動(dòng)物分子系統(tǒng)學(xué)研究的理論基礎(chǔ)及研究進(jìn)展

動(dòng)物分子系統(tǒng)學(xué)研究的理論基礎(chǔ)及研究進(jìn)展生命科學(xué)學(xué)院2010級(jí)裴嘉偉1、分子系統(tǒng)學(xué)1.1分子系統(tǒng)學(xué)研究的理論基礎(chǔ)分子系統(tǒng)學(xué)（molecularsystematics）是檢測(cè)、描述并解釋生物在分子水平上的多樣性及其演化規(guī)律的科學(xué)。它的理論基礎(chǔ)來(lái)源于系統(tǒng)學(xué)、分類(lèi)學(xué)、遺傳學(xué)、比較生物化學(xué)、分子生物學(xué)和進(jìn)化論，其方法來(lái)源于免疫學(xué)、儀器分析、生物化學(xué)和分子生物學(xué)。分子系統(tǒng)學(xué)就是以研究生命的普遍性為對(duì)象的分子生物學(xué)與研究生物多樣性的系統(tǒng)學(xué)相結(jié)合而出現(xiàn)的新的生物學(xué)分支，基于在分子水平上的比較建立分子進(jìn)化樹(shù)，來(lái)探討生物的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。它有兩個(gè)重要的理論基礎(chǔ)（Felsenstein,1998），其一是中性進(jìn)化論，認(rèn)為大多數(shù)分子水平的變異是隨機(jī)的，生物大分子的結(jié)構(gòu)變異能夠反映進(jìn)化變異的積累。自然選擇在某些方面仍起著積極作用，導(dǎo)致一些生物大分子的保守結(jié)構(gòu)；其二是進(jìn)化速度均衡論，即Zuckerkandl和Pauling（1965）提出的“分子鐘”的概念，認(rèn)為生物大分子的進(jìn)化基本保持一種恒定的進(jìn)化速度，分子變異程度能較好的反映物種進(jìn)化距離。其研究結(jié)果對(duì)于揭示生物進(jìn)化歷程及機(jī)理具有十分重要的意義。1.2分子系統(tǒng)學(xué)常用的分析方法1.2.1系統(tǒng)樹(shù)（phylogenetictree）的構(gòu)建系統(tǒng)演化的研究方法是利用與分類(lèi)單元一起演化的形狀及化石等特征的分析比較來(lái)推斷重建生物類(lèi)群的演化歷史。系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)用樹(shù)一樣拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)描述一群有機(jī)體發(fā)生或進(jìn)化順序?；谝换虻暮怂峄虬被嵝蛄兴⒌南到y(tǒng)發(fā)生樹(shù)稱(chēng)為一個(gè)基因樹(shù)。而表現(xiàn)物種或種群分歧的歷史以及在每一次分歧后趨異時(shí)間的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)相互稱(chēng)為物種樹(shù)或種群樹(shù)?；驑?shù)與物種樹(shù)并不一致，因?yàn)镈NA的變異是一個(gè)隨機(jī)過(guò)程，有限的序列內(nèi)可能存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的偏差使得基因樹(shù)的分支情況（拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)）不同于物種樹(shù)。并且，基因的分化時(shí)間可能不同于物種的分化時(shí)間。系統(tǒng)分類(lèi)學(xué)上將選定的序級(jí)最低的基本單位也即研究的分類(lèi)單元，稱(chēng)為運(yùn)籌分類(lèi)單元，它處在整個(gè)樹(shù)分枝的末端或稱(chēng)樹(shù)的終結(jié)點(diǎn)上，簡(jiǎn)稱(chēng)OUT。OUT可以是類(lèi)元（GROUP）、種群、物種、也可以是更小或更高的個(gè)體與群組。一項(xiàng)研究中OUT序級(jí)一般應(yīng)當(dāng)一致。已表明最近共祖分類(lèi)單元所在位置的樹(shù)稱(chēng)為有根樹(shù)；最近共祖分類(lèi)單元所在位置未知，則稱(chēng)無(wú)根樹(shù)。樹(shù)中的分支點(diǎn)稱(chēng)為內(nèi)節(jié)點(diǎn)，它代表了一個(gè)或一系列趨異事件發(fā)生的位置；節(jié)點(diǎn)間連線稱(chēng)為支，其中一端與終節(jié)點(diǎn)相連的為外支，不與終結(jié)點(diǎn)相連的稱(chēng)內(nèi)支。在有根樹(shù)中，連接2個(gè)外支的內(nèi)節(jié)點(diǎn)成為共祖點(diǎn)。