酶活性濃度的測定技術

酶活性濃度的測定技術第一頁，共七十二頁，2022年，8月28日第四節(jié)酶活性濃度的測定技術

第二頁，共七十二頁，2022年，8月28日體液中酶的測定是臨床生物化學檢驗的一項重要內(nèi)容。二十世紀50年代人們用分光光度法建立了連續(xù)監(jiān)測酶活性濃度方法，到60年代特別是80年代以后，由于各種工具酶和酶分析試劑盒的生產(chǎn)與普及，自動和半自動生物化學分析儀的引進和應用，使得各種體液酶的測定在方法學與臨床應用方面有了長足的進步與發(fā)展。第三頁，共七十二頁，2022年，8月28日一、概述正常人血中大部分酶一般在pg（10-12克）到ng（10-9克）水平，要直接測定這種微量酶蛋白是十分困難的。常用的酶學測定方法則利用酶有加速化學反應（催化）的特性，通過測定被加速化學反應的反應速率，根據(jù)酶促反應中底物的減少量或產(chǎn)物的生成量來計算酶活性濃度的高低。這種濃度的確切名稱是“酶的催化活性濃度”或簡稱為“酶活性濃度”。第四頁，共七十二頁，2022年，8月28日按監(jiān)測方法分類可分為量氣法、分光光度法、熒光法和放射性核素法、電極法和其他方法。以分光光度法最為常用。第五頁，共七十二頁，2022年，8月28日1．量氣法測定原理是通過測量一封閉反應系統(tǒng)中氣體變化后的氣體體積或壓力，從而計算出氣體的變化量。適用于測定那些在反應中產(chǎn)生或消耗氣體的酶，如氧化酶反應涉及氧氣的消耗，脫羧酶會產(chǎn)生二氧化碳等。此法操作煩瑣，靈敏度低且技術要求高，臨床實驗室很少采用。第六頁，共七十二頁，2022年，8月28日2．分光光度法從50年代起采用分光光度法取代比色法，其最大優(yōu)點在于擴大了測定范圍，波長范圍更寬。酶促反應的底物與產(chǎn)物結(jié)構(gòu)不同，光吸收譜也有差異，不僅能在可見光范圍測定有色溶液的濃度，還能在紫外光波長范圍測定特異的帶有雙鍵或環(huán)狀結(jié)構(gòu)的無色物質(zhì)。第七頁，共七十二頁，2022年，8月28日結(jié)合各種工具酶的偶聯(lián)反應，如應用NAD(P)H和NAD(P)＋吸收光譜差異建立的測定各種脫氫酶活性濃度的方法，使分光光度法得到了進一步發(fā)展，幾乎可應用于各種血清酶活性的測定。隨著各種自動生物化學儀和配套用試劑盒的普及應用，這一方法在臨床酶學測定中起著十分重要的作用。第八頁，共七十二頁，2022年，8月28日3．熒光法和放射性核素法對于一些酶濃度很低的標本，用普通的分光光度法往往測不出來，此時可考慮改用靈敏度較高的熒光法或放射性核素法。第九頁，共七十二頁，2022年，8月28日熒光法取決于酶促反應生成熒光物質(zhì)的速率，此速率與酶濃度成正比，并通過熒光光度計進行測定，根據(jù)熒光強弱的變化換算出酶的活性。例如，還原型的NAD(P)H有強烈的熒光，故所有以NAD(P)＋為輔酶的氧化還原酶類均可用熒光法進行測定。核素法因有污染且操作煩雜，目前應用較少。第十頁，共七十二頁，2022年，8月28日4．其他方法當酶促反應涉及酸堿變化時，可用pH儀或電位滴定儀測定酸堿度變化來計算酶濃度。這類方法需要一定儀器，操作麻煩。此外，各種電極法、旋光法、極譜法、高效液相色譜法或生物發(fā)光法等也可用于測定特定的酶或進行酶學研究。