2022年醫(yī)學(xué)專題-土壤中分解尿素尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)

微生物的培養(yǎng)(péiyǎng)與應(yīng)用課題2:土壤中分解(fēnjiě)尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)第一頁，共三十九頁。第二頁，共三十九頁。一、課題(kètí)目標(biāo)

研究培養(yǎng)基對微生物的選擇作用，進(jìn)行微生物數(shù)量(shùliàng)的測定。

二、課題(kètí)重點(diǎn)與難點(diǎn)

重點(diǎn)：對土樣的選取和選擇培養(yǎng)基的配制。難點(diǎn)：對分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)。第三頁，共三十九頁。三、研究(yánjiū)思路

微生物的選擇(xuǎnzé)培養(yǎng)，是指利用培養(yǎng)基的組成使適宜生長的特定微生物得到較快繁殖的技術(shù)，也稱為微生物的“選擇培養(yǎng)”。

（一）篩選(shāixuǎn)菌株第四頁，共三十九頁。在本課題提供的選擇培養(yǎng)基的配方中，尿素是培養(yǎng)基中的惟一氮源，因此，原則上只有能夠利用尿素的微生物才能夠生長。但實(shí)際上，微生物的培養(yǎng)是一個(gè)非常復(fù)雜的問題，有些微生物可以利用其他微生物的代謝產(chǎn)物生長繁殖，因此能夠在選擇培養(yǎng)基上生長的微生物不一定是所需要(xūyào)的微生物，還需要(xūyào)進(jìn)一步的驗(yàn)證。第五頁，共三十九頁。第六頁，共三十九頁。（二）統(tǒng)計(jì)菌落(jūnluò)數(shù)目

統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的理論依據(jù)是：當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長的一個(gè)菌落，來源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌。因此，恰當(dāng)?shù)南♂尪仁浅晒Φ亟y(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的關(guān)鍵。為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，通常將幾個(gè)稀釋度下的菌液都涂布在平板(píngbǎn)上，培養(yǎng)后再選擇菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。第七頁，共三十九頁。說明設(shè)置重復(fù)組的重要性。第一位同學(xué)只涂布了一個(gè)平板，沒有設(shè)置重復(fù)組，因此結(jié)果不具有說服力。第二位同學(xué)考慮到設(shè)置重復(fù)組的問題，涂布了3個(gè)平板，但是，其中1個(gè)平板的計(jì)數(shù)結(jié)果與另2個(gè)相差太遠(yuǎn)，說明在操作過程中可能出現(xiàn)了錯(cuò)誤，因此，不能簡單地將3個(gè)平板的計(jì)數(shù)值用來求平均值。這個(gè)實(shí)例(shílì)啟示學(xué)生，在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)，一定要涂布至少3個(gè)平板，作為重復(fù)組，才能增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的說服力與準(zhǔn)確性。在分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)，一定要考慮所設(shè)置的重復(fù)組的結(jié)果是否一致，結(jié)果不一致，意味著操作有誤，需要重新實(shí)驗(yàn)。第八頁，共三十九頁。思考題1.想一想，如何從平板(píngbǎn)上的菌落數(shù)推測出每克樣品中的菌落數(shù)？答：統(tǒng)計(jì)某一稀釋度下平板上的菌落(jūnluò)數(shù)，最好能統(tǒng)計(jì)3個(gè)平板，計(jì)算出平板菌落數(shù)的平均值，然后按課本旁欄的公式進(jìn)行計(jì)算。第九頁，共三十九頁。第十頁，共三十九頁。

A同學(xué)的結(jié)果與其他同學(xué)不同，可能的解釋(jiěshì)有兩種。一是由于土樣不同；二是由于培養(yǎng)基污染或操作失誤。

（三）設(shè)置(shèzhì)對照究竟是哪個(gè)(nǎge)原因，可以通過實(shí)驗(yàn)來證明。第十一頁，共三十九頁。另一種方案：將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加(bùjiā)土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。通過這個(gè)事例可以看出，實(shí)驗(yàn)結(jié)果要有說服力，對照的設(shè)置是必不可少的。實(shí)驗(yàn)(shíyàn)方案有兩種一種方案：可以由其他同學(xué)用與A同學(xué)一樣的土樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明(zhèngmíng)A無誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。第十二頁，共三十九頁。四、實(shí)驗(yàn)(shíyàn)案例

實(shí)驗(yàn)的具體操作步驟如下:

1.土壤取樣(qǔyàng)

從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。土壤中某樣品細(xì)菌的分離(fēnlí)與計(jì)數(shù)第十三頁，共三十九頁。準(zhǔn)備牛肉(niúròu)膏蛋白胨培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基將菌液稀釋相同的倍數(shù)，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)目應(yīng)明顯多于選擇培養(yǎng)基上的數(shù)目，因此，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基可以作為對照，用來判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用。由于初次實(shí)驗(yàn)，對于稀釋的范圍沒有把握，因此選擇了一個(gè)較為寬泛的范圍：稀釋倍數(shù)為103～107。每個(gè)稀釋度下需要3個(gè)選擇培養(yǎng)基，1個(gè)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，因此共需要15個(gè)選擇培養(yǎng)基，5個(gè)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。此外，還需要準(zhǔn)備8個(gè)滅菌的試管和1個(gè)滅菌的移液管。

2.制備(zhìbèi)培養(yǎng)基

第十四頁，共三十九頁。第十五頁，共三十九頁。將10g土樣加入盛有90mL無菌生理鹽水的錐形瓶中（錐形瓶體積為250mL），充分搖勻，吸取上清液1mL，轉(zhuǎn)移至盛有9mL的生理鹽水的無菌大試管中，依次等比稀釋至107稀釋度，并按照由107～103稀釋度的順序分別吸取0.1mL進(jìn)行平板涂布操作(cāozuò)。按照濃度從低到高的順序涂布平板，不必更換移液管。

