含有P32和P45兩種蛋白，只有兩者結合后，才表現出蛋白激酶活性。第七十五頁，共八十二頁。P34cdc2激酶的發(fā)現及其與MPF的關系以酵母為材料進行研究cdc基因:與細胞分裂和細胞周期調控有關的基因。對分離的裂殖酵母突變體的研究發(fā)現，Cdc2基因是一種重要的基因，缺乏Cdc2基因，細胞停留在G2/M交界處。其表達產物是P34cdc2蛋白，具有蛋白激酶活性。但其激酶活性的表現必須要與另一種蛋白P56cdc13結合。第七十六頁，共八十二頁?！粞恐辰湍敢灿幸粋€關鍵性的基因Cdc28。Cdc28基因突變，細胞停留在G1/S交界處或G2/M交界處。Cdc28基因的表達產物是P34cdc28。是P34cdc2蛋白同源物?！袅硪恍┛茖W家以海膽卵為材料，發(fā)現了細胞周期蛋白(cyclin)第七十七頁，共八十二頁。MPF由兩個不同的亞基組成◆催化亞基是絲氨酸/蘇氨酸型蛋白激酶,其活性依賴于周期蛋白，故被稱為周期蛋白依賴性蛋白激酶(Cyclin-dependentproteinkinase，Cdks)◆調節(jié)亞基：周期蛋白(Cyclin)：其濃度在細胞周期中呈周期性變化◆MPF是一種使多種底物蛋白磷酸化的蛋白激酶；由M期Cyclin-Cdk形成的復合物。

MPF=p34cdc2+cyclin第七十八頁，共八十二頁。周期蛋白依賴細胞周期蛋白的激酶(Cdk)第七十九頁，共八十二頁。

SpeciesCdksCyclins

裂殖酵母CDC2(p34cdc2),pucl(G1cyclin)