其中，構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)的常用方法有：最大簡(jiǎn)約法、距離矩陣法、最大擬然法，以上三種方法各有一定的運(yùn)用條件和范圍，但是同時(shí)用幾種方法構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)結(jié)果的一致性將提高研究結(jié)果的可靠性。用于系統(tǒng)學(xué)分析的計(jì)算機(jī)軟件有：多序列對(duì)位排列（multiplesequencealignment）軟件，系統(tǒng)演化和進(jìn)化分析軟件：PHYLIP、PUZZLE\PAUP\MEAG、DNASTAR、TREEVIEW、CLUSTALX、CLUSTALW和PHYLO-WIN(LINUX)等。2、各種基因在動(dòng)物分子系統(tǒng)學(xué)上的應(yīng)用2.1RNA分子在動(dòng)物分子系統(tǒng)學(xué)上的應(yīng)用2.1.1RNA分子的多能性作為一大類(lèi)具有共同化學(xué)基礎(chǔ)的分子，RNA的多能性十分引人注目。第一、雖然在現(xiàn)生生物世界里，分子的遺傳主要途徑是DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和mRNA的翻譯，但是RNA仍作為一些病毒的遺傳物質(zhì)；第二、RNA具有多樣的分子生物學(xué)行為，如拼接、編輯、催化與自催化；第三、RNA在從DNA到蛋白質(zhì)的表達(dá)過(guò)程中扮演多重角色。2.1.2rRNA在進(jìn)化生物學(xué)研究中的地位3種RNA中一般只有rRNA和tRNA用于分子系統(tǒng)學(xué)，尤其是高級(jí)階元間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的研究，而這兩者中又以rRNA占絕大多數(shù)。利用rRNA研究不同物種在進(jìn)化上的親緣關(guān)系的優(yōu)點(diǎn)之一是核糖體是一切細(xì)胞共有的，因而核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)計(jì)劃（RDP，RidosomalDatabaseProject）備受重視（注：不是說(shuō)mRNA和tRNA不為所有細(xì)胞生命共有，而是從與各種蛋白質(zhì)和DNA分子標(biāo)記相比較的角度出發(fā)而言；而且mRNA具有物種特異性，發(fā)育階段特異性等各種各樣的特異性，tRNA則太小）。rRNA一直以來(lái)被認(rèn)為是很好的中性進(jìn)化分子，又因其不同區(qū)段具有不同的進(jìn)化速率，它所適用的階元跨度較大。2.1.3rRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)及應(yīng)用2.1.3.1一級(jí)與二級(jí)結(jié)構(gòu)的比對(duì)rRNA的分子在進(jìn)化中積累有插入，缺失和替換等突變，且突變?cè)诜肿诱w中的分布不均，存在高變區(qū)，盡管一級(jí)結(jié)構(gòu)之間有較大分異(Michotetul,1990)，但rRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)在進(jìn)化過(guò)程中卻高度保守（Zwied,GlotzcunclBrimacombe,1981），再者，一級(jí)結(jié)構(gòu)在客觀上以二級(jí)結(jié)構(gòu)和更高級(jí)結(jié)構(gòu)形式存在，而不同水平的變異記載的是同一段進(jìn)化歷史，目前，無(wú)論是從理論還是實(shí)踐出發(fā)，多數(shù)人認(rèn)為二級(jí)結(jié)構(gòu)的信息是對(duì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的重要補(bǔ)充。2.1.3.2rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)特征與形態(tài)特征和序列特征相比的異同與優(yōu)點(diǎn)依據(jù)二級(jí)結(jié)構(gòu)的特征性狀進(jìn)行分析的過(guò)程與依據(jù)形態(tài)特征所做的研究類(lèi)似；而另一方面，它與序列信息同屬于分子層次上的信息，而且二級(jí)結(jié)構(gòu)要從一級(jí)結(jié)構(gòu)中獲得。但是它與這兩者相比又各有不同。第一：形態(tài)特征多為多基因支配，且遺傳背景多半不明，此外還會(huì)受到基因表達(dá)與環(huán)境作用的多重影響，即外遺傳作用（epigeneticeffect）的影響；與之相比，二級(jí)結(jié)構(gòu)特征可以具體到明確的突發(fā)事件，且性狀本身無(wú)分子本身以外的相干因素影響。