蛋白質分離技術層析

蛋白質分離技術層析第一頁，共八十七頁，2022年，8月28日一、概述

1、定義層析(又名色譜)

一種利用混合物中各組分的物理化學性質間的差異，使各組分在層析兩相中以不同程度分配，借此將各組分分離。第二頁，共八十七頁，2022年，8月28日分子極性分子大小分子形狀離子親和力分子親和力吸附能力凝膠層析離子交換層析親和層析2、物理化學性質間的差異吸附層析第三頁，共八十七頁，2022年，8月28日1903年俄國植物學家茨維特發(fā)表了有關填充以菊根粉的玻璃柱分離植物色素，以石油醚沖洗，得到黃色、綠色區(qū)帶;1970s早期高效液相色譜法（HPLC)目前氣相層析儀和HPLC與色譜、質譜以及計算機聯(lián)用。3、層析的發(fā)展第四頁，共八十七頁，2022年，8月28日

層析法進行時有兩個相，一個相稱為固定相，另一相稱為流動相。支持物含待分離物質第五頁，共八十七頁，2022年，8月28日氣相層析液相層析氣-固氣-液

液-固液-液二.層析技術的分類1.按兩相所處的狀態(tài)分類以氣體作為流動相以液體作為流動相第六頁，共八十七頁，2022年，8月28日2.按層析的機制可分為吸附層析分配層析凝膠層析親和層析離子交換層析第七頁，共八十七頁，2022年，8月28日定義指混合物隨流動相通過吸附劑時，由于吸附劑對不同物質的吸附力而使混合物分離的方法。原理

在不同條件下，吸附劑與被吸附物之間的作用物理作用的范德華吸附：無選擇性，吸附速度快，吸附的過程是可逆的化學吸附：由原子價力的作用引起。有選擇性，吸附速度較慢，不易解吸（1）吸附層析

在單位時間內被吸附于吸附劑的某一表面積上的分子和同一單位時間內離開此表面的分子之間可以建立動態(tài)平衡，吸附層析就是不斷地產生平衡與不平衡，吸附與解吸。第八頁，共八十七頁，2022年，8月28日吸附層析常用的吸附劑

硅膠堿性:碳氫化合物中性:醛,酮,醌,酯,內酯酸性:酸性色素,醛,酸聚酰胺氧化鋁

活性炭磷酸鈣粉末:吸附力大,流速慢顆粒:吸附力中,流速易控錦綸-活性炭:吸附力弱錦綸66或錦綸6酰胺基團對酚,DNP-氨基酸,醌,羧酸氫鍵：羥基與羰基唯一用于生物活性物質羥基磷灰石第九頁，共八十七頁，2022年，8月28日（2）分配層析——利用不同組分在流動相和固定相中的分配系數(shù)不同而進行分離的方法。第十頁，共八十七頁，2022年，8月28日柱層析進樣量大且容易回收薄層層析小量樣品，快速，操作簡便3.按制備量分類第十一頁，共八十七頁，2022年，8月28日■層析法的演變過程：圓形濾紙長條濾紙薄層層析(TLC)柱層析容量變大容量更大加展開液第十二頁，共八十七頁，2022年，8月28日紙層析薄層層析第十三頁，共八十七頁，2022年，8月28日三.層析的一般原理

1.分配系數(shù)

表示一種物質在兩種特定相（流動相和固定相）中分配程度。

溶質在固定相中的濃度CsK=————————————=——

溶質在流動相中的濃度Cm?特定的溫度：常數(shù)?K大：被固定相吸附的牢固，隨流動相的移動速度較慢。第十四頁，共八十七頁，2022年，8月28日純化生物物質的純度取決于混合物中各組分K值的差異程度?；旌衔镏懈鹘M分若K值相差較大,則能較易地把混合物中的生物物質分離。反之,K值相差較小,不易把混合物中的生物物質分離。第十五頁，共八十七頁，2022年，8月28日凝膠層析

