蛋白質組學-蛋白質與生物大分子的相互作用研究

蛋白質與生物大分子的相互作用研究基因的功能研究成為熱點，研究的對象即為基因編碼的產物—蛋白質，生物功能的主要體現(xiàn)者和執(zhí)行者。在所有生命活動中，細胞接受外源或是內源的信號，通過其特有的信號途徑，調節(jié)其基因的表達，以保持其生物學特性，這其中必須涉及蛋白與蛋白、核酸的相互作用。掌握或發(fā)明研究相互作用的方法非常重要。nucleus

cytoplasm

主要內容免疫共沉淀(Co-IP)：蛋白—蛋白，蛋白—DNAPulldown（親和層析）：蛋白—蛋白，蛋白—DNA/RNA電泳遷移實驗(EMSA)：蛋白—DNA/RNA酵母雙雜交系統(tǒng)：蛋白—（X）—蛋白用途：鑒定兩種目標蛋白質是否在體內結合，結合位點分析；篩選一種特定蛋白質的新的作用搭檔。原理：當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內存在的許多蛋白質－蛋白質間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質x的抗體免疫沉淀x，那么與x在體內結合的蛋白質y也能沉淀下來。一、免疫共沉淀（invivo）Co-Immunoprecipitation，Co-IPCo-IP工作原理示意圖Co-immunoprecipitationbindingwashelutionYYYYYWesternblot鑒定PAGE質譜細菌蛋白質的“proteinA”可特異性地結合到免疫球蛋白的Fc片段Co-IP鑒定蛋白相互作用實驗注意事項

細胞裂解采用溫和的裂解條件（NP40、Triton-X100等）；每種細胞的裂解條件是不一樣的，通過經驗確定。確保共沉淀的蛋白是由所加入的特異性抗體沉淀得到的，而并非其他非特異蛋白：

1、使用單克隆抗體：多抗？

2、使用對照抗體：（1）單克隆抗體：正常小鼠IgG或另一類單抗（2）兔多克隆抗體：正常兔IgG。StructuralbasisofGprotein–coupledreceptor–Gproteininteractions。Nature

Chem

Biol,2010,6:541-548（分析蛋白相互作用的位點）大鼠G蛋白耦聯(lián)受體M3RG蛋白α（綠色）β（藍色）γ（紫色）亞基G蛋白藕聯(lián)受體信號轉導示意圖將不同變異體的表達質粒共轉染入cos-7細胞中，單獨轉染的為對照；左圖為IP前的IB,右圖為IP后的IB，二者復合物為80kD（陽性結果）。圖為兩次獨立實驗的其中一次。TAK-242(Resatorvid),aSmallMoleculeInhibitorofToll-LikeReceptor(TLR)4Signaling,

BindsSelectivelytoTLR4andInterfereswithInteractionsbetweenTLR4andItsAdaptorMolecules.MolPharmacol,2011,79:34-41（鑒定）分析靶蛋白與小分子化合物的作用：TheimmunoprecipitateswereseparatedusingSDSimmunoblottingwithanti-FLAGM2mAboranti-HAtag

mAb.analyzedusingautoradiography.TRAM分析小分子化合物對蛋白相互作用的干擾ScreeningofClpEinteractionproteinsConstructrecombinantplasmidpAE03-ClpEandtransformintoS.pneumoniae

D39WesternblotforidentificationCo-Immunoprecipitation(Co-IP)transfer1ml（OD600=0.5-0.6）clearedlysateofD39andD39-ClpE-GFPtoa10mlbeakerseparately.Add500μlproteinG-agarosebeads(GE),incubatefor3hat4°Conarotatingapparatuswithmagneticstirrertoremovenon-specificallyboundproteins.Add800μlproteinG-agarosebeadsand20–25μgGFPantibody(Clontech)tothesupernatant.Incubateovernightat4°Conarotatingapparatus.Washbeadsfivetimeswith1mlPBSfor2mineachwash.Resuspendpelletin50-80μl2×SDSsamplebuffer.Load10–15μlofsupernatantonanSDS/polyacrylamidegel.D39-ClpE-GFPClpPIB:GFPIB:ClpEMarkerD39-ClpE-GFPD39D39D39-ClpE-GFPClpP97.2kD優(yōu)點：相互作用的蛋白質都是經翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)；蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進行的，可以避免人為的影響。難點：需要高質量的抗體進行IP；兩種蛋白質的結合可能不是直接結合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；檢測不到弱或瞬時的相互作用。應用：分析與蛋白質相互作用的DNA序列信息染色質免疫共沉淀（ChromatinImmuno-precipitation,ChIP）Chip-seq技術可獲得數(shù)百萬條序列標簽，并能把所關注的蛋白的DNA結合位點精確定位到基因組上。華大基因、上海生物芯片有限、上?？党缮镉邢薰镜菺enome-WideMappingofinVivoProtein-DNA