第十一頁，共七十二頁，2022年，8月28日Note極譜法（polarography）通過測定電解過程中所得到的極化電極的電流-電位（或電位-時間）曲線來確定溶液中被測物質(zhì)濃度的一類電化學分析方法。第十二頁，共七十二頁，2022年，8月28日二、酶活性濃度測定方法測定酶的催化活性濃度是臨床酶學分析最為常用的方法，具有迅速、靈敏、成本低等特點?？筛鶕?jù)酶促反應進程曲線，采用合理的方法進行酶活性濃度的測定。第十三頁，共七十二頁，2022年，8月28日（一）酶促反應進程如將酶促反應過程中測得的產(chǎn)物[P]或底物[S]變化量對時間作圖，可得酶促反應時間進程曲線（圖6-2）。圖中產(chǎn)物[P]或底物[S]變化曲線的斜率就代表酶促反應的速率。第十四頁，共七十二頁，2022年，8月28日第十五頁，共七十二頁，2022年，8月28日大多數(shù)酶促反應進程曲線表明，在酶促反應一開始的階段，底物[S]濃度不斷下降，隨之有相應產(chǎn)物[P]產(chǎn)生。但由于各種因素的影響，反應速率比較慢，這段時間稱為延滯期（1agphase），可以是幾秒至幾分鐘。尤其是雙底物反應或需要輔酶參與者，通常為1～3min。第十六頁，共七十二頁，2022年，8月28日隨后在過量的底物存在下，反應速率加快并達到一個反應速率穩(wěn)定的階段，即酶促反應以恒定的速率進行，不受底物濃度的影響，這段反應稱為線性反應期（1inearphase）或零級反應期（zeroorder）。產(chǎn)物[P]和底物[S]與時間t成線性關系。第十七頁，共七十二頁，2022年，8月28日隨著時間的延長，由于種種因素，如底物因酶反應消耗而濃度下降，產(chǎn)物濃度上升出現(xiàn)逆反應，反應產(chǎn)物可能有抑制酶反應作用或酶的熱失活等，使酶促反應變慢，即反應速率下降，偏離線性，這段時間稱為一級反應期（firstorder）。第十八頁，共七十二頁，2022年，8月28日反應速率與底物[S]成正比，產(chǎn)物[P]與時間t不成線性關系。如果反應速率受兩種或兩種以上物質(zhì)濃度的影響，則反應可為一級、二級或多級反應，一般將這段反應時間統(tǒng)稱為非線性反應期。圖6-3顯示單試劑速率法酶促反應進程曲線。第十九頁，共七十二頁，2022年，8月28日第二十頁，共七十二頁，2022年，8月28日為了計算酶活性濃度，必須根據(jù)線性反應期的反應速率才能準確計算出酶活性濃度，否則將導致誤差。在延滯期、非線性反應期所測得的結(jié)果不準確，一般結(jié)果偏低。第二十一頁，共七十二頁，2022年，8月28日（二）酶活性濃度測定方法酶活性濃度測定就是要使酶促反應的初速度（v）達到最大速度Vmax，即在過量底物存在下的零級反應期的速度，此時反應速度與酶濃度[E]之間有線性關系。第二十二頁，共七十二頁，2022年，8月28日如按反應時間將酶活性濃度測定方法進行分類，可分為定時法（fixedtimeassay）和連續(xù)監(jiān)測法（continuousmonitoringassay）兩大類。第二十三頁，共七十二頁，2022年，8月28日1．定時法這是早期測定酶活性濃度的方法。大多是使酶作用一段時間，然后加入強酸、強堿、蛋白沉淀劑等終止酶促反應，測定這段時間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的生成量，計算酶促反應平均速度。第二十四頁，共七十二頁，2022年，8月28日這類方法有多種命名，如“取樣法”、“終點法”或“兩點法”。