微生物與制藥

微生物與制藥第一頁，共三十一頁，2022年，8月28日藥物的抗菌試驗

藥物的體外抗菌試驗包括用于區(qū)別藥物是抑菌或殺菌藥物的抑菌試驗；測定藥物殺菌活性的殺菌試驗；以及檢查兩種藥物聯(lián)合作用的聯(lián)合抗菌試驗等。一般抑菌藥物只能抑制微生物生長，不能殺死微生物，抑菌藥物被除去，微生物又可以恢復(fù)繼續(xù)生長。殺菌藥物能殺死微生物，殺菌藥物除去后，微生物仍然不能生長。第二頁，共三十一頁，2022年，8月28日藥物的抑菌作用或殺菌作用是在一定條件下相對而言的。在我們檢測時，藥物的作用受到用藥時培養(yǎng)基的組成、溫度、PH值及所用的菌種、菌量等各個因素有關(guān)。雖然說體外抗菌試驗有很多優(yōu)點，但是由于體外抗菌試驗沒有復(fù)雜的體內(nèi)因素影響，因此藥物體外抗菌試驗和體內(nèi)抗菌試驗可能會出現(xiàn)不一致的結(jié)果。所以，一般我們在體外對藥物進行測試后，有效的藥再要進行體內(nèi)試驗，如果體內(nèi)試驗再次證實此藥有效的話，才能推薦應(yīng)用到臨床。第三頁，共三十一頁，2022年，8月28日第一節(jié)藥物的體外抑菌試驗一、藥物的體外抑菌試驗（一）體外抑菌試驗藥物的體外抑菌試驗是常用抗菌試驗方法，其中最常用的方法用系列稀釋法和瓊脂擴散法。第四頁，共三十一頁，2022年，8月28日

稀釋法

稀釋法有液體培養(yǎng)基連續(xù)稀釋法和固體稀釋法（斜面法）兩種。這兩種方法都可以用來測定藥物的最小抑菌濃度（MIC）：是指該藥物能抑制細菌生長的最低濃度，通常用μg∕ml或U/ml表示。具體的液體培養(yǎng)基連續(xù)稀釋法見書本，固體培養(yǎng)基連續(xù)稀釋法，又可分為平板法和斜面法。第五頁，共三十一頁，2022年，8月28日2.瓊脂擴散法

利用藥物在瓊脂培養(yǎng)基中擴散，并在一定濃度范圍內(nèi)抑制細菌生長的原理進行的。一般用于細菌和酵母菌的藥敏試驗。1.

濾紙片法（紙碟法）濾紙片法是最常用的方法，適用于新藥的初篩試驗（初步藥物是否有抗菌作用）及臨床的藥敏試驗（細菌藥物第三性試驗、以便選擇用藥）。濾紙片分濕、干兩種，可以在試驗時用無菌紙片沾取藥物溶液放在含菌的平板表面，也以預(yù)先做成一定濃度的干燥紙片。一般來說預(yù)先做成的干燥紙片實用一些而且準確一些。第六頁，共三十一頁，2022年，8月28日干燥紙片的制備方法：選用吸水力強而且質(zhì)地均勻的濾紙，用打洞機制成6mm直徑的圓紙片，120℃干燥滅菌2小時。然后把配制好的各種適宜濃度的抗生素溶液，每100張紙片加入0.5ml藥液，使它均勻浸潤，放在無菌平皿中，37℃，使它干燥，分裝小瓶中，封口，4℃保存.一般藥敏試驗常采用濾紙片法，我們可以根據(jù)抑菌圈的大小，來判斷菌種對藥物的敏感性，是敏感，中度敏感還是耐藥。第七頁，共三十一頁，2022年，8月28日世界衛(wèi)生組織規(guī)定了抗菌藥物的敏感性評定標準，在標準實驗條件下根據(jù)抑菌圈大小來判斷，比如：抗生素或化療藥物抑菌圈直徑（mm）耐藥中敏敏感氯霉素≤1213-17≥18紅霉素≤1314-17≥18四環(huán)素≤1415-18≥19卡那霉素≤1314-17≥18第八頁，共三十一頁，2022年，8月28日2.