GelChromatography凝膠過濾（gelfiltration）(Porath,Flodin,1959)分子篩層析（molecularsievechromatography）(Hjertén,Mosbach,1962)排阻層析（exclusionchromatography）(Pedersen,1962)

指混合物隨流動相經固定相的層析柱時，混合物中各組份按其分子大小不同而被分離的技術。第十六頁，共八十七頁，2022年，8月28日一、基本原理

第十七頁，共八十七頁，2022年，8月28日固定相（凝膠）——三維空間網(wǎng)狀結構

Agoodgelforgelfiltrationcontainsabout95%water第十八頁，共八十七頁，2022年，8月28日■凝膠層析法：樣品固定相流動相小分子被延滯小分子大分子較快流出

分子篩效應：分子大小不同,在凝膠受到的阻滯作用有差異,從而造成各組分在凝膠柱中的遷移速度不同得到分離。第十九頁，共八十七頁，2022年，8月28日第二十頁，共八十七頁，2022年，8月28日凝膠層析過程的數(shù)理關系

1、柱床體積(VT)

2、洗脫體積（Ve）即欲分離物質通過層析柱洗脫下來所需洗脫液的總體積。3、外水體積（V0）4、內水體積（Vi）5、凝膠干體積（Vg）

第二十一頁，共八十七頁，2022年，8月28日柱床體積VT凝膠干體積Vg內水體積Vi存在于柱床內凝膠外面空隙之間的水相體積，相應于一般層析法中流動相的體積。顆粒內部所含水相的體積它可從干凝膠顆粒重量和吸水重量相減求得。凝膠體積以及顆粒內外間隙體積的總和。

VT=1/4D2h外水體積V0VT=Vg+V0+Vi數(shù)理關系第二十二頁，共八十七頁，2022年，8月28日

Ve-VoKd=————Vi6、分配系數(shù)（Kd

）：特點：（1）與被分離物質分子的大小和凝膠顆?？紫兜拇笮∮嘘P（2）與柱的長短粗細無關

每個溶質分子在流動相和固定相之間有一個特定的分配系數(shù)（Kd）Ve=Vo+KdVi第二十三頁，共八十七頁，2022年，8月28日(2)Ve=Vo+ViKd=1分子完全不被排阻完全向凝膠顆粒內部擴散在兩相分配的比值為1,最后流出.(1)Ve=VoKd=0分子完全被排阻于凝膠顆粒之外全部分布于流動相里,最先流出。(3)0<Kd<1Ve=Vo+ViKd為溶質以某種程度向凝膠顆粒內擴散

Kd=0

0＜Kd<1

Kd=1洗脫體積第二十四頁，共八十七頁，2022年，8月28日

三.凝膠層析的優(yōu)點

1.凝膠是一種不帶電荷的惰性載體，結構穩(wěn)定。

2.操作條件較溫和。

3.樣品得率高,重復性好,可進行大量樣品的分離純化。四、凝膠層析的缺點1.要求樣品和洗脫液的粘度很低。2.凝膠顆粒網(wǎng)絡孔徑大小非常有限,所以可被純化的物質的分子量范圍受到限制。3.凝膠結構對某些溶質分子具有吸附作用。第二十五頁，共八十七頁，2022年，8月28日五、凝膠的結構

與性能

1.葡聚糖凝膠1959年Porath和Flodin合成（商品名為Sephadex）（1）結構：基本骨架：葡聚糖（dextran）交聯(lián)劑：3-氯代-1,2-環(huán)氧氯丙烷使葡聚糖之間通過醚鍵交聯(lián)聚合而成的三維空間網(wǎng)狀結構。第二十六頁，共八十七頁，2022年，8月28日（2）特點：交聯(lián)度：交聯(lián)劑越多交聯(lián)度越大網(wǎng)孔結構越緊密交聯(lián)劑越少交聯(lián)度越小網(wǎng)孔結構越疏松化學性質：