用此類方法測定酶活性濃度，必須保證酶和底物在所選定的溫度下作用時間要很精確，否則會引起較大誤差。第二十五頁，共七十二頁，2022年，8月28日這種方法的優(yōu)點是比較簡單，因測定時酶促反應已被終止，故比色計或分光光度計無需保溫設備，顯色劑的選擇也可不考慮對酶活性的影響。缺點是無法知道在整個酶促反應進程中是否都是零級反應。第二十六頁，共七十二頁，2022年，8月28日圖6-4顯示定時法中酶促反應的三種可能過程。雖然從t1到t2三種反應所生成的產(chǎn)物量相同，但實際反應過程有很大差別。曲線1說明酶促反應速率接近終點時已經(jīng)減慢，曲線2說明在反應早期存在延滯期。只有曲線3時，用定時法可以準確測定代表酶活性濃度的反應速率。第二十七頁，共七十二頁，2022年，8月28日第二十八頁，共七十二頁，2022年，8月28日因此，用定時法準確測定酶活性濃度，必須了解不同酶促反應速率和時間的關系，應先做預試驗找出酶促反應速率恒定的時期，確定線性時間，然后在這段時間進行測定，避開延滯期和一級反應。第二十九頁，共七十二頁，2022年，8月28日2．連續(xù)監(jiān)測法連續(xù)測定酶反應過程中某一反應產(chǎn)物或底物的濃度隨時間變化的多點數(shù)據(jù)，求出酶反應初速度，間接計算酶活性濃度的方法稱為連續(xù)監(jiān)測法。與定時法不同的是，這類方法勿需停止酶促反應，不需添加其他呈色試劑，就可測定反應物的變化，很容易觀察到反應的整個過程。在以往的一段時期里，常把這類方法稱為“動力學法”或“速率法”。第三十頁，共七十二頁，2022年，8月28日這類測定方法簡單，優(yōu)點是可將多點的測定結(jié)果連接成線，很容易找到成直線的區(qū)段，以觀察到是否偏離零級反應，因而可選擇線性反應期來計算酶活性，不需終止反應。通常截取反應開始后較短的時間，就能近似地建立這種反應量與反應時間的線性關系，不過這種時間范圍因酶種類和反應條件而異，必須用實驗方法進行確定。第三十一頁，共七十二頁，2022年，8月28日連續(xù)監(jiān)測法測定結(jié)果常較定時法高，且因在酶促反應初始階段底物最充裕，而產(chǎn)物的抑制作用、可逆反應、酶變性等均很小，因而測定結(jié)果也較取樣法準確。第三十二頁，共七十二頁，2022年，8月28日三、連續(xù)監(jiān)測法測定酶活性濃度隨著科學技術的不斷進步與發(fā)展，各種自動生物化學分析儀的廣泛使用，連續(xù)監(jiān)測法已逐步取代定時法而成為臨床實驗室測定酶活性濃度最常用的方法。第三十三頁，共七十二頁，2022年，8月28日（一）連續(xù)監(jiān)測法的種類1．直接法這類方法是在不終止酶促反應條件下，直接通過測定反應體系中底物或產(chǎn)物理化特性的變化如吸光度、熒光、旋光性、pH、電導率、粘度等，從而計算出酶活性濃度。第三十四頁，共七十二頁，2022年，8月28日其中以分光光度法應用最為廣泛，也是方法學上最成熟的一種。利用NAD(P)H在340nm處的吸光度的變化測定各種脫氫酶的方法是應用最廣的一類方法。NAD(P)H在260nm波長和340nm波長處有吸收峰，而氧化型NAD＋／NADP＋只在260nm波長處有吸收峰，這是因為分子中有腺嘌呤的緣故。340nm波長處吸光度的變化可以反映反應體系中NAD(P)H量的增減。