Interactions.Science,2007,316(5830):1497-1502Johnson等利用ChIP-seq

對轉錄因子NRSF(神經元限制性沉默因子)在DNA上的結合位點進行了全基因組的篩查:結果：獲得了1946個結合位點；結合位點的最小能分辨為50bp。獲得的經典與非經典的神經限制性沉默元件(NRSE)序列。高質量的ChIP-seq結果提供了研究新的DNA-蛋白相互作用的內容，發(fā)現(xiàn)其為胰島發(fā)育調控網絡中的重要轉錄因子。ZBED6,aNovelTranscriptionFactorDerivedfromaDomesticatedDNATransposonRegulatesIGF2ExpressionandMuscleGrowth.

PLoSBiology,2009,7（12）：1-13EllenMarkljung等發(fā)現(xiàn)抑制家豬IGF2基因表達的因子是ZBED6蛋白；進一步用Chip-seq研究ZBED6蛋白的作用靶點。ZBED6蛋白的1200個作用靶點起著發(fā)育、轉錄調控、細胞分化等作用。二、Pull-down實驗（invitro）用途：

1.鑒定兩個已知蛋白質之間是否存在相互作用

2.篩選與已知融合蛋白相互作用的未知蛋白質原理：利用GST、HIS等標簽蛋白將一種蛋白質（誘餌蛋白）固定于某種基質上(如Sepharose)，當細胞抽提液經過該基質時，可與該固定蛋白相互作用的配體蛋白被吸附，通過改變洗脫液或洗脫條件即可回收所吸附的蛋白。

洗脫（2）結合（3）檢測（6）收集（5）洗脫（4）固定誘餌蛋白（1）ThePolymericImmunoglobulinReceptor

Translocates

PneumococciacrossHumanNasopharyngealEpithelialCells.

Cell,2000,102:827–837（篩選、鑒定）polymericimmunoglobulinreceptor(pIgR)CbpA

ThehpIgR-mediatedbacterialadherenceandinvasionwereabolishedbyeitherinsertionalknockoutofcbpA

orantibodiesagainsteitherhpIgRorCbpA.methods蛋白表達：ExpressionofCbpAPolypeptides(6×His）Pull-down：AffinityPurificationoftheCbpABindingProteins蛋白鑒定：ProteinsinthefractionswereanalyzedbySDSandIB，andN-TerminalSequencingoftheCbpABindingProteinsrCbpACovalentlyconjugated

to1mlofAffi-Gel15(BioRad)in0.1MMOPS(pH7.5)at4℃；Thecolumnwassequentiallywashedwithwashingbuffer；DetroitcellssurfaceproteinswerelabeledwithSulfo-NHS-LC-biotin；Celllysateswerepreparedinabuffercontainingproteaseinhibitors；Cellulardebriswasremovedbycentrifugationat4℃，Thesupernatantwas

recycledthroughtheCbpA1-affinitycolumnfor4hat4℃；washthecolumnwithwashingbuffer；theboundproteinswereelutedin300mlfractionswith100mMglycine-HCl(pH2.5)。Pulldown篩選CbpA在A549上的受體：

Lane1CbpA-GST表達全菌，Lane2A549細胞膜蛋白溶解液，Lane3Pulldown純化大柱穿透液，Lane4Pulldownspincolumun柱穿透液1，Lane5Pulldownspincolumun柱穿透液2，Lane6pulldown篩檢結果，Lane7pulldown陰性對照結果.類均相Pull-down鑒定hplgR與CbpA結合的區(qū)段及是否需要糖基化

rCbpAwereimmobilizedoncarboxylatedlatexbeads.LatexbeadscoatedwithCbpApolypeptideswereresuspendedin100μlofPBS/Mg2+/Ca2+and0.1%TritonX-100,andmixedwith100μlofhSC（plgR胞外部分）.Unboundproteinswereremovedbyextensivewashingbuffer.ThebeadswerethenresuspendedinSDSloadingbuffertosolubilizeboundproteins.ProteinswereseparatedinSDSgelsanddetectedbyIB.CbpA與hplgR結合區(qū)段的鑒定