穩(wěn)定,不溶于水、鹽、弱酸、堿和一般有機溶劑,耐熱耐堿不耐強酸第二十七頁，共八十七頁，2022年，8月28日（2）特點：Sephadex的分級范圍

G10<700G15<1,500G251,000~5,000G-501,500~30,000G-753,000~70,000G1004,000~150,000G1505,000~400,000G2005,000~800,000吸水性G類的型號表示每克干凝膠吸水量（ml）x10如G-50

每克干凝膠吸水量為5ml。第二十八頁，共八十七頁，2022年，8月28日大孔凝膠工作范圍的下限幾乎是Sephadex的上限可分離MW40萬以上的物質可用來分離核酸及病毒。2.瓊脂糖凝膠（商品名為Sepharose)3.聚丙烯酰胺凝膠第二十九頁，共八十七頁，2022年，8月28日■各種層析膠體：PharmaciaSephadexSepharoseSephacrylSephacelglucoseagaroseglucose+acrylamidecelluloseBio-RadBioGelPBioGelAacrylamideagarose第三十頁，共八十七頁，2022年，8月28日六.其它條件選擇

1.柱的選擇柱短而粗,則易使樣品稀釋,柱長而窄,則柱的管壁效應較大,會造成拖尾現(xiàn)象。

2.樣品的選擇：

量適當,粘度小。

3.洗脫液的選擇：每種樣品分離所用的緩沖洗脫液應根據(jù)使樣品穩(wěn)定的原則使用。七、應用1.分離純化

2.脫鹽

3.測分子量第三十一頁，共八十七頁，2022年，8月28日Elutionvolume(ml)AlbuminNaClDesaltinginasimplecolumn第三十二頁，共八十七頁，2022年，8月28日測分子量

VelogMr第三十三頁，共八十七頁，2022年，8月28日實驗：凝膠層析法分離蛋白質第三十四頁，共八十七頁，2022年，8月28日血紅蛋白64,480二硝基苯-魚精蛋白2,000-12,000SephadexG-50孔徑1,500-30,000一、原理：Kd=0Kd=1第三十五頁，共八十七頁，2022年，8月28日1、裝柱

※先用蒸餾水趕走層析柱中的死體積；※凝膠不能有氣泡和分層現(xiàn)象；※裝柱結束后要保持凝膠表面平整。二、操作注意點：第三十六頁，共八十七頁，2022年，8月28日2、加樣※使液面和凝膠表面相切，關閉出口；※加樣時盡量不要破壞凝膠面；※讓樣品進入凝膠以后在加蒸餾水開始洗脫。第三十七頁，共八十七頁，2022年，8月28日血紅蛋白和二硝基苯-魚精蛋白的洗脫體積？柱的外水體積和內水體積三、結果要求：第三十八頁，共八十七頁，2022年，8月28日親和層析

AffinityChromatography

NiPeihua第三十九頁，共八十七頁，2022年，8月28日一、原理親和層析是利用生物大分子所具有的專一親和力而設計的純化技術。尋找配基使配基固定化制成親和層析柱第四十頁，共八十七頁，2022年，8月28日基本過程+固相化第四十一頁，共八十七頁，2022年，8月28日++洗脫吸附第四十二頁，共八十七頁，2022年，8月28日解吸+第四十三頁，共八十七頁，2022年，8月28日樣品固相化