打洞法含菌瓊脂平板上打洞,所以說微量法適于藥物血濃度的監(jiān)測。優(yōu)點是微量（血清用量少）敏感，操作簡便。除此之外還有管碟法、直接滴加法和挖溝法：適用于測試一種藥物對幾種細菌的抗菌作用。方法是先制備普通瓊脂平板，并在平板上挖直溝，在溝內(nèi)滴加藥液，在溝側(cè)接種細菌。經(jīng)過培養(yǎng)以后觀察加細菌生長的情況。我們可以根據(jù)溝和細菌間的抑菌距離的長短，來判斷該藥物對這些細菌的抗菌能力。第九頁，共三十一頁，2022年，8月28日(二）、

體外殺菌試驗殺菌試驗是用來評價藥物對微生物的致死活性的。1.

最低殺菌濃度（MBC）（最小致死濃度MLC）的測定按液體培養(yǎng)基稀釋法的操作方法測了藥物的MIC。然后把未長出菌的各個試管培養(yǎng)液分別移種到無菌平板上，培養(yǎng)后凡是平板上無菌生長的藥物最低濃度就是最小致死濃度（MLC）。如果是細菌的話可以稱為最小殺菌濃度（MBC）。第十頁，共三十一頁，2022年，8月28日2.

活菌計數(shù)法

將定量的試驗菌加入到一定濃度的定量藥物中，作用一定時間后，取樣進行活菌數(shù)計數(shù)，從存活的微生物數(shù)量計算出藥物對試驗菌的致死率，從而判斷藥物的殺菌能力?；罹嫈?shù)一般是將定量的藥物與試驗菌作用后混合液稀釋后，混入瓊脂培養(yǎng)基做成平板，培養(yǎng)后數(shù)平板上形成的菌落數(shù)，由于一個菌落是由一個細菌繁殖而來的，所以可以用菌數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，計算出混合液中存活的細菌數(shù)?；蛘咭部梢杂梦⒖诪V膜過濾藥物與試驗菌的混合液，洗凈藥液，將濾膜放在平板上培養(yǎng)后數(shù)菌落數(shù)（CFU)。第十一頁，共三十一頁，2022年，8月28日3.

酚系數(shù)測定（石炭酸系數(shù)測定）酚系數(shù)是以酚為標準，將待測的化學(xué)消毒劑與殺菌效力相比較，所得的就是殺菌效力的比值。苯酚系數(shù)=消毒劑的殺菌稀釋度/苯酚的殺菌稀釋度（苯酚系數(shù)大于2或等于2才合格）由于各種化學(xué)消毒劑殺菌原理各不相同，因而這種方法僅僅適用于酚類消毒劑殺菌效力的測定。具體的測定方法:是分別將酚及待測化學(xué)消毒劑按不同比例稀釋，各取5ml放到試管中，再加入經(jīng)24小時培養(yǎng)后的菌懸液各0.5ml，混勻后放入20℃水浴中，5、10、15分鐘分別取一接種環(huán)混合液移種到另一支5ml的肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24小時記錄生長情況。第十二頁，共三十一頁，2022年，8月28日（三）、

聯(lián)合抗菌試驗1、聯(lián)合抗菌試驗主要用于測定兩種抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用時的相互影響。①無關(guān)作用小，兩種藥物聯(lián)合作用的活性等于其單獨活性；②拮抗作用，兩種藥物聯(lián)合作用顯著低于單獨抗菌活性；③累加作用，兩種藥物聯(lián)合作用時的活性等于兩種單獨抗菌活性之和；④協(xié)同作用，兩種藥物聯(lián)合作用顯著大于其單獨作用的總和。第十三頁，共三十一頁，2022年，8月28日常用方法

1.

