藥學(xué)中的生物技術(shù)和方法抗體和免疫分析

藥學(xué)中的生物技術(shù)和方法抗體和免疫分析第一頁，共五十六頁，2022年，8月28日抗體

---生物體自造的“magicbullet”醫(yī)療

直接或與毒素連結(jié)攻擊

病變細(xì)胞研究

各種免疫分析第二頁，共五十六頁，2022年，8月28日抗體藥物銷售趨勢圖第三頁，共五十六頁，2022年，8月28日國際抗體藥物2009年美國市場上的抗體藥物成為生物技術(shù)藥物銷售額最大的類別。2010年美國市場的單抗藥物銷售額為185億美元2011年，全球單抗藥物的市場總量已經(jīng)達(dá)到628億美元，世界范圍內(nèi)的單抗藥物銷份額約是整個(gè)生物制藥市場份額的36%。第四頁，共五十六頁，2022年，8月28日國內(nèi)抗體藥物目前我國的上市抗體品種中,國外進(jìn)口單抗占據(jù)多數(shù)2011年國內(nèi)市場規(guī)模超過10億元我國抗體藥物產(chǎn)業(yè)化的主要限制因素：動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)已成為各個(gè)國家生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)化的核心競爭點(diǎn)抗體下游純化成本已占45%到70%高質(zhì)量純化工藝研究刻不容緩QbD（質(zhì)量源于設(shè)計(jì)）理念的應(yīng)用第五頁，共五十六頁，2022年，8月28日抗體偶聯(lián)藥物(AntibodyDrugConjugates，ADC)結(jié)合單克隆抗體的靶

向性和小分子藥物的

高度細(xì)胞毒性，可以

有效地殺傷腫瘤細(xì)胞，

在臨床前研究、甚至人體臨床研究中，取得了良好的抗腫瘤效果，成為生物藥物研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一;ADC藥物為疾病的“精準(zhǔn)醫(yī)療”提供有效的武器。抗體-藥物偶聯(lián)劑（ADCs）的研究進(jìn)展與產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀第六頁，共五十六頁，2022年，8月28日Antibodyandstructure特點(diǎn)：2個(gè)基因決定一個(gè)蛋白質(zhì)與抗原的結(jié)合力強(qiáng)，高度專一性第七頁，共五十六頁，2022年，8月28日抗原和抗原決定簇一個(gè)抗原分子上可能有數(shù)個(gè)抗原決定簇每個(gè)抗原決定簇至少誘生一種專一性抗體蛋白質(zhì)抗原的決定簇含有六個(gè)以上氨基酸第八頁，共五十六頁，2022年，8月28日

。

第九頁，共五十六頁，2022年，8月28日克隆選擇

學(xué)說第十頁，共五十六頁，2022年，8月28日單抗和多抗多克隆抗體（polyclonalantibody）指由不同B細(xì)胞產(chǎn)生的針對多種抗原決定簇的多種抗體混合物，如免疫血清。單克隆抗體（monoclonalantibody）指由一種

B細(xì)胞生產(chǎn)，針對某一抗原決定簇的單一抗體。第十一頁，共五十六頁，2022年，8月28日Preparationofpolyclonalantibodies傳統(tǒng)抗血清抗原免疫混合抗體123412341234免疫前要先把抗原作成乳劑約在兩月內(nèi)注射五到八次第十二頁，共五十六頁，2022年，8月28日Preparationofmonoclonalantibodies第十三頁，共五十六頁，2022年，8月28日Preparationofrecombinantantibodies淋巴細(xì)胞總RNA抗體輕、重鏈文庫重組單鏈抗體基因輕、重單鏈基因大腸桿菌表達(dá)體系單鏈抗體第十四頁，共五十六頁，2022年，8月28日單鏈抗體在重鏈與輕鏈之間加上一段連接肽，連成一條單鏈如果僅是兩條鏈的可變區(qū)，稱為ScFv連接肽的長度在10-15個(gè)氨基酸左右，不宜太長或太短，它應(yīng)具有柔軟性，側(cè)鏈少，抗原性弱等特點(diǎn)。常用的連接肽是GGGGS×3第十五頁，共五十六頁，2022年，8月28日Abasantigen-PrimaryandsecondaryantibodyPrimaryAbSecondaryAbPrimaryAbProteinA二抗針對一抗的物種特異性ProteinA針對所有動(dòng)物抗體Fc第十六頁，共五十六頁，2022年，8月28日ImmunoassaysThemostimportantbiologicalassaysfor:Identificationofproteinsandsmallbio-moleculesQuantificationforcomplexbiologicalsamplewithoutseparationPowerfulseparationHighsensitivity,specificityandaccuracy

第十七頁，共五十六頁，2022年，8月28日抗體的標(biāo)記方法放射性同位素標(biāo)記酶標(biāo)記熒光標(biāo)記有機(jī)分子熒光標(biāo)記綠色熒光蛋白標(biāo)記稀土熒光標(biāo)記通用標(biāo)記第十八頁，共五十六頁，2022年，8月28日放射性碘標(biāo)記第十九頁，共五十六頁，2022年，8月28日HRP酶標(biāo)記簡單化學(xué)偶聯(lián)方法：

1．過碘酸鈉法：

僅用于HRP的標(biāo)記。HRP是一種糖蛋白，過碘酸鈉可將與酶活性無關(guān)的多糖羥基氧化為醛基，再與抗體蛋白的游離氨基結(jié)合，結(jié)合反應(yīng)后，再加人硼氫化鈉(NaHB4)還原后，形成穩(wěn)定的HRP—CH2—NH—IgG酶標(biāo)記物。為防止酶蛋白氨基與醛基反應(yīng)發(fā)生自身偶聯(lián)，常在標(biāo)記前知用二硝基氟苯(DNFB)封閉酶蛋白上的α和ε氨基。

