生物化學(xué)-基因工程簡介

第十九章

基因工程簡介一基因工程基因工程是由七十年代初才開始發(fā)展起來的一門科學(xué)。其主要內(nèi)容是一種生物的基因在體外結(jié)合在另一生物的基因組（DNA分子）中，再把它引入到生物的細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，形成具有新遺傳性狀的生物。而這種具有新遺傳性狀的生物是按人們的設(shè)想制造出來的，它將有益于人類。

二獲得目的基因的方法為了把某種基因轉(zhuǎn)移到細(xì)菌中去表達(dá)，首先必須獲得純的該種基因（稱為目的基因）。目前獲得目的基因的方法大致有三種。（1）從含有目的基因的生物DNA中獲得，即將此生物的DNA分離出來后，用限制性內(nèi)切酶（此種酶由DNA鏈內(nèi)部的一定部位將DNA切斷）將其切成許多碎片，然后分離出含有目的基因的碎片。（2）先分離出目的基因的轉(zhuǎn)錄物mRNA，再用此mRNA反轉(zhuǎn)錄出DNA，稱為cDNA，亦即目的基因。（3）如果已知目的基因的核苷酸順序，可人工合成它，此法適用于分子量比較小的基因。三載體得到目的基因之后，一般要通過一定的載體才能將目的基因轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞內(nèi)。目前最常用的載體是細(xì)菌的質(zhì)粒，質(zhì)粒是細(xì)菌細(xì)胞中含有的一類環(huán)狀DNA分子。載體必需具有的性質(zhì)是：（1）能與目的基因結(jié)合在一起。（2）新組成的DNA分子必需能在適當(dāng)?shù)募闹骷?xì)胞中進(jìn)行復(fù)制，目的基因要能夠表達(dá)。例如，以大腸桿菌為寄主細(xì)胞，則質(zhì)粒和λ噬菌體是適當(dāng)?shù)妮d體。在理論方面，目前主要是用基因工程作為手段，以純化和擴(kuò)增基因，從而獲得大量純系DNA片段，作為核酸序列分析、基因組的組織分析和基因表達(dá)調(diào)控研究的材料。這三項(xiàng)工作的開展，將大大促進(jìn)細(xì)胞分化、腫瘤發(fā)生、進(jìn)化等重大生物學(xué)問題的研究。在生產(chǎn)實(shí)踐方面，目前主要是把一些目的基因轉(zhuǎn)移到細(xì)菌中，利用此種細(xì)菌大量生產(chǎn)人們所需要的蛋白質(zhì)，而這些蛋白質(zhì)是用其他方法不能大量生產(chǎn)的。人類已能利用基因工程的方法，使細(xì)菌產(chǎn)生大量牛的生長激素，用以提高牛奶和牛肉的產(chǎn)量。又如用同樣方法已制造出胰島素和干擾素等用于臨床治療。四.基因工程的應(yīng)用生物學(xué)家把大鼠的生長激素基因轉(zhuǎn)移到小鼠的受精卵細(xì)胞內(nèi)，發(fā)育成新型小鼠，其生長速度比原來快50%，體重也比對照大很多，并把這種新型的小鼠，稱為超級(jí)小鼠。這個(gè)成果提示，如果我們能用類似的方法制造出具有類似性能的家畜（豬、雞等），將具有重大的生產(chǎn)意義。目前人們還在研究把固氮細(xì)菌的固氮基因轉(zhuǎn)移到其他細(xì)菌中以解決氮肥問題；把大豆蛋白的基因轉(zhuǎn)移到小麥、玉米等中以提高這些作物的蛋白質(zhì)含量；用基因工程方法制造豬的生長激素，以提高豬肉產(chǎn)量和增加瘦肉率等?？傊?，基因工程的研究成果，將變成為巨大的生產(chǎn)力。它能迅速提高農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)的產(chǎn)量，為人醫(yī)、獸醫(yī)提供優(yōu)良的藥物，以及解決許多生物學(xué)中的重大問題。

位點(diǎn)專一性重組限制性內(nèi)切酶

逆轉(zhuǎn)錄PCR原理雞輸卵管上皮細(xì)胞特異性表達(dá)載體的構(gòu)建Thelistofeukaryoticexpressionvectorsconstructed