棋盤格法

棋盤稀釋法是常用的定量方法，首先分別測定擬聯(lián)合的抗菌藥物對檢測菌的MIC。藥物的稀釋分別在方陣的縱列和橫列進行，這樣在每管（孔）中可得到不同濃度組合的兩種藥物混合液。接種菌量為5×105CUF／ml，35℃孵育18h后觀察結(jié)果。計算部分抑菌濃度（FIC）指數(shù)0．5為協(xié)同作用；0．5－1為相加作用；1～2為無關(guān)作用；＞2為拮抗作用。

第十四頁，共三十一頁，2022年，8月28日[棋盤法的設(shè)計]棋盤法的主要優(yōu)點在于甲、乙兩藥的每個藥物濃度都有單獨的和與另一個藥物不同濃度的聯(lián)合，因此能精確測定兩種抗菌藥物在適當(dāng)濃度的比例下所產(chǎn)生的相互作用。在進行棋盤法之前應(yīng)先測定兩種抗菌藥物單獨對受試菌的MIC，然后以兩藥MIC的8倍、4倍、2倍、1倍以及MIC的1/2、1/4、1/8濃度（或4倍、2倍、1倍、1/2、1/4濃度）分別進行聯(lián)合?？梢娕e例，如表—1的青霉素G與鏈霉素聯(lián)合藥敏實驗和表2的TMP+SMZ的聯(lián)合作用。第十五頁，共三十一頁，2022年，8月28日藥物及濃度青霉素G(IU／m1)鏈霉素單藥對照4210.50.25鏈霉素（μg／ml）64------32------16------8---+++4---+++青霉素G單藥對照---++細菌對照-：無細菌生長+：有細菌生長FIC指數(shù)=1／1+16／16=2——無關(guān)第十六頁，共三十一頁，2022年，8月28日

2.紙條試驗

在含菌平板上垂直放兩條浸有不同藥液的濾紙條，培養(yǎng)后觀察兩藥形成的抑菌區(qū)的圖形來判斷兩藥聯(lián)合應(yīng)用時，是無關(guān)、協(xié)同還是拮抗作用。

第十七頁，共三十一頁，2022年，8月28日3.

紙條梯度平板試驗

將瓊脂培養(yǎng)基倒入平皿，平皿斜放凝固后制成斜面培養(yǎng)基。將平皿放平加入含抗菌藥物的瓊脂培養(yǎng)基，這樣在制成的雙層瓊脂平板中含有梯度濃度的抗菌藥物。要求其最小抑菌濃度的位置約處于平板的一半。然后將試驗菌液均勻涂布在平板表面。取紙條浸透另一待檢藥液，按梯度中藥物濃度遞減的方向置于平板表面，培養(yǎng)后觀察形成的抑菌區(qū)的圖形以判斷兩種藥物之間的相互作用。第十八頁，共三十一頁，2022年，8月28日意義目的在于：①治療混合性感染；②預(yù)防或推遲細菌抗生素耐藥性的發(fā)生；③聯(lián)合用藥可以減少劑量以避免達到毒性劑量；④聯(lián)合用藥比單一用藥時效果更好。第十九頁，共三十一頁，2022年，8月28日二、藥物的體內(nèi)抗菌試驗

藥物的體內(nèi)抗菌試驗又稱為動物實驗治療試驗或保護力試驗。當(dāng)抗菌藥物進入機體后，其效力的發(fā)揮要受體內(nèi)各種因素的影響。如血液及組織內(nèi)的蛋白質(zhì)或磷脂、膿汁內(nèi)的核酸均與藥物結(jié)合，降低藥物的活性；壞死組織內(nèi)的酸性環(huán)境也能影響藥物的活性。機體內(nèi)的微生物，代謝活動較低，對藥物的敏感性降低，有時還可形成細胞壁缺陷型細菌，對某些藥物不敏感。機體內(nèi)各組織中藥物的吸收，分布不同，使藥物的濃度難以恒定。因此在評定新藥的藥效時除做體外抗菌試驗外還需要做體內(nèi)的抗菌試驗。

第二十頁，共三十一頁，2022年，8月28日三、影響抗菌試驗的因素

1.