第二：一級(jí)結(jié)構(gòu)高變區(qū)直接比對(duì)結(jié)果的信噪比（Signal-to-Noise）低，可信性差，在將高變區(qū)去掉時(shí)，實(shí)際上是棄去了有用的系統(tǒng)發(fā)育信息，這些信息只有在二級(jí)結(jié)構(gòu)中才能成為有價(jià)值的信息，因此利用二級(jí)結(jié)構(gòu)比序列提高了對(duì)信息的利用效率。Billoudetal.(2000)認(rèn)為：1）二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)形特征最實(shí)用于綱和目級(jí)階元的研究；2）在選用二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)形特征時(shí)，要注意的問(wèn)題是辨清性狀的獨(dú)立性；3)進(jìn)化速率不同的特征加權(quán)對(duì)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的影響不大。2.13tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)及應(yīng)用Chiotisetal.(2000)以原臭蟻亞科和蟻亞科為外群對(duì)臭蟻亞科昆蟲(chóng)屬間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行研究，對(duì)攜帶亮氨酸的Trna(UUR)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，包括外群在內(nèi)的17個(gè)屬中，發(fā)現(xiàn)D環(huán)、氨基酸臂和反密碼子臂均只在個(gè)別1、2個(gè)屬中有差異，而在TψC莖環(huán)結(jié)構(gòu)方面則出現(xiàn)了包括莖的長(zhǎng)度、環(huán)的大小以及莖中是否含有G≡C配對(duì)的3方面較為豐富的變異。由于提供的系統(tǒng)發(fā)育信息有限，只提取了是否含有G≡C配對(duì)這一項(xiàng)信息，與根據(jù)細(xì)胞色素b(Cytb)和細(xì)胞色素氧化酶亞基Ⅰ（COⅠ）的氨基酸序列得到的系統(tǒng)發(fā)育假設(shè)進(jìn)行了比較。結(jié)果表明內(nèi)群中所有缺少G≡C配對(duì)的5個(gè)屬與1個(gè)含有G≡C配對(duì)的屬六者形成一個(gè)單系群，這樣的吻合度很高。由于每一種tRNA都很小，所能提供的信息十分有限；而且目前對(duì)于不同分類(lèi)階元水平上tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的比較研究十分欠缺。如果這方面的情況能有所改進(jìn)，并且將多種tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)信息綜合起來(lái)，例如將線粒體基因組中所有的tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)信息綜合起來(lái)，則tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)有可能得到更好的應(yīng)用。20世紀(jì)90年代以來(lái)，RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)的比較研究日益廣泛，在動(dòng)物系統(tǒng)學(xué)中的應(yīng)用也大量增多。目前，RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)在動(dòng)物分子系統(tǒng)學(xué)研究中的應(yīng)用已經(jīng)相對(duì)成熟。然而，對(duì)于單鏈RNA來(lái)說(shuō)，DNA分子穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)及其所攜帶的遺傳信息量都遠(yuǎn)超于RNA分子。此外，由于DNA分子易于分析，含有豐富的進(jìn)化信息，易于獲得，并隨著PCR技術(shù)的應(yīng)用，基于DNA序列的分子進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建已成為動(dòng)物分子系統(tǒng)學(xué)乃至生物系統(tǒng)研究的重要工具。下面就介紹一下DNA分子在動(dòng)物分子系統(tǒng)學(xué)中的應(yīng)用。