再生第四十四頁，共八十七頁，2022年，8月28日第四十五頁，共八十七頁，2022年，8月28日第四十六頁，共八十七頁，2022年，8月28日酶：基質類似物，抑制劑，輔酶抗體：抗原，病毒，細胞細胞：細胞表面特異蛋白，外源凝集素核酸：互補堿基序列，組蛋白，核酸聚合酶，結合蛋白激素或藥物：受體，載體蛋白外源凝集素：多糖，糖蛋白，細胞表面受體，細胞常見具有專一性親和力的生物分子對：第四十七頁，共八十七頁，2022年，8月28日（一）載體的選擇1、載體要求：（1）不溶性（2）滲透性：疏松網(wǎng)狀結構，有良好的液體流動性（3）化學和機械性能穩(wěn)定（4）具備大量能被活化的基因（5）抗微生物和酶的侵蝕第四十八頁，共八十七頁，2022年，8月28日2、常用載體（1）纖維素特點：價廉、來源充足纖維性、非均一性限制大分子的摻入非專一性吸附嚴重用于抗體和酶的純化（2）葡聚糖凝膠特點：化學及物理性質穩(wěn)定多孔性比瓊脂糖低第四十九頁，共八十七頁，2022年，8月28日

（3）瓊脂糖凝膠濃度商品2％Sepharose2B4%Sepharose4B6%Sepharose6B

凝膠濃度越低結構越疏松即多孔性越高機械強度越低第五十頁，共八十七頁，2022年，8月28日（4）聚丙烯酰胺凝膠（5）多孔玻璃特點：不受微生物的侵蝕耐酸、堿、有機溶劑表面非專一性吸附特點：物理化學性質穩(wěn)定抗微生物侵蝕能力比瓊脂糖強可供化學反應的酰胺基較多第五十一頁，共八十七頁，2022年，8月28日（二）配基的選擇1、對于欲純化的物質應有專一親和力2、必須具備能被修飾的功能基團第五十二頁，共八十七頁，2022年，8月28日以酶和底物為例：E+LELKL=[E][L]/[EL]=[E0-EL][L0-EL]/[EL]E0、L0：起始濃度當L0》E0時KL=[E0-EL][L0]/[EL][EL]=[E0-EL][L0]/KLKd=結合酶/游離酶=[EL]/[E0-EL]=[L0]/KLKLKL：解離常數(shù)E：酶L：底物EL：復合物第五十三頁，共八十七頁，2022年，8月28日（三）固相化——將配體以共價鍵連接于固相基質上制成固相化吸附劑載體的排斥效應載體的空間障礙第五十四頁，共八十七頁，2022年，8月28日二、親和層析分離1、裝柱和平衡2、上樣、親和吸附3、洗脫無效洗脫吸附效率不高有效吸附第五十五頁，共八十七頁，2022年，8月28日洗脫方法（1）非特異性洗脫：改變洗脫液pH值離子強度梯度洗脫（2）特殊洗脫：當?shù)鞍孜骄o密或上述方法洗脫會引起失活，可用專一的化學方法裂解配基與載體的連接鍵，再用透析或凝膠層析法去除配基。斷鍵方法：硫酯鍵、偶氮鍵、二硫鍵（3）專一性洗脫第五十六頁，共八十七頁，2022年，8月28日

已使用過和柱，經過再生處理，去除非特異吸附的雜質后，可重復使用。再生步驟：起始緩沖液重復平衡一次用高離子強度和低離子強度溶液處用弱酸或弱堿溶液處理4、親和柱的再生：第五十七頁，共八十七頁，2022年，8月28日三、特點

1、只需一步純化步驟2、產物非常純3、可從很稀的溶液中純化到所需物質4、還可去除已變性或部分降解物質第五十八頁，共八十七頁，2022年，8月28日四、應用1、分離和純化2、分辨化學或遺傳學上修飾的酶3、純化親和標記的活化中心肽段和蛋白質結構研究4、純化人工合成的多肽和蛋白質5、解釋酶作用機理第五十九頁，共八十七頁，2022年，8月28日實驗