A+NAD(P)＋B+NAD(P)H脫氫酶第三十五頁，共七十二頁，2022年，8月28日還可利用一類人工合成的所謂“色素原”底物，其本身為無色或微黃色，酶作用后生成有色化合物，如目前應用硝基苯酚和硝基苯胺的衍生物進行水解酶和一些還原酶的測定。ABC酶促反應顯色反應第三十六頁，共七十二頁，2022年，8月28日2．間接法直接法雖然簡單，但只有底物與產(chǎn)物之間，在理化性質(zhì)等方面有顯著差異時，才能使用直接法。故至今也只有很少一部分酶能用直接法進行測定。目前可采用兩類間接法進行酶學測定。第三十七頁，共七十二頁，2022年，8月28日一類方法是在原來反應體系中加入一些試劑，這些試劑只和酶反應物迅速作用，產(chǎn)生可被儀器檢出的物質(zhì)變化，但同時又不和酶作用也不影響酶活性。典型的例子是血清ChE（膽堿酯酶）的丁酰硫代膽堿測定法。另一類是目前應用最多，最為廣泛的酶偶聯(lián)法，即在原反應體系中加入另一些酶試劑，所進行的酶促反應和被測酶反應偶聯(lián)起來。第三十八頁，共七十二頁，2022年，8月28日（二）酶偶聯(lián)反應最簡單的酶偶聯(lián)反應（單底物反應且只有一個工具酶）模式為：ABC被測定酶（Ex）催化的反應稱為始發(fā)反應；產(chǎn)生被檢測物質(zhì)產(chǎn)物C（如NADH）的反應稱為指示反應，相應的偶聯(lián)酶（第二個酶）酶稱指示酶（Ei）。ExEi第三十九頁，共七十二頁，2022年，8月28日如果一些酶促反應找不到合適的指示酶與其直接偶聯(lián)，此時往往還可在始發(fā)反應和指示反應之間加入另一種酶，將二者連接起來，此反應稱為輔助反應。模式為：ABCD一般習慣將最后一個酶稱指示酶（Ei），其他外加的酶稱為輔助酶（Ea）。個別情況還可能使用兩種或以上的輔助酶。將這一連串酶促反應稱為酶偶聯(lián)體系。ExEiEa第四十頁，共七十二頁，2022年，8月28日臨床常規(guī)酶學分析所用的酶偶聯(lián)法中，多以脫氫酶為指示酶。通過監(jiān)測其反應物NADH或NADPH于340nm處吸光度的變化速率，可以很容易地監(jiān)測指示酶反應。第四十一頁，共七十二頁，2022年，8月28日用酶偶聯(lián)法測定酶活性濃度時，并不是一開始反應就全部反映了測定酶活性。這是因為在偶聯(lián)反應中存在幾個時相：一是預孵育期，反應一開始只存在底物A，不存在指示酶的反應，在此時相中使存在于樣品中的干擾物質(zhì)充分進行反應，將試劑中的NADH變?yōu)镹AD＋。二是延滯期，加入底物啟動反應，在啟動后的一段短時間內(nèi)，產(chǎn)物B開始出現(xiàn)并逐漸增加，處于較低水平，指示酶反應速度也較低，不能代表測定酶的反應速率Vx，這一時期稱為延滯期。第四十二頁，共七十二頁，2022年，8月28日隨著產(chǎn)物B增加到一定程度時，Ex和Ei反應速率相同，達到了穩(wěn)態(tài)期。此階段340nm波長處吸光度才會有明顯的線性變化。最后由于底物消耗，反應速度又復減慢。圖6-5顯示酶偶聯(lián)法測定ALT時吸光度變化的掃描圖譜。設計或選擇酶測定方法時，如用酶偶聯(lián)法，延滯期越短越好，測定時間一定要避開此期。第四十三頁，共七十二頁，2022年，8月28日第四十四頁，共七十二頁，2022年，8月28日當然也不是所有酶都適合用酶偶聯(lián)法進行測定。