Vncs為S.pn的另一種膜蛋白，hSC為表達hplgR的MDCK細胞，Neo為不表達hplgR的MDCK細胞。Pull-down的優(yōu)缺點優(yōu)點：靈敏、周期短不需要構建基因文庫抗體質量要求不高可鑒定直接相互作用缺點：需要純化的蛋白體外相互作用（假陽性、假陰性）DNA/RNA

Pull-down實驗應用：主要用于篩選、鑒定與目的DNA或RNA片段相互作用的蛋白質（轉錄因子、翻譯調控因子類）方法：與蛋白相互作用的Pull-down類似，只是固定于色譜柱或磁珠上的為標記的DNA或RNA片段，其他步驟一樣。優(yōu)缺點：相較于酵母單/三雜交，其無需構建基因文庫、操作較簡便、周期短。缺點與蛋白Pull-down一樣。AsubsetofreplicationproteinsenhancesoriginrecognitionandlyticreplicationbytheEBvirusZEBRAprotein.PLoS

Pathog.2010,6(8)InvivoDNApulldown共孵育：BZKOcellsweretransfectedwithexpressionvectorsfortheindicatedformsofZEBRAtogetherwithBiotinylated

oligomerscontainingoneof3regulatoryregions.Pulldown：TheBiotinylatedprobeswerepurifiedfromcelllysatesusingavidinbeads.IB：TheamountofZEBRAboundtoeachprobeandthetotalamountofZEBRApresentineachlysatewereassessedbywesternblotanalysis.檢測DNA結合的蛋白量A:upstreamregionoforiLyt[BUR]B:ashortregionofRp[BRpS]C:fulllengthRp[BRpL]Chip檢測（蛋白結合的DNA量）

又叫凝膠阻滯實驗（Gelretardationassay）或DNA遷移率變動實驗（DNAmobilityshiftassay）。是在80年代初期出現(xiàn)的用于在體外研究DNA與蛋白質相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術。它具有簡單、快捷等優(yōu)點，是當前被選作鑒定特定DNA或RNA結合蛋白質的一種典型的實驗方法。原理：DNA/RNA分子與蛋白的結合導致了電泳時遷移率的降低。三、電泳遷移實驗ElectrophoreticMobilityShiftAssay，EMSA)

凝膠阻滯實驗的基本原理圖標記的DNA片段由于與蛋白質B結合，在凝膠電泳中移動速度變慢，因而呈現(xiàn)滯后的條帶。ACB顯影或顯色****凝膠電泳標記的DNA片段細胞蛋白質提取物蛋白質與DNA結合******BDNA-蛋白質結合物電泳遷移緩慢滯后帶表明DNA與蛋白質結合(a)(b)

(c)在凝膠阻滯實驗中競爭DNA與探針DNA之間的競爭作用（a）沒有加入競爭DNA的正常的凝膠阻滯實驗，探針DNA與特異蛋白質結合，出現(xiàn)阻滯條帶；（b）加入的超量競爭DNA與探針DNA競爭結合同一種蛋白質，阻滯條帶消失；（c）競爭DNA為其它序列，與探針DNA分別結合不同的蛋白質，則出現(xiàn)同（a）一樣的阻滯條帶。**********蛋白質與未標記的競爭DNA結合凝膠電泳顯影或顯色蛋白質不與非標記DNA結合**********RoleofAdaptorTRIFintheMyD88-IndependentToll-LikeReceptorSignalingPathway.MasahiroYamamoto,etal.Science301,640(2003);C：50g/mlpoly(I:C）fortheindicatedperiods.Nuclearextractswereprepared,andNF-kBDNAbindingactivitywasdeterminedbyelectrophoreticmobilityshiftassay(EMSA)usinganNF-B–specificprobe.poly(I:C),建立的基礎：真核細胞的轉錄因子：DNA結合域：DNAbindingdomain,BD轉錄激活域：Activationdomain,AD四、酵母雙雜交系統(tǒng)

