普通微生物第七章病毒

第一節(jié)概述第二節(jié)病毒學研究的基本方法第三節(jié)毒粒的性質(zhì)第四節(jié)病毒的復制第一頁，共六十九頁。第一節(jié)概述一、病毒的發(fā)現(xiàn)和研究歷史1886年，A.Mayer發(fā)現(xiàn)具有傳染性的煙草花葉??；1892年，D.Ivanovsky發(fā)現(xiàn)煙草花葉病病原體能通過濾器：

一種能通過濾器的“細菌毒素”或極小的細菌1898年，MWBeijerinck對煙草花葉病病原體的研究結果：能通過細菌濾器；可被乙醇沉淀而不失去其感染性；能在瓊脂凝膠中擴散；用培養(yǎng)細菌的方法不能被培養(yǎng)出來，推測只能在植物活細胞中生活；比細菌小的具有傳染性的活的流質(zhì)第二頁，共六十九頁。1900年前后，包括口蹄疫（footandmouthdisease）在內(nèi)的多種動植物疾病病原體的濾過性特性被證明。Filterableviruses(濾過性病毒）viruses（病毒）FWTwort(1915年）、Fd’Herelle(1917年），分別發(fā)現(xiàn)細菌（Shigelladysenteriae）病毒bacteriophagesPhago:“toeat”噬菌體（phage）1935年，WMStanley首次提純并結晶了煙草花葉病毒；

Bawden等證明煙草花葉病毒的本質(zhì)為核蛋白；1940年，Kausche首先用電鏡觀察到煙草花葉病毒顆粒；1946年獲諾貝爾化學獎第三頁，共六十九頁。第四頁，共六十九頁。病毒學（virology）：研究病毒（virus）的本質(zhì)及其與宿主的相互作用的科學，是微生物學的重要分支學科。極大地豐富了現(xiàn)代生物學（微生物學、分子生物學、分子遺傳學）的理論與技術；病毒病害的控制與治療；生物防治；生物高新技術產(chǎn)業(yè)；第五頁，共六十九頁。二、病毒的特點和定義1.特點1）不具有細胞結構，具有一般化學大分子的特征。例如一些簡單的病毒僅由核酸和蛋白質(zhì)外殼構成，故可把它們視為核蛋白分子。2）一種病毒的毒粒內(nèi)只含有一種核酸，DNA或RNA。朊蛋白（prion）甚至僅由蛋白質(zhì)構成？3）沒有酶或酶系極不完全，不含催化能量代謝的酶，不能進行獨立的代謝作用。4）嚴格的活細胞內(nèi)寄生，沒有自身的核糖體，沒有個體生長，也不進行二分裂，必須依賴宿主細胞進行自身的核酸復制，形成子代。5）個體微小，在電子顯微鏡下才能看見。6）對大多數(shù)抗生素不敏感，對干擾素敏感。第六頁，共六十九頁。病毒是一類既具有化學大分子屬性，又具有生物體基本特征；既具有細胞外的感染性顆粒形式，又具有細胞內(nèi)的繁殖性基因形式的獨特生物類群。超顯微的、沒有細胞結構的、專性活細胞內(nèi)寄生的實體第七頁，共六十九頁。表7-1病毒與單細胞微生物性質(zhì)比較A：一部分DNA和RNA病毒；b：利福平可抑制痘病毒復制P163第八頁，共六十九頁。2.定義迄今為止仍無一個科學而嚴謹?shù)亩x病毒為具有獨立于其宿主的進化史的絕對細胞內(nèi)寄生物，它的DNA或RNA基因組被其所編碼的蛋白質(zhì)殼體化。（Fields等，1990年）（真）病毒：至少含有核酸和蛋白質(zhì)二種組分類病毒：只含有侵染性的RNA組分亞病毒衛(wèi)星病毒：只含有不具侵染性的RNA組分朊病毒：只含蛋白質(zhì)（？）