為了保證準確測定酶活性，酶偶聯(lián)反應的反應速率應超過或等于測定酶的反應速率，指示酶反應必須是一級反應，即指示酶反應速率應和測定酶的產(chǎn)物B濃度成正比。第四十五頁，共七十二頁，2022年，8月28日只有當使用大量的指示酶，以及指示酶的Km很小時，才能做到這一點。一般說來酶偶聯(lián)法中所用的指示酶Km值都很小，酶促反應最適pH應與工具酶的反應最適pH相接近。當然在選用指示酶時還應從經(jīng)濟方面考慮選用一些來源容易且價格便宜的酶制劑。第四十六頁，共七十二頁，2022年，8月28日（三）干擾因素臨床測定酶活性濃度標本都是體液，其中除測定酶外，還存在著其他各種酶和其他物質(zhì)，因此在實測反應中可能出現(xiàn)一些副反應或旁路反應，這些都會對測定反應產(chǎn)生干擾。第四十七頁，共七十二頁，2022年，8月28日1．其他酶和物質(zhì)的干擾反應體系各成分除可能引起測定酶反應外，還有可能引起其他酶的反應而干擾測定。例如酶偶聯(lián)法測ALT時，由于反應體系中含有大量NADH和LD(H)，可與血液標本中所含丙酮酸反應，引起340nm波長處吸光度下降，從而引起ALT活性測定誤差。第四十八頁，共七十二頁，2022年，8月28日又如紅細胞中腺苷酸激酶（AK）對CK測定的干擾，在CK測定的酶偶聯(lián)體系中ADP是CK的底物，但它又同時是AK的底物，二個酶反應都產(chǎn)生ATP。ATP在試劑中與己糖激酶（HK）和G6PD作用會形成NADH引起340nm波長處吸光度的上升，出現(xiàn)CK酶活性結(jié)果偏高。為避免此干擾，一般在反應體系中加入AK的抑制劑腺苷酸（AMP）和二腺苷五磷酸（AP5A）。第四十九頁，共七十二頁，2022年，8月28日2．酶的污染因試劑用酶多從動物組織或細菌中提取，易污染其他酶，如不設法除去將引起測定誤差。如組織勻漿中往往含有NADH-細胞色素C還原酶，它將干擾各種還原酶的測定。使用的酶制劑（如工具酶）必須提純。例如測AST時，被蘋果酸脫氫酶所污染的AST不應超過相對量的5×10-5（0．005％）。第五十頁，共七十二頁，2022年，8月28日3．非酶反應有些底物不穩(wěn)定，沒有酶的作用就會自行反應。例如很多硝基酚的酯類衍生物在水溶液中不穩(wěn)定，放置一段時間可自行水解釋放出硝基酚。類似情況還可見于一些內(nèi)部因素如pH變化而引起的空白對照的變化。又如測定ALD（醛縮酶）時，其底物醛類化合物可以和NAD＋起非酶反應產(chǎn)生一種具有類似NADH的吸收光譜的衍生物，給測定帶來困難。第五十一頁，共七十二頁，2022年，8月28日4．分析容器的污染如分析容器或管道污染而混雜有其他一些物質(zhì)，可能影響酶的活性。如微量重金屬可使酶失活，殘留的表面活性劑可能抑制酶活性。第五十二頁，共七十二頁，2022年，8月28日5．沉淀形成使用分光光度法測定酶活性時，如有沉淀形成或組織勻漿中顆粒的下沉都會引起吸光度變化。常加入表面活性劑以防止顆粒從勻漿中析出。有些酶反應需鎂離子作為輔因子，如反應液中含有多余磷酸根時將有沉淀出現(xiàn)。第五十三頁，共七十二頁，2022年，8月28日解決上述干擾問題的方法之一可通過試劑空白管檢出并加以校正。即有時不僅要作標本對照管，還要作試劑空白管。另一個有效途徑就是不用單一試劑而改用雙試劑測定酶活性。第五十四頁，共七十二頁，2022年，8月28日四、工具酶通常把酶學分析中作為試劑用于測定化合物濃度或酶活性濃度的酶稱為工具酶。