2．戊二醛交聯(lián)標(biāo)記法：

戊二醛具有兩個(gè)活性醛基，分別與酶分子和抗體分子上的氨基結(jié)合。NaHB4HRP第二十頁，共五十六頁，2022年，8月28日LabelingwithisoFITC第二十一頁，共五十六頁，2022年，8月28日GFPlabelingGFPgeneScFvgeneVectorexpressionGFPgeneProteinAgeneVectorexpressionAb-Fc第二十二頁，共五十六頁，2022年，8月28日通用標(biāo)記+Avidin/streptA+Anti-digoxinAb2ndAbProteinAPrimaryAbPrimaryAb第二十三頁，共五十六頁，2022年，8月28日ImportantassaysImmunostainingWesternblotFluorescentmicroscopyQuantificationofimmunostainingQuantitativeassays:Radioimmunoassay,RIA—competentbindingFluorescenceimmunoassay,FIAFPIA---homogeneousassayTRFIAEnzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA第二十四頁，共五十六頁，2022年，8月28日ImmunostainingFluorescence/luminescenceColorizationor第二十五頁，共五十六頁，2022年，8月28日組織切片或培養(yǎng)細(xì)胞單層細(xì)胞/組織固定免疫染色（熒光）顯微鏡觀察第二十六頁，共五十六頁，2022年，8月28日免疫熒光標(biāo)記的c-Mycphalloidin熒光標(biāo)記的微絲熒光染色的細(xì)胞核合成圖像第二十七頁，共五十六頁，2022年，8月28日Immunoblot---WesternBlot第二十八頁，共五十六頁，2022年，8月28日ElectroblottinggelPVDFmembrane第二十九頁，共五十六頁，2022年，8月28日Immunostaining封閉分析抗體顯色抗體顯色數(shù)字化灰度圖像分析第三十頁，共五十六頁，2022年，8月28日0.51246812162430(h)c-mycp53CyclinD1Actin第三十一頁，共五十六頁，2022年，8月28日CaNCaM:La3+HRPStreptAvidinBiotin第三十二頁，共五十六頁，2022年，8月28日RIAAssay第三十三頁，共五十六頁，2022年，8月28日免疫競爭結(jié)合分析---小分子抗原分析的基本方法Ag+AbAgAb+Ag

+

*

Ag

*AgAb+*Ag[*AgAb:Precipitant↓]放射性計(jì)數(shù)第三十四頁，共五十六頁，2022年，8月28日常用分離沉淀技術(shù)鹽析法：飽和硫酸銨、硫酸鈉聚乙二醇法（w=6000）特點(diǎn)：快速，價(jià)廉，來源方便，受環(huán)境影響大抗體免疫沉淀法特點(diǎn)：分離完全，非特異結(jié)合小，環(huán)境影響小，效價(jià)高，但成本高固相吸附劑第三十五頁，共五十六頁，2022年，8月28日RIA測量步驟恒量的*Ag、Ab加入反應(yīng)管中加入待測樣品、或標(biāo)準(zhǔn)品（已知濃度）37℃或4℃溫育加入分離劑分離結(jié)合及游離部分測定以總放射性為分母，測定*AgAb為分子，計(jì)算結(jié)合%，以結(jié)合率為縱坐標(biāo)，濃度為坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線待測樣品的結(jié)合率從標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出濃度第三十六頁，共五十六頁，2022年，8月28日第三十七頁，共五十六頁，2022年，8月28日Calibrationcurve第三十八頁，共五十六頁，2022年，8月28日ELISA（EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay）第三十九頁，共五十六頁，2022年，8月28日SandwichELISA競爭法（略）第四十頁，共五十六頁，2022年，8月28日HighConvenienceHighSensitivity第四十一頁，共五十六頁，2022年，8月28日96-wellplate包被封閉結(jié)合顯色酶標(biāo)儀測定hv洗滌洗滌洗滌終止第四十二頁，共五十六頁，2022年，8月28日酶的底物

鄰苯二胺(OPD)+H2O2

TMBABTSHRP的底物氧化產(chǎn)物(橙紅色)492nm吸收2mol/L硫酸終止反應(yīng)AP的底物硝基苯磷酸酯對硝基酚(黃色)NaOH終止反應(yīng)

405nm吸收峰磷酸4-甲基傘酮（熒光底物）第四十三頁，共五十六頁，2022年，8月28日熒光偏振免疫分析第四十四頁，共五十六頁，2022年，8月28日PrincipleoffluorescencepolarizationemittingdipoleabsorbingdipoleexcitationlightpolarizedalongzxzyIIdetector第四十五頁，共五十六頁，2022年，8月28日FluorescencepolarizationimmunoassayAg+AbAgAb+Ag

+

*

Ag

*AgAb+*Ag

HighpolarizedfluorescenceLowpolarizedfluorescence第四十六頁，共五十六頁，2022年，8月28日偏振度r第四十七頁，共五十六頁，2022年，8月28日時(shí)間分辨熒光免疫分析第四十八頁，共五十六頁，2022年，8月28日熒光物質(zhì)熒光壽命(ns)熒光物質(zhì)熒光壽命(ns)非特異熒光背景1～10Sm3+-β-NTA65000人血清蛋白4.1Sm3+-PTA60000球蛋白3.0Eu3+-β-NTA714000細(xì)胞色素C3.5Eu3+-PTA925000FITC4.5Tb3+-PTA96000丹黃酰氯14Dy3+-PTA1000羅丹明B3.0熒光背景和常用探針分子的熒光壽命第四十九頁，共五十六頁，2022年，8月2