腸道細胞釋放操作流程

1、解剖和分離腸道上皮細胞試劑和儀器設(shè)備的準(zhǔn)備：無Ca2+/Mg2+的PBS(CMFPBS)恢復(fù)至室溫含終濃度5%FBS的無Ca2+/Mg2+的Hank'sBalancedSaltSolution和2mMEDTA，恢復(fù)至室溫備用。37°C恒溫振蕩培養(yǎng)搖床。注意:步驟1.1到1.7操作時動作要快，以減少細胞死亡的程度和達到最大細胞產(chǎn)量。1.1使老鼠在一個二氧化碳室安樂死，用70%乙醇噴霧對腹部和胸部表面進行消毒。1.2用剪刀在腹部中間剪開一個小的橫向切口，并且把皮卷起來露出腹膜1.3剪斷胃幽門括約肌使小腸上端與胃分離，用鑷子去除腸系膜，再剪斷回盲部，使完整的小腸與大腸分離。再將肛門邊緣剪斷，去除腸系膜，使大腸完全分離。1.4使用剪刀縱向切開結(jié)腸，室溫下用CMFPBS洗掉腸腔內(nèi)的糞便和粘液。1.5使用剪刀和鑷子減掉小腸表面的PP節(jié)，然后縱向剪開小腸。1.6在室溫下用CMFPBS清洗小腸內(nèi)腔中的糞便和粘液。1.7分別把大腸和小腸切成長約1.5厘米的小段，分別放入含有30ml預(yù)熱的CMFHBSS/FBS和2mMEDTA的50ml離心管中。一個50ml離心管最多放一個腸道。1.8將50ml離心管水平地放置于一個搖床上，于37°C，250rpm，孵育20min。1.9將一個鋼網(wǎng)篩置于一個廢液桶上，分別將每個50ml離心管的內(nèi)容物倒在濾網(wǎng)上，回收1.5厘米的腸子片斷，再次置于含有30ml預(yù)熱的CMFHBSS/FBS和2mMEDTA的50ml離心管中，1.10重復(fù)步驟1.8組織消化和腸道細胞的隔離試劑和儀器設(shè)備的準(zhǔn)備:(1)膠原酶溶液:1.5mg/ml的膠原酶VIII溶解在預(yù)熱的含有40“g/mlDNaseI的CMFHBSS/FBS溶液中。預(yù)熱的CMFHBSS/FBS和2mMEDTA37°C預(yù)熱的振蕩培養(yǎng)搖床冰預(yù)冷的CMFHBSS/FBS

2.1第二輪震蕩結(jié)束后，再次濾掉50ml離心管中的液體，將篩網(wǎng)上的1.5厘米的小腸片斷轉(zhuǎn)移至一個小的塑料盒中，用紙巾擦去多余的液體。2.2用剪刀直接在這個小盒內(nèi)將1.5厘米的腸子盡可能剪碎，加入20ml的膠原酶溶液，并轉(zhuǎn)移至50ml離心管，水平放置于振動器中消化，200rpm，10-20min，37幻。2.3消化完畢后，短暫的漩渦振蕩以確保徹底分離剩余的腸道組織，使用100pm的細胞過濾器過濾至置一新的50ml離心管中。2.4每管加入CMFHBSS/FBS終止消化，1500rpm離心5min，4°C。如果離完心圍發(fā)現(xiàn)沉淀，可將樣品再次離心3.5min。重復(fù)此步驟一次2.5棄上清，用冰預(yù)冷的CMFHBSS/FBS重懸沉淀，置于冰上。2.6使用第三部分流式進行分析或第四部分進行磁珠富集或高速細胞分選?？贵w標(biāo)記染色，采用流式細胞儀分析DC和巨噬細胞試劑和儀器設(shè)備的準(zhǔn)備：（1）冰預(yù)冷的CMFPBS（2） 冰預(yù)冷的染色緩沖液（（CMFPBS+5%FBS））（3） 準(zhǔn)備死細胞染色：使用LIVE/DEADFixableAquaDeadCellStainKit，用冰預(yù)冷的CMFPBS進行1:1000稀釋，（4） 在冰預(yù)冷的染色緩沖液中，配制下列熒光標(biāo)記的單克隆抗體進行染色。3.1將細胞轉(zhuǎn)移至5ml的聚苯乙烯圓底（FACS）管。3.2用冰預(yù)冷的CMFPBS將細胞洗兩遍。3.3將細胞與死細胞染液于黑暗處冰上孵育15min。3.4用冰預(yù)冷的CMFPBS將細胞洗兩遍。3.5用2.4G2anti-FcyRIII/II封閉細胞，冰上10min。3.6用冰預(yù)冷的CMFPBS將細胞洗兩遍。3.7將細胞與預(yù)先配制的抗體染液于黑暗處冰上孵育20min。3.8用冰預(yù)冷的染液緩沖液將細胞洗兩遍，重懸于400pl冰預(yù)冷的染色緩沖液中，用40pm濾網(wǎng)過濾至新的FACS的管中。3.9通過BD公司的LSRII流式細胞儀進行分析。腸道DCs和巨噬細胞的富集

(1)冰預(yù)冷的染色緩沖液(CMFPBS+5%FBS)4.1根據(jù)操作說明，使用抗體CD11b和CD11cMACSbeads與步驟2.5獲得單細胞懸液孵育。4.2使用預(yù)冷的染色緩沖液沖洗細胞并離心4.3棄上清，用1ml冰冷的染色緩沖重新懸浮細胞顆粒，先通過100pm細胞染色過濾器過濾，再使用40pm的進行過濾。4.4使用MACSLS磁柱富集陽性磁珠細胞。4.5重復(fù)4.2，棄上清4.6與細胞表面標(biāo)記孵育，如3.7中描述的步驟4.7利用冰冷的染