病毒非細胞生物第九頁，共六十九頁。2.定義迄今為止仍無一個科學而嚴謹?shù)亩x病毒為具有獨立于其宿主的進化史的絕對細胞內(nèi)寄生物，它的DNA或RNA基因組被其所編碼的蛋白質(zhì)殼體化。（Fields等，1990年）由一個或數(shù)個RNA或DNA分子構成的感染性因子，通常（但非必需）覆蓋有由一種或數(shù)種蛋白質(zhì)構成的外殼，有的外殼外還有更為復雜的膜結構；這些因子能將其核酸從一個宿主細胞傳遞給另一個宿主細胞；它們能利用宿主的酶系統(tǒng)進行細胞內(nèi)的復制；有些病毒還能將其基因組整合入宿主細胞DNA，依靠這種機制，或是導致持續(xù)性感染發(fā)生，或是導致細胞轉化，腫瘤形成。第十頁，共六十九頁。三、病毒的宿主范圍病毒幾乎可以感染所有的細胞生物，并具有宿主特異性噬菌體（phage）植物病毒（plantviruses)動物病毒（animalviruses)第十一頁，共六十九頁。第二節(jié)病毒學研究的基本方法一、病毒的分離與純化通過病毒的分離與純化獲得有感染性的病毒制備物是病毒學研究和實踐的基本技術。二元培養(yǎng)物第十二頁，共六十九頁。1、病毒的分離用于分離病毒的標本應含有足夠量的活病毒；確定最適采集時間和標本處理的方法；加入抗生素除菌或用離心和過濾方法處理；研磨或超聲波處理破碎細胞立即接種、注意保存1）標本的采集與處理2）標本接種與感染表現(xiàn)標本接種于何種實驗宿主（動物、植物、細菌）、雞胚或細胞培養(yǎng)以及選擇何種接種途徑主要取決于病毒的宿主范圍和組織嗜性，同時應考慮操作簡單、易于培養(yǎng)、所產(chǎn)生的結果容易判定等要求。第十三頁，共六十九頁。噬菌體細菌培養(yǎng)物培養(yǎng)液營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)液變得清亮細菌平板成為殘跡平板第十四頁，共六十九頁。動物病毒實驗動物雞胚多種細胞培養(yǎng)第十五頁，共六十九頁。植物病毒敏感植物葉片產(chǎn)生壞死斑（枯斑）第十六頁，共六十九頁。2、病毒的純化病毒是有感染性的生物體純化的病毒制備物應保持其感染性病毒具有化學大分子的屬性純化的病毒制備物的理化性質(zhì)應具有均一性標準主要化學組分為蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)提純的方法方法具有一定的大小、形狀和密度差速離心超速離心（鹽析、等電點沉淀、有機溶劑沉淀、凝膠層析、離子交換等）第十七頁，共六十九頁。二、病毒的測定病毒的定量分析理化性質(zhì)免疫學性質(zhì)與宿主或宿主細胞的相互作用第十八頁，共六十九頁。病毒的物理顆粒計數(shù)病毒的感染性測定（EM）噬斑測定終點法第十九頁，共六十九頁。第三節(jié)毒粒的性質(zhì)毒粒（病毒顆粒）：病毒的細胞外顆粒形式，也是病毒的感染性形式。毒粒是一團能夠自主復制的遺傳物質(zhì)，它們被其自身編碼的蛋白質(zhì)外殼所包圍，有的還具有包膜，以保護其遺傳物質(zhì)免遭環(huán)境破壞，并作為將遺傳物質(zhì)從一個宿主細胞傳遞給另一個宿主細胞的載體第二十頁，共六十九頁。