常使用酶偶聯(lián)體系進行測定，指示酶和輔助酶作為反應系統(tǒng)中的試劑。第五十五頁，共七十二頁，2022年，8月28日（一）常用工具酶及其質(zhì)量要求常用工具酶多為氧化還原酶類，這是因為其產(chǎn)物最易被直接監(jiān)測而成為指示酶。在一系列利用工具酶的反應中，主要限速因子應該是待測化合物和待測酶，工具酶和其輔助底物應過量。第五十六頁，共七十二頁，2022年，8月28日工具酶純度不必要求過高，這樣才能降低其作為試劑的成本。但對工具酶試劑中的雜質(zhì)（雜酶、抑制劑等）的含量要有一定的限制，以保證工具酶一定的比活性和純度，減少或避免一些干擾測定的不必要的副反應。第五十七頁，共七十二頁，2022年，8月28日（二）工具酶參與的指示反應近年來，在臨床生物化學檢驗中，許多項目的測定往往使用有工具酶的參與的類似的反應原理，即所謂共通（或通用）反應途徑。第五十八頁，共七十二頁，2022年，8月28日最常用的有兩類分光光度法，一類是利用較高特異性的氧化酶產(chǎn)生過氧化氫（H2O2），再加氧化發(fā)色劑比色；另一類是利用氧化-還原酶反應使其連接到NAD(P)＋-NAD(P)H的正／逆反應后，直接通過分光光度法或其他方法測定NAD(P)H的變化量。表6-4顯示臨床常用的共通性呈色反應。第五十九頁，共七十二頁，2022年，8月28日第六十頁，共七十二頁，2022年，8月28日1．偶聯(lián)H2O2的工具酶及其指示反應臨床化學測定中，可利用葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶、膽固醇氧化酶、甘油氧化酶、丙酮酸氧化酶等工具酶分別用于葡萄糖、尿酸、膽固醇、甘油、丙酮酸的測定，可使相應底物被氧化生成H2O2。第六十一頁，共七十二頁，2022年，8月28日H2O2主要通過以氫（或電子）為受體的指示酶反應進行檢測。有兩類工具酶參與反應：過氧化氫酶或稱觸酶（catalase）及過氧化物酶（peroxidase，POD），兩者均為含三價鐵的指示酶，以指示酶POD最為常用。第六十二頁，共七十二頁，2022年，8月28日血糖測定（葡萄糖氧化酶法）葡萄糖+O2+H2O葡萄糖酸+H2O22H2O2+4-氨基安替吡啉+苯酚醌亞胺+4H2O過氧化物酶（紅色）葡萄糖氧化酶第六十三頁，共七十二頁，2022年，8月28日血清總膽固醇測定（膽固醇氧化酶法）膽固醇酯+H2O膽固醇+脂肪酸膽固醇+O24-膽甾氧化烯酮+H2O22H2O2+4-氨基安替吡啉+苯酚醌亞胺+4H2O膽固醇酯酶膽固醇氧化酶過氧化物酶（紅色）第六十四頁，共七十二頁，2022年，8月28日2．NAD(P)＋或NAD(P)H偶聯(lián)的脫氫酶及其指示反應許多氧化還原反應，尤其是作為工具酶的脫氫酶如LD(H)、GLD（谷氨酸脫氫酶）

、G6PD等參與時，常將底物的氫原子去除后傳遞給NAD(P)＋而形成NAD(P)H。第六十五頁，共七十二頁，2022年，8月28日LD主要以NAD＋／NADH為輔酶，而GLD則不論來自肝或細菌，均可以NAD＋／NADP＋或其還原型為輔酶。因NAD(P)H在340nm有特征性光吸收，可借此用分光光度法進行檢測。目前利用此類反應的測定項目至少有葡萄糖、尿素、β-羥丁酸、甘油三酯、甲醇、血氨、ALT、AST、LD(H)、GLD（谷氨酸脫氫酶）、CK、ALD（醛縮酶）、G6PD和ICD（異檸檬酸脫氫酶）第六十六頁，