3、mtDNA在動(dòng)物分子系統(tǒng)學(xué)中的應(yīng)用3.1mtDNA的結(jié)構(gòu)動(dòng)物mtDNA的長(zhǎng)度一般為14~19kb的共價(jià)閉合的環(huán)狀雙鏈DNA，根據(jù)堿性氯化銫密度梯度離心中雙鏈密度不同分為重鏈（H-鏈）和輕鏈（L-鏈）。動(dòng)物mtDNA絕大多數(shù)的蛋白質(zhì)編碼基因及兩個(gè)rRNA基因均在外圈的重鏈上，包括13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因、2個(gè)rRNA基因、22個(gè)tRNA基因和一段包含復(fù)制起點(diǎn)的控制區(qū)，稱(chēng)為A+T區(qū)或D-環(huán)區(qū)。mtDNA基因間排列緊密，非編碼序列少，基因不含內(nèi)含子和間隔序列，即使存在，也僅有一到幾個(gè)核苷酸，這使得mtDNA的編碼效率較核DNA高。但在不同種類(lèi)的生物中，mtDNA的核苷酸組成具有不均一性，其（G+C）%在20%-50%之間變化。3.2mtDNA的基因成分動(dòng)物線粒體基因組含有13個(gè)蛋白基因包括細(xì)胞色素b基因（Cytb），細(xì)胞色素C氧化酶3個(gè)亞基基因（COX1、COX2、COX3）， NADH氧化還原酶7個(gè)亞基基因（ND1、ND2、ND3、ND4、ND5、ND6、ND7）和ATP酶2個(gè)亞基基因（ATPase6、ATPase8），這13個(gè)蛋白或亞基都是線粒體內(nèi)膜呼吸鏈的成分。動(dòng)物線粒體基因組含有22個(gè)tRNA基因，可以滿(mǎn)足線粒體蛋白質(zhì)的翻譯中所有密碼子的需要。其中tRNA-Clu、Ala、Asn、Cys、Tys、Ser、Gln、Pro由L-鏈編碼，其余由H-鏈編碼。H-鏈編碼的tRNA基因散布于蛋白質(zhì)基因和rRNA基因之間，相鄰基因間隔1-30個(gè)堿基或緊密連接，甚至也發(fā)生重疊。一般來(lái)說(shuō)，脊椎動(dòng)物的線粒體tRNA-Met、His、Len(CUN)等序列保守性較高，可達(dá)80%以上，而Trna-Ser(AGY)的變異最大，同源性只有54%-64%。Mt-tRNA可形成典型的三葉草形二級(jí)結(jié)構(gòu)，一般含有7個(gè)堿基的氨基酸接受臂，5個(gè)堿基的TψC臂，反密碼子臂及4個(gè)堿基的雙氫尿嘧啶（DHU）臂，各臂堿基對(duì)存在高比例的錯(cuò)配。線粒體的12s和16srRNA基因位于H-鏈Trna-Phe和tRNA-Len(UUR)基因之間，以tRNA-Val基因?yàn)殚g隔，12srRNA基因較16srRNA基因更保守。rRNA基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)很保守，形成多個(gè)大小不一的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。線粒體基因組中主要存在的2段非編碼區(qū)，一為D-環(huán)區(qū)（displacement-loopregion），又叫控制區(qū)（controlregion），另一段是L-鏈復(fù)制起始區(qū)。D-環(huán)區(qū)位于tRNA-Pro和tRNA-Phe基因之間，是整個(gè)線粒體基因組序列和長(zhǎng)度變異最大的區(qū)域，但其中還包含有保守片段。L-鏈復(fù)制起始區(qū)長(zhǎng)約為30~50bp，位于tRNA-Asn和tRNA-Cys基因之間，該段可折疊成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。3.3mtDNA與核DNA相較之下的優(yōu)勢(shì)mtDNA由于是通過(guò)母系遺傳，基因的序列一般保守，與核DNA相比相對(duì)較小，序列變異相對(duì)迅速。因此，mtDNA用于進(jìn)化和系統(tǒng)研究具有一定的優(yōu)勢(shì)。動(dòng)物mtDNA進(jìn)化速率在譜系間、基因間以及基因內(nèi)部各有所不同，但進(jìn)化率平均是單拷貝核DNA的1-2倍，在線粒體內(nèi)，有的mtDNA區(qū)段變異快，而另一些則高度保守，這使得不同區(qū)段適用于分析不同的分類(lèi)單元水平。根據(jù)mtDNA區(qū)段或基因的序列來(lái)構(gòu)建分子系統(tǒng)樹(shù)，并進(jìn)而進(jìn)行分類(lèi)和進(jìn)化分析的研究較多。3.3mtDNA的研究方向3.3.1研究物種間的分歧進(jìn)化根據(jù)物種間mtDNA比較分析所得到的數(shù)據(jù)，根據(jù)物種間mtDNA歧義程度，通過(guò)一定的統(tǒng)計(jì)分析，可以決定物種間的親緣關(guān)系、分歧年代和演化過(guò)程等。