一、毒粒的形態(tài)結構1、毒粒的大小和形狀個體小，必須在電鏡下觀察；不同病毒的毒粒大小差別很大形狀：球形顆粒（或稱擬球形顆粒）桿狀顆粒復雜形狀顆粒（如蝌蚪狀、卵形）第二十一頁，共六十九頁。2、毒粒的殼體結構殼體或衣殼：包圍著病毒核酸的蛋白質(zhì)外殼，由蛋白質(zhì)亞基按對稱的形式，有規(guī)律地排列而成，是病毒毒粒的基本結構。殼體結構類型螺旋對稱二十面體對稱雙對稱第二十二頁，共六十九頁。螺旋對稱殼體：蛋白質(zhì)亞基有規(guī)律地沿著中心軸（核酸）呈螺旋排列，進而形成高度有序、對稱的穩(wěn)定結構。第二十三頁，共六十九頁。二十面體對稱殼體：蛋白質(zhì)亞基圍繞具立方對稱的正多面體的角或邊排列，進而形成一個封閉的蛋白質(zhì)的鞘。第二十四頁，共六十九頁。具有雙對稱結構的典型例子是有尾噬菌體，其殼體有頭部和尾部組成，包裝有病毒核酸的頭部為變形的二十面體對稱，尾部呈螺旋對稱結構。第二十五頁，共六十九頁。3、毒粒的包膜結構核殼：病毒顆粒的殼體與核心一起構成的復合物裸露毒粒：僅由核（衣）殼構成的病毒顆粒包膜：僅出現(xiàn)在有包膜的病毒核衣殼外的一層脂蛋白膜，是病毒以出芽方式成熟時，由細胞膜衍生而來。作用：保護病毒核殼；啟動病毒感染。第二十六頁，共六十九頁。第二十七頁，共六十九頁。第二十八頁，共六十九頁。4、毒粒的結構類型四種主要結構類型裸露的二十面體毒粒裸露的螺旋毒粒有包膜的二十面體毒粒有包膜的螺旋毒粒第二十九頁，共六十九頁。第三十頁，共六十九頁。第三十一頁，共六十九頁。復雜病毒昆蟲多角體病毒痘病毒：較大，光鏡下勉強可見第三十二頁，共六十九頁。二、毒粒的化學組成核酸蛋白質(zhì)聚胺類化合物無機陽離子毒粒（化學組成）基本化學組成脂類糖類有包膜病毒和某些無包膜病毒病毒顆粒在化學上表現(xiàn)為核蛋白第三十三頁，共六十九頁。1、病毒的核酸核酸是病毒的遺傳物質(zhì)；一種病毒的毒粒只含有一種核酸：DNA或RNA；除逆轉錄病毒外，其他病毒基因組都是單倍體。第三十四頁，共六十九頁。DNARNA雙鏈RNA單鏈RNA單負鏈RNA單正鏈RNA雙鏈DNA單鏈DNA病毒核酸的類型個別病毒的RNA是雙意的，即部分正極性、部分為負極性第三十五頁，共六十九頁。病毒核酸的結構特征不同病毒的核酸均可能具有各自不同的結構特征黏性末端循環(huán)排列末端重復序列λ噬菌體第三十六頁，共六十九頁。病毒核酸的結構特征第三十七頁，共六十九頁。2、病毒的蛋白質(zhì)病毒基因組編碼的，在病毒復制過程中產(chǎn)生并具有一定功能，但不結合于毒粒中的蛋白質(zhì)構成一個形態(tài)成熟的有感染性的病毒顆粒所必需的蛋白質(zhì)病毒的蛋白質(zhì)非結構蛋白結構蛋白殼體蛋白包膜蛋白毒粒酶保護作用啟動感染表面抗原決定感染的特異性參與病毒的入侵或復制第三十八頁，共六十九頁。第四節(jié)病毒的復制病毒是嚴格胞內(nèi)寄生物，只能在活細胞內(nèi)繁殖細胞有繁殖性的病毒基因組（有感染性的毒粒消失）病毒核酸和蛋白質(zhì)病毒基因組復制、表達裝配成有感染性的毒粒胞外第三十九頁，共六十九頁。一、病毒的復制周期1、一步生長曲線1939年，MaxDelbruck&EmoryEllisE.coli/bacteriophage該實驗標志著分子病毒學、分子生物學和分子遺傳學的建立。MaxDelbruck因此獲1969年的NobelPrize。