No.NamePromotorTargetgene1

pEGFP-N1

CMVIEEGFP2pEGFP

Lysozyme

CMVIE

Lysozyme-EGFP3pOVAGOval-promotorEGFP4

pOVAG-2Oval-promotor

Oval-signalpeptide；EGFP5pOVALGOval-promotor

Lysozyme-EGFP6

pEOVALGOval-promotorSV40enhancer

Lysozyme-EGFPExpressionofGFPgeneindifferentvectorsinChickenEmbryonicFibroblasts(CEFs)

pOVAGpEGFP-N1.pEGFP-Lyso

pOVALG

pEOVALGExpressionofGFPgeneindifferentvectorsinratmammaryepitheliaSHZ-88pOVAGpEGFP-N1pOVALGpEGFP-LysopEOVALGpOVAGNegativecontrol500bp

M123456789samplesDetectionofExogenousgeneinchimericchickenembryosbyPCRP1P2P3P4DetectionofPCRproductsbysouthernblotting

500bp1.2kb

1234567891011M100bpladderPCRproductsfrom8-dchimericembryogenome

(+)(－)(+)

DesignofPlasmidswithMARRT-PCRresultsofgenomeDNAfrom3~22daysoldembryosaftertransplasimdincludeMAR

SouthernhybridizationofradioactivityisotopeProductionoftransgenicchicken

bynucleartransferEmbryosProducedbyNuclearTransfer

Invitrodevelopmentofchicken-rabbitinterclassclonedembryos

KaryotypeAnalysisofReconstructedBlastocystNuclearDNAAnalysis

avianfeatherkeratingeneDP15‘-GGAGAAGGTCCAGGGCTGACTTTA-3‘P25‘-ACTTCTCTTGGCAAACATGCAACC--3‘P35‘---GCGTCCACCTCATCCTTAGCAG---3'

ElectrophoreticanalysisofPCRproductusingspecificavianfeatherkeratin

Lane1,markers(100bpladder);Lane2,chichendonorcells;Lane3,8-cellclonedembryo;Lane4,blastocyststage;Lane5,morulastage;Lane6,water(negativecontrol);Lane7,rabbitsomaticcells;TF,targetfragment.

MitochondrialDNAAnalysis

PrimersforamplificationrabbitmitochondrialDNAPR1:5‘-TCTACATACACGTAGGCCGCGGAA---3'PR2:5‘-GAGGAGAAGAATGGCTACAAGGAAA-3PrimersforamplificationchickenmitochondrialDNA

PC1:5‘-CCCCAGCAAACCCACTAGTA--3'PC2:5‘-TGGTCTAGGGTTCCGATTGT---3'.

ElectrophoreticanalysisofPCRproductusingspecificrabbitandchickencytochromeprimers

Lane1,markers;Lane2,rabbitsomaticcells;Lane3andLane8,morulastage;Lane4andLane9,blastocyststage;Lane5,chickensomaticcells;Lane6andLane11water(negativecontrol);(lane2~6usingrabbitcytb

primers);Lane7,chickensomaticcells;Lane10,rabbitsomaticcells;,negativecontrol;(lane7-11usingchickencytbprimers);TF1,TF2,targetfragment.SequencesofPCRproductsbyusingspecificrabbitandchickencytochromebprimers

(A)chickensomaticcells;(B)morulastage;(C)blastocyststageNTembryoMuitipleovulationsinduced

byCAPEinhensOneovumovulatedafterintra-peritonealinjectionof100mgCAPEthreeovaovulatedafterintra-peritonealinjectionof200mgCAPEOver10oocytesnearmaturityinahen’sovaryafterintra-peritonealinjectionof200mgCAPEThegerminaldiscofanimmatureovum(100x)Lightmicrographofacross-sectionofthegerminaldiscofapreovulatoryfolliclefromthedomesticfowl,thegerminalvesicle(GV)waslocatedinthecentreofthegerminaldisc(GD).Thechromosomeswereobservedinthecentreofthegerminalvesicle.TransplantationoffertilizedegginhenInvitroFertilizationprocess

observedundertheESEM

A:5minutesafterinvitroFertilization;B、CandD:15minutesafterinvitroFertilization.Twohours

afterIVF(400x)Closepairingoftwopronuclei,presumedtobemaleandfemalejuxtaposition,wasdetectedinmultipleovulatedovaincubatedfor2hrafterinvitrofertilization.TheseovawerehistologicallyexaminedbyepifluorescentmicroscopyafterstainingwithDAPI.合子核，Heidenhain氏鐵蘇木精染色(400x)Thezygotenucleus(400x)Associationoftwoonuclei,presumablymaleandfem