菌種在抗菌試驗中所用到的菌種，必需是國家衛(wèi)生部生物制品檢定所菌各保藏中心專門提供的標準菌株。在特殊情況下，也可以采用臨床新分離的并經(jīng)過鑒定、純化及合理保藏的菌株。而且我們要用到的試驗菌種應(yīng)該選擇是對數(shù)期生長菌。因為那時菌種生命力最旺盛，這對于我試驗測定的結(jié)果也會準確些。第二十一頁，共三十一頁，2022年，8月28日1.

培養(yǎng)基試驗所用到的培養(yǎng)基應(yīng)按各試驗菌的營養(yǎng)要求進行配制，嚴格控制各種原料、成分的質(zhì)量及培養(yǎng)基的配制過程。要注意當(dāng)有些藥物具有抗代謝作用時，培養(yǎng)應(yīng)不能存在代謝物，否則抑菌作用將會被消除。培養(yǎng)基內(nèi)如果含有血清等蛋白質(zhì)時，有可能與某些抗菌藥物結(jié)合，使抗菌藥物失去，所以就要避免培養(yǎng)基混進這類營養(yǎng)物。第二十二頁，共三十一頁，2022年，8月28日3.

抗菌藥物藥物的物理狀態(tài)、濃度、稀釋方法等都會直接影響抗菌試驗的結(jié)果，必需精確配制。如果是固體藥物，必需使藥物溶解或使藥物呈均勻懸液。PH值應(yīng)調(diào)至中性，以確保藥物的穩(wěn)定性和不影響細菌的生長。中草藥因為有顏色和含有鞣質(zhì)，結(jié)果的判斷，應(yīng)特別注意。第二十三頁，共三十一頁，2022年，8月28日4.

對照試驗為確保試驗結(jié)果的科學(xué)性和準確性，試驗時應(yīng)同時進行各種對照試驗。試驗菌對照：在無藥情況下，應(yīng)能在培養(yǎng)基內(nèi)正常生長。溶劑及稀釋液對照：配制抗菌藥物時所用的溶劑及稀釋液均應(yīng)無抗菌作用。已知藥物對照：應(yīng)使已知抗菌藥物對標準菌株出現(xiàn)抗菌效應(yīng)。

第二十四頁，共三十一頁，2022年，8月28日復(fù)習(xí)題：1.

藥物體外抑菌試驗常用的方法有哪幾種？具體的試驗操作方法？

2.

如何測定藥物的最小致死濃度？

3.

聯(lián)合抗菌試驗常用的方法有哪些？

4.

藥物體內(nèi)抗菌試驗的方法？

5.

抗菌試驗的影響因素有哪些？第二十五頁，共三十一頁，2022年，8月28日實驗細菌對藥物敏感性的實驗（藥敏片擴散法）目的意義：

掌握藥敏片擴散法進行藥敏實驗的一般方法體會藥敏實驗在臨床用藥上的指導(dǎo)意義基本原理：

藥敏片是含有抗生素的濾紙片，將其置于涂滿待測菌的固體培養(yǎng)基上，抗菌藥物通過向培養(yǎng)基內(nèi)擴散，抑制細菌生長，從而出現(xiàn)抑菌環(huán)。根據(jù)抑菌環(huán)的大小可以判定細胞對此藥物的敏感度。第二十六頁，共三十一頁，2022年，8月28日器材及試劑:藥敏片：含各種抗生素的市售產(chǎn)品培養(yǎng)基平板：普通牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，待檢細菌的培養(yǎng)物。眼科鑷、無菌棉拭子、酒精燈等。第二十七頁，共三十一頁，2022年，8月28日實驗步驟:1、用無菌棉拭