以適量的病毒接種處于標準培養(yǎng)的高濃度的敏感細胞（比例一般為1:10）；待病毒吸附后，以病毒抗血清處理病毒-細胞培養(yǎng)物，以中和未吸附的噬菌體；將上述混合物，以培養(yǎng)液進行高倍稀釋，以防止第二次吸附和感染；培養(yǎng)后，定時取樣測定培養(yǎng)物中的病毒效價（噬斑測定）；以感染時間為橫坐標，病毒的感染效價為縱坐標，繪制出病毒特征性的繁殖曲線。第四十頁，共六十九頁。第四十一頁，共六十九頁。取培養(yǎng)物直接測定病毒數(shù)量將培養(yǎng)物過濾去細胞后測定病毒數(shù)量將細胞裂解后測定病毒的數(shù)量。前期可將培養(yǎng)物先離心去上清以消除未吸附病毒的影響第四十二頁，共六十九頁。潛伏期：毒粒吸附于細胞到受染細胞釋放出子代毒粒所需的最短時間。隱蔽期：自病毒在受染細胞內(nèi)消失到細胞內(nèi)出現(xiàn)新的感染性病毒的時間隱蔽期病毒在細胞內(nèi)存在的動力學曲線呈線性函數(shù)，而非指數(shù)關系，從而證明子代病毒顆粒是由新合成的病毒基因組與蛋白質(zhì)經(jīng)裝配成熟，而不是通過雙分裂方式產(chǎn)生。第四十三頁，共六十九頁。裂解量：每個受染細胞所產(chǎn)生的子代病毒顆粒的平均數(shù)目，其值等于潛伏期受染細胞的數(shù)目被除以穩(wěn)定期受染細胞所釋放的全部子代病毒數(shù)目，即等于穩(wěn)定期病毒效價與潛伏期病毒效價之比。第四十四頁，共六十九頁。3、復制周期/復制循環(huán)自病毒吸附于細胞開始，到子代病毒從感染細胞釋放到細胞外的病毒復制過程。1）吸附；2）侵入；3）脫殼；4）病毒大分子的合成，包括病毒基因組的表達與復制；

5）裝配與釋放。病毒感染的起始第四十五頁，共六十九頁。二、病毒感染的起始1、吸附：決定病毒組織親嗜性靜電結合：病毒吸附蛋白，非特異性吸附，可逆的特異性結合：病毒配體與細胞受體結合第四十六頁，共六十九頁。分別吸附于大腸桿菌性毛和菌體上的噬菌體第四十七頁，共六十九頁。動物宿主細胞及細菌表面病毒受體的存在可通過生化、遺傳等實驗證明但至今仍未發(fā)現(xiàn)植物病毒的細胞受體存在第四十八頁，共六十九頁。2、侵入：又稱內(nèi)化，它是一個病毒吸附后幾乎立即發(fā)生，依賴于能量的感染步驟。不同的病毒—宿主系統(tǒng)的病毒侵入機制不同第四十九頁，共六十九頁。有尾噬菌體注射方式將核酸注入細胞第五十頁，共六十九頁。1）裸露病毒直接穿過細胞膜的移位方式3）包膜病毒通過細胞的內(nèi)吞功能2）毒粒包膜與細胞質(zhì)膜的融合第五十一頁，共六十九頁。植物病毒通過人為或自然的機械損傷所形成的微傷口進入細胞；或者靠攜帶有病毒的媒介，主要是靠有吮吸式口器的昆蟲取食將病毒帶入細胞。植物病毒一旦進入細胞后，增殖產(chǎn)生的子代病毒或病毒核酸可通過病毒編碼的運動蛋白與胞間連絲的相互作用從受染細胞進入鄰近細胞。第五十二頁，共六十九頁。3、脫殼：病毒侵入后，病毒的包膜和/或殼體除去而釋放出病毒基因組的過程，它是病毒基因組進行復制和功能表達所必需的感染事件。T-偶數(shù)噬菌體脫殼與侵入是一起發(fā)生的。動物病毒存在不同的結構類型和不同的侵入方式，其脫殼過程也較復雜。病毒的毒粒消失，失去原有的感染性，進入潛隱期。第五十三頁，共六十九頁。病毒在細胞內(nèi)能否復制的關鍵細胞溶酶體酶、脫殼酶的參與第五十四頁，共六十九頁。三、病毒大分子的合成病毒基