yeasttwo-hybridsystem酵母雙雜交技術的原理酵母雙雜交原理圖UASLacZ/His報告基因表達X外源基因

BDGAL4BD外源基因GAL4ADADBD質粒AD質粒表達表達融合蛋白融合蛋白Y

BDXYADYADRNA多聚酶

BDX酵母雙雜交系統(tǒng)的組成與BD融合的蛋白表達載體，表達的蛋白稱誘餌蛋白(bait)與AD融合的蛋白表達載體，表達的蛋白稱靶蛋白(prey或target)帶報告基因(reportgene)的宿主細胞baittargettargetbait酵母雙雜交技術的應用篩選、鑒定蛋白間的相互作用：驗證預測的蛋白間相互作用、鑒定突變對蛋白與蛋白結合的影響、篩選蛋白的級聯(lián)底物。篩選、鑒定小分子與蛋白質之間的相互作用：鑒定干擾相互作用的分子、篩選藥物作用位點及藥物對蛋白相互作用影響。篩選、鑒定核酸與蛋白質之間的相互作用：尋找靶序列的結合蛋白（轉錄因子）。酵母雙雜交技術的特點優(yōu)點：不需要抗體；可直接得到相互作用蛋白的核酸序列；胞內實驗。缺點：篩選工作需要構建基因文庫。假陽性結果比例較高。雙報告基因三報告基因例：用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與NifA（巴西固氮螺菌）相互作用的蛋白質?？茖W通報，2005，50（6）：540-545采用的酵母雙雜交系統(tǒng)：酵母細胞：S.cerevisiaePJ69-4A（clontech公司） 含有3個報告基因:ade2、his3和lacZ，其中ade2基因表達最為嚴謹，his3和lacZ的表達相對松弛。兩個載體pGBD（誘餌）和pGAD（靶蛋白）分別含報告基因trp和leu。實驗步驟：含nifA的誘餌質粒的構建及鑒定

將重組質粒pGBD-nifA轉入釀酒酵母PJ69-4A中,鋪于SD/-Trp,SD/-Trp/-Ade,SD/-Trp/-His+3-AT及SD/-Trp+X-Gal+BU平板上,30℃培養(yǎng)2~5d.

pGBD-nifA轉化子在SD/-Trp和SD/-Trp+X-Gal+BU平板上有正常的菌落長出,但在X-Gal存在下不呈現(xiàn)藍色,而在SD/-Trp/-Ade和SD/-Trp/-His+3-AT平板上沒有菌落長出,延長培養(yǎng)時間,仍然呈陰性結果.這說明誘餌質粒pGBD-nifA不能自動激活報告基因的表達,對宿主菌也沒有毒性作用,因此pGBD-nifA可以用作誘餌質粒.

巴西固氮螺菌Sp7基因文庫的構建提取巴西固氮螺菌Sp7的染色體DNA,用Sau3AⅠ酶切后回收0.5~3kb的DNA片段；然后與經BamHⅠ酶切的3個酵母雙雜合系統(tǒng)的質粒載體pGAD1-C1,pGAD-C2及pGAD-C3分別進行連接(以確保外源片段的正確閱讀),則構建成3個質粒文庫,分別命名為YSPC1,YSCP2和YSCP3。

巴西固氮螺菌Sp7基因文庫的篩選和陽性克隆的鑒定共轉化：將基因組文庫YSPC1,YSPC2和YSPC3分別與誘餌質粒pGBD-nifA共轉化酵母感受態(tài)細胞,從YSPC1,YSPC2和YSPC3三個基因組文庫中共分別得到1.4×106,3×105和3.5×105個共轉化子.篩選陽性克隆：首先將轉化產物鋪于SD/-Leu/-Trp/-Ade選擇培養(yǎng)基上進行篩選,3個文庫轉化物中共有168個菌落表現(xiàn)為Ade+；再將Ade+菌落挑出點種于SD/-Trp/-Leu+X-Gal+BU,SD/-Trp/-Leu/-His和SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His這3種不同的平板上進行篩選.最后,從3個文庫中篩選到對3個報告基因ade2,his3和lacZ均能激活的陽性克隆109個。單倍體酵母的接合酵