目前，這一項(xiàng)目在靈長(zhǎng)類(lèi)、小鼠亞類(lèi)、馬屬以及魚(yú)類(lèi)中進(jìn)展較快。日本學(xué)者Hasegawa等研究認(rèn)為，長(zhǎng)臂猿、猩猩、大猩猩、黑猩猩和人類(lèi)的祖先分歧的時(shí)間分別為1330萬(wàn)、1086萬(wàn)、367萬(wàn)和268萬(wàn)年。J.D.Durand等也分別進(jìn)行了對(duì)龜和海龜?shù)任锓N的親緣關(guān)系研究。3.3.2利用mtDNA的種內(nèi)多態(tài)性研究母系演化mtDNA的母系遺傳和種內(nèi)多態(tài)為追蹤種內(nèi)母系演化提供了良機(jī)。俞民等對(duì)我國(guó)漢族、維吾爾族、哈薩克族和回族的mtDNA多態(tài)性進(jìn)行了研究，從分子水平上揭示了4個(gè)民族在體質(zhì)上的共性，并發(fā)現(xiàn)了較低頻率的至今仍保留靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物酶切位點(diǎn)的mtDNA祖先類(lèi)型，為亞洲可能是人類(lèi)起源地區(qū)之一提供了間接依據(jù)。A.Brehm等根據(jù)蜥蜴的線粒體核苷酸序列分析了Mabuyaspp、Reptilia和Scincidae3個(gè)亞種的進(jìn)化關(guān)系。3.3.3檢測(cè)自然界的雜交漸滲現(xiàn)象由于mtDNA為母系遺傳，可以確定雜交發(fā)生的方向，同時(shí)由于mtDNA標(biāo)記的連鎖性，可以提高區(qū)分雜交漸滲與共形性或特征趨同性的能力。因此，用mtDNA來(lái)檢測(cè)天然物種間的雜交漸滲比根據(jù)形態(tài)、核型或蛋白質(zhì)的比較來(lái)檢測(cè)具有明顯的優(yōu)勢(shì)。Avise等研究了9種北美太陽(yáng)魚(yú)mtDNA的限制性?xún)?nèi)切酶圖譜，認(rèn)為配偶缺乏和稀有物種雌性的交配刺激可能是增加種間雜交可能性的重要原因。3.3.4追蹤特異物種的生活史大西洋鮭（Salmosalar）是一種特異的魚(yú)類(lèi)，具有2個(gè)種群，一種是洄游入河產(chǎn)卵，另一種是非入河產(chǎn)卵。Birt等比較了這2個(gè)種群的mtDNA的限制性?xún)?nèi)切酶圖譜，發(fā)現(xiàn)它們的親緣較近，分歧時(shí)間可能在一萬(wàn)年左右。W.E.Johnson等根據(jù)線粒體DNA追蹤分析了山貓（Oreailurusjacobita）的進(jìn)化；BeminghamE等討論了熱帶淡水魚(yú)與中美洲魚(yú)的起源和進(jìn)化；HanniC等根據(jù)線粒體DNA研究了洞穴熊（Ursusspelaeus）的起源。3.4mtDNA的研究成果和展望到目前，mtDNA在動(dòng)物分子系統(tǒng)學(xué)中的主要成果是對(duì)全序列mtDNA的研究和對(duì)mtRNA各片段如細(xì)胞色素b(Cyt-t)基因片段，mtDNA控制區(qū)（D-環(huán)，D-loop），16srRNA、12srRNA，NADH降解酶基因的研究。隨著mtDNA研究技術(shù)的日趨成熟，mtDNA已經(jīng)越來(lái)越廣泛的被應(yīng)用到分子系統(tǒng)學(xué)的研究中，并在物種鑒定領(lǐng)域有著重要作用，對(duì)那些在形態(tài)、行為上難以區(qū)分的物種，可望利用mtDNA研究技術(shù)在分子水平上予以分類(lèi)。此外，以mtDNA作為母系遺傳的遺傳標(biāo)記與染色體特征、酶、血液蛋白多態(tài)性、體型外貌、地理分布、生態(tài)類(lèi)型、歷史及考古資料相結(jié)合，不僅可以全面了解各種動(dòng)物的遺傳分化，而且對(duì)于弄清動(dòng)物的遺傳資源，研究其遺傳結(jié)構(gòu)及親緣關(guān)系提供了重要依據(jù)。雖然mtDNA被廣泛的應(yīng)用到分子系統(tǒng)學(xué)研究中，然而，線粒體作為半自主性的細(xì)胞器，其發(fā)育受線粒體基因和核基因的雙重影響，核基因?qū)€粒體基因的進(jìn)化有了能造成一定影響，核基因組中還存在線粒體基因的假基因，從而使線粒體基因用于系統(tǒng)發(fā)育的可靠性和準(zhǔn)確性受到影響（Bensassonetal,2000）；由于線粒體基因是母系遺傳，其中所含的進(jìn)化信息并不能完全代表雙親進(jìn)化歷史，在種群系統(tǒng)學(xué)研究中，某些物種其種群的性別結(jié)構(gòu)存在性偏異，那么根據(jù)線粒體基因得到的信息可能不能完全的反映出種群的遺傳結(jié)構(gòu)，甚至得到的是錯(cuò)誤結(jié)果。因此線粒體基因樹(shù)可能只是部分的或有偏異地代表了生物的系統(tǒng)發(fā)生。而生物地性狀基本