分離豌豆凝集素載體SephdaxG50配基葡聚糖洗脫液1mol/LNaCl特異性洗脫液1mol/LNaCl0.2mol/L葡萄糖第六十頁，共八十七頁，2022年，8月28日1mol/LNaCl雜蛋白1mol/LNaCl0.2mol/L葡萄糖豌豆凝集素活性檢測與兔紅細胞發(fā)生凝集反應第六十一頁，共八十七頁，2022年，8月28日離子交換層析

ionexchangechromatography第六十二頁，共八十七頁，2022年，8月28日一、原理

離子交換層析是用離子交換劑（具有離子交換性能的物質）作固定相，利用它與流動相中的某種離子進行可逆的交換性質來分離子型混合物的層析方法。第六十三頁，共八十七頁，2022年，8月28日低鹽高鹽分離結束第六十四頁，共八十七頁，2022年，8月28日帶電荷不同蛋白在特定pH值下有不同帶電性質第六十五頁，共八十七頁，2022年，8月28日離子交換樹脂如何分離蛋白質洗脫樹脂與樹脂結合力第六十六頁，共八十七頁，2022年，8月28日二、離子交換劑的類型在惰性載體上引入帶有電荷的活性基團（一）按活性功能基團帶電荷性質不同陽離子交換劑——

帶負電荷，與陽離子交換陰離子交換劑——帶正電荷，與陰離子交換?

陰離子交換樹脂對化學試劑及熱都不如陽離子交換樹脂穩(wěn)定。膠體膠體第六十七頁，共八十七頁，2022年，8月28日1.離子交換樹脂：(1)類型聚苯乙烯樹脂：（二）按載體種類不同苯乙烯二乙烯苯聚苯乙烯母體交聯(lián)劑第六十八頁，共八十七頁，2022年，8月28日聚丙烯酸—陽離子交換樹脂甲基丙烯酸二乙烯苯特點：高交換量

pH<8羧基不完全解離第六十九頁，共八十七頁，2022年，8月28日（2）離子交換樹脂的性質①、一般離子交換劑的特性多孔性：疏松、多孔網(wǎng)狀，活性基團在網(wǎng)孔內不溶性：不溶于稀酸、稀堿、有機溶劑穩(wěn)定性：離子交換性：具相當數(shù)量的可交換或帶電基團②、交換量：指交換劑中可交換的離子數(shù)第七十頁，共八十七頁，2022年，8月28日Dowex100149mDowex50297mDowex20840m③

、交聯(lián)度：合成樹脂時所用的交聯(lián)劑在原料總重量中所占的百分比交聯(lián)度越大樹脂的網(wǎng)孔越小膨脹性小交換量少交聯(lián)度越小樹脂的網(wǎng)孔越大膨脹性大交換量大

膨脹性增加易引起樹脂的機械變形破損第七十一頁，共八十七頁，2022年，8月28日陽離子交換樹脂

強酸型磺酸基

-SO3-H+

中等酸型磷酸根

-O-PO2H2

亞磷酸根-O-POH2

弱酸型羧基-COOH陰離子交換樹脂

強堿季胺基團[-N+(CH3)3]

弱堿叔胺、仲胺、伯胺基團

（3）可引入的解離基團第七十二頁，共八十七頁，2022年，8月28日第七十三頁，共八十七頁，2022年，8月28日（4）離子交換樹脂對離子的親和力■離子取代順序：++++++++++++++++++>>電荷高者離子大者濃度大者>第七十四頁，共八十七頁，2022年，8月28日（4）離子交換樹脂對離子的親和力①陽離子樹脂電價數(shù)：Na+<Ca++<Al+++<Ti++++原子價數(shù)相同，原子序數(shù)

Li+<Na+<K+<Pb+②陰離子強堿性交換樹脂CH3COO-<F-<OH-<HCOO-<CL-<SCN-<Br-<CrO4=<NO3-<I-<C2O4=<SO4=弱堿性交換樹脂F(xiàn)-<CL-<Br-=I-=CH3COO<Mo4=<PO4=<NO3-<酒石酸根<檸檬酸根<C2O4=<SO4=<OH第七十五頁，共八十七頁，2022年，8月28日陰離子交換纖維素