植物抗病基因工程的基本原理與方法

第六章植物抗病基因工程的基本

原理與方法

植物抗病基因工程是通過分子生物學(xué)技術(shù)獲得對植物病害（病毒、細(xì)菌、真菌、線蟲等病害）具有一定抗性的轉(zhuǎn)基因植株。

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1983年首例轉(zhuǎn)基因煙草問世。

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1994年首批轉(zhuǎn)基因作物如延熟西紅柿和抗除草劑棉花等獲得批準(zhǔn)進(jìn)行商品化生產(chǎn)。目前，國內(nèi)外已報道的轉(zhuǎn)基因作物有16種70多個品系。

?自1986年3月以后，我國已研究的轉(zhuǎn)基因作物47類，涉及的轉(zhuǎn)基因103種。正式公布的轉(zhuǎn)基因作物：棉花、大豆、西紅柿、青椒和矮牽牛。

?目前，已經(jīng)商品化的轉(zhuǎn)基因作物所轉(zhuǎn)入的外源基因主要是抗性基因，只有少數(shù)是改良作物品種性狀的。

植物抗病基因工程的基本原理與方法1植物抗病基因工程策略1.1導(dǎo)入植物抗病相關(guān)基因和病原菌致病相關(guān)基因在植物抗性基因的利用方面

◆根據(jù)已有的R基因結(jié)構(gòu)特征，設(shè)計新的R基因。

◆異源表達(dá)R基因。

◆向同一株植物中導(dǎo)入多個R基因。在病原菌無毒基因的利用方面

轉(zhuǎn)病原菌無毒基因。

將病原菌無毒基因和相應(yīng)的R基因一起導(dǎo)入植物。

導(dǎo)入與植物抗病信號有關(guān)的基因。植物抗病基因工程的基本原理與方法1.2導(dǎo)入植物防衛(wèi)基因

◆Broglie(1991),etal.在克隆菜豆幾丁質(zhì)基因的基礎(chǔ)上將CH5B基因修飾改造，通過Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化煙草，獲得幾丁質(zhì)酶高效表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株，具有協(xié)同拮抗枯萎病菌的效果。

◆rmona(1993),etal.，將來源于大麥基因組克隆的硫素基因和來源于小麥cDNA克隆的硫素基因轉(zhuǎn)化到煙草中，獲得了對P.s.pv.tabaci具有較高抗性的植株。

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美國孟山都（Monsanto）公司將真菌編碼葡萄糖氧化酶基因?qū)腭R鈴薯中，獲得了對Ecc引起的細(xì)菌性軟腐病具有良好抗性的植株。植物抗病基因工程的基本原理與方法1.3導(dǎo)入降解病原物致病因子基因

◆H.Anzai(1989),etal.分離到了抗煙毒素（tabtoxin）的基因ttr，將基因ttr與CaMV35S啟動子融合成嵌合基因，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入煙草，獲得ttr高表達(dá)量的轉(zhuǎn)基因植株，對煙毒素和病原菌的侵染均表現(xiàn)出良好的抗性。

◆菜豆毒素（phaseolotoxin）是一種非寄主?；远舅?，產(chǎn)菜豆毒素的P.s.pv.phaseolicola菌株通過argK基因合成一種不被菜豆毒素抑制的OCTaseR酶，從而對該毒素不敏感。將argK基因?qū)霟煵莺筒硕?，獲得的轉(zhuǎn)基因煙草和菜豆對P.s.pv.phaseolicola有較高的抗性。植物抗病基因工程的基本原理與方法1.4導(dǎo)入其它蛋白基因

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賈士榮,等(1993)和M.Hassan(1993),etal.向馬鈴薯導(dǎo)入cecropin基因后提高了馬鈴薯對青枯病的抗性。

◆J.M.Jaynes(1993),etal.將cecropinB基因?qū)霟煵莺螳@得的轉(zhuǎn)基因植株，提高了其對R.solanacearum引起病害的抗性。

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黃大年,等(1997)將cecropinB和cecropinD基因?qū)胨居着撸@得的轉(zhuǎn)基因水稻植株可明顯地提高對水稻白葉枯病的抗性，同時也獲得了高抗水稻條斑病和水稻白葉枯病的高抗品系。植物抗病基因工程的基本原理與方法2植物抗病基因工程的技術(shù)環(huán)節(jié)

◆至今已分離的供植物基因工程應(yīng)用的目的基因有100多個，其中研究得比較多的是抗病毒、細(xì)菌和真菌的基因，能殺死害蟲或使害蟲拒食的基因，能抵抗各種除草劑的基因，能抗逆境如干旱、高寒、高溫鹽堿等的基因，能提高植物體中蛋白質(zhì)含量或蛋白質(zhì)品質(zhì)的基因等等。這些基因中有些是來自植物本身，有些來自微生物，還有少數(shù)是人工合成的。植物抗病基因工程的基本原理與方法2.1目的基因的分離和鑒定

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對已知序列進(jìn)行分子克隆

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從蛋白質(zhì)到基因序列

PCR擴(kuò)增構(gòu)建cDNA文庫構(gòu)建基因組文庫

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與已知基因緊密連鎖基因的分離

植物抗病基因工程的基本原理與方法

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根據(jù)植株或細(xì)胞表型變異進(jìn)行基因分離

轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法圖位克隆法基因挽救技術(shù)基因組相減法cDNA差式顯示轉(zhuǎn)座子導(dǎo)入細(xì)胞目的形狀突變株構(gòu)建核DNA文庫用轉(zhuǎn)座子序列作探針進(jìn)行雜交分析轉(zhuǎn)座子兩側(cè)序列并以此作探針野生型細(xì)胞核DNA構(gòu)建核DNA文庫完整的目的性狀基因轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法流程圖植物抗病基因工程的基本原理與方法2.2表達(dá)載體的構(gòu)建

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目的基因分離后，往往需要經(jīng)過修飾才能應(yīng)用于植物基因工程。構(gòu)建植物表達(dá)載體就是在目的基因的5’端加上啟動子，在基因的3’端加上中止子，以便使外源基因能在植物中有效地表達(dá)，充分發(fā)揮其功能。加入啟動子區(qū)

目前植物基因工程中外源基因常選用的啟動子主要有3類：第一類是從Ti質(zhì)粒的T-DNA序列上分離的啟動區(qū)。具有真核生物轉(zhuǎn)基因起始所需的TATA盒和CAT盒；第二類是CaMV的35S和19S啟動子；第三類是從植物本身分離出來的啟動子。植物抗病基因工程的基本原理與方法加入轉(zhuǎn)錄的加尾序列

真核生物為保證一個結(jié)構(gòu)基因表達(dá)完全末端需要有一個加尾序列。其功能一方面保證轉(zhuǎn)錄的終止；另一方面保證形成有活性的mRNA鏈。植物基因工程中常用的加尾序列是AATAAA。插入內(nèi)含子

內(nèi)含子是真核生物基因組結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)之一。在基因工程中，多數(shù)不用在目的基因中插入這種片段就能得到有效的表達(dá)，因此，認(rèn)為它是基因產(chǎn)物功能非必需的。但是在實(shí)際操作中，如果在目的基因適當(dāng)?shù)奈恢貌迦脒@種序列，其表達(dá)量可以提高幾十到幾百倍。因此，有人推測，內(nèi)含子可能在基因翻譯中起增強(qiáng)子的作用。植物抗病基因工程的基本原理與方法加入翻譯起始密碼子

由于植物中mRNA的翻譯起始密碼子多數(shù)也是AUG，因此，要在目的基因功能蛋白的編碼序列前加上適當(dāng)?shù)暮塑账嵝蛄?。加入終止密碼子

植物基因工程中所使用的mRNA翻譯終止密碼子有UAA、UAG、UGA三種。一般在目的基因功能蛋白的編碼序列后直接加上對應(yīng)的堿基序列。實(shí)驗(yàn)中通常采用的是Ti質(zhì)粒中的Nos終止子。加入增強(qiáng)序列植物抗病基因工程的基本原理與方法加入與植物中特定DNA同源的序列

為了實(shí)現(xiàn)將目的基因和植物基因組有效整合，植物基因工程中常在目的基因兩端接上能和植物特定基因能整合的DNA序列，一方面可以提高外源基因的插入效率；另一方面也可以結(jié)合植物基因組表達(dá)調(diào)控規(guī)律，通過調(diào)整所加同源序列的堿基序列有效地控制外源基因的插入位點(diǎn)和表達(dá)時間，使目的基因更便于操作以及整合后更好地發(fā)揮作用。加入報道基因

常用的報道基因：lacZ、ocs、cat、nptⅡ、lux和gus植物抗病基因工程的基本原理與方法2.3目的基因向植物的轉(zhuǎn)化

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近年來，植物的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)得到了迅速的發(fā)展，已建立了多種轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，如以農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒及Ri質(zhì)粒為載體的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，以PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)化學(xué)導(dǎo)入法、電激法、基因槍法、花管導(dǎo)入法等等。總之，植物細(xì)胞遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)可分為兩大類：以載體為介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化（vectormediatedgenetransfer）和DNA直接轉(zhuǎn)化（nakedDNAtransfer）。

植物抗病基因工程的基本原理與方法2.4轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的篩選及轉(zhuǎn)基因植物的鑒定

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植物外植體經(jīng)過農(nóng)桿菌或DNA直接轉(zhuǎn)化后，大部分細(xì)胞是沒有轉(zhuǎn)化的，只有極少數(shù)是轉(zhuǎn)化的，這就需要采用特定的的方式將未轉(zhuǎn)化細(xì)胞與轉(zhuǎn)化細(xì)胞區(qū)分開來，淘汰未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，然后利用植物細(xì)胞的全能性在適宜的環(huán)境條件下使轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生成可育的轉(zhuǎn)基因植株。

◆目前，轉(zhuǎn)化細(xì)胞與非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的區(qū)分及非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的淘汰常采用抗菌素抗性基因及抗除草劑基因，總稱篩選標(biāo)記。植物基因工程中常用的篩選標(biāo)記是nptⅡ（neomycinphosphotransferase）基因和cat（chloramphenicolacetyltr-ansferase）基因植物抗病基因工程的基本原理與方法第七章轉(zhuǎn)基因作物及其外源抗性基因檢測技術(shù)概況

世界上已批準(zhǔn)進(jìn)行商品化轉(zhuǎn)基因作物：大豆、玉米、棉花、西紅柿、馬鈴薯、甜