3.微生物的培養(yǎng)(péiyǎng)與觀察

第十六頁，共三十九頁。將涂布好的培養(yǎng)皿放在30℃溫度(wēndù)下培養(yǎng)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，會(huì)有不同的菌落產(chǎn)生。比較牛肉膏培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基中菌落的數(shù)量、形態(tài)等，并做好記錄。挑選選擇培養(yǎng)基中不同形態(tài)的菌落接入含酚紅培養(yǎng)基的斜面中，觀察能否產(chǎn)生如課本中圖2-10的顏色反應(yīng)。第十七頁，共三十九頁。第十八頁，共三十九頁。第十九頁，共三十九頁。為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測定土壤中細(xì)菌的總量和測定土壤中能分解尿素的細(xì)菌的數(shù)量(shùliàng)，選用的稀釋范圍相同嗎？

答：這是因?yàn)橥寥乐懈黝愇⑸锏臄?shù)量（單位：株/kg）是不同的，例如在干旱土壤中的上層樣本中：好氧及兼性厭氧細(xì)菌數(shù)約為2185萬，放線菌數(shù)約為477萬，霉菌數(shù)約為23.1萬。因此，為獲得(huòdé)不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進(jìn)行分離，同時(shí)還應(yīng)當(dāng)有針對性地提供選擇培養(yǎng)的條件。思考題第二十頁，共三十九頁。4.細(xì)菌(xìjūn)的計(jì)數(shù)

當(dāng)菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)，選取菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。在同一稀釋度下，至少對3個(gè)平板進(jìn)行重復(fù)計(jì)數(shù)，然后求出平均值，并根據(jù)平板所對應(yīng)的稀釋度計(jì)算出樣品(yàngpǐn)中細(xì)菌的數(shù)目。

第二十一頁，共三十九頁。第二十二頁，共三十九頁。關(guān)注菌落的形態(tài)、大小、邊緣(biānyuán)、突起、顏色、質(zhì)地等等，都是區(qū)分細(xì)菌的重要手段。第二十三頁，共三十九頁。關(guān)注菌落的形態(tài)、大小、邊緣、突起、顏色、質(zhì)地等等，都是區(qū)分細(xì)菌的重要(zhòngyào)手段。第二十四頁，共三十九頁。關(guān)注菌落的形態(tài)、大小、邊緣、突起、顏色、質(zhì)地等等，都是區(qū)分細(xì)菌(xìjūn)的重要手段。第二十五頁，共三十九頁。關(guān)注菌落的形態(tài)、大小(dàxiǎo)、邊緣、突起、顏色、質(zhì)地等等，都是區(qū)分細(xì)菌的重要手段。第二十六頁，共三十九頁。關(guān)注菌落的形態(tài)、大小、邊緣、突起、顏色、質(zhì)地等等，都是區(qū)分細(xì)菌的重要(zhòngyào)手段。第二十七頁，共三十九頁。[一]無菌操作1、取土用的小鐵鏟的盛土樣的信封在使用前都需要滅菌(mièjūn)。2、應(yīng)在火焰旁稱取土壤。在火焰附近將稱好的土樣倒入錐形瓶中，塞好棉塞。3、在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁操作。[二]做好標(biāo)記注明培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)日期、平板培養(yǎng)樣品的稀釋度等。[三]規(guī)劃時(shí)間第二十八頁，共三十九頁。六、課題成果(chéngguǒ)與評價(jià)

（一）培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選(shāixuǎn)出菌落

對照的培養(yǎng)皿在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長，說明培養(yǎng)基沒有被雜菌污染。牛肉膏培養(yǎng)基的菌落數(shù)目明顯(míngxiǎn)大于選擇培養(yǎng)基的數(shù)目，說明選擇培養(yǎng)基已篩選出一些菌落。第二十九頁，共三十九頁。

伊紅—美藍(lán)培養(yǎng)基是鑒別培養(yǎng)基，可以用來檢測自來水中的大腸桿菌是否超標(biāo)，因?yàn)榈拇x產(chǎn)物與伊紅—美藍(lán)結(jié)合，使菌落呈深紫色并帶有金屬光澤，使大腸桿菌的菌落顯示出來，并沒有促進(jìn)(cùjìn)大腸桿菌的生長和抑制其他微生物的生長。例如：鑒別(jiànbié)大腸桿菌培養(yǎng)基第三十頁，共三十九頁。大腸桿菌(dàchánɡɡǎnjūn)呈黑色中心,有或無金屬光澤大腸桿菌在伊紅美藍(lán)瓊脂(qióngzhī)(EMB)上典型特征

第三十一頁，共三十九頁。如果學(xué)生選取的是同一種土樣，統(tǒng)計(jì)的結(jié)果應(yīng)該接近。如果結(jié)果相差太遠(yuǎn)，需要進(jìn)一步分析(fēnxī)產(chǎn)生差異的原因。（二）樣品的稀釋操作(cāozuò)是否成功如果得到了2個(gè)或2個(gè)以上菌落數(shù)目在30～300的平板，則說明稀釋操作(cāozuò)比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)。

（三）重復(fù)組的結(jié)果是否一致第三十二頁，共三十九頁。第三十三頁，共三十九頁。本課題知識(shí)(zhīshi)小結(jié):第三十四頁，共三十九頁。七、例題(lìtí)解析

例1．對細(xì)菌群體(qúntǐ)生長規(guī)律測定的正確的表述是A．在液體培養(yǎng)基上進(jìn)行B．至少接種一種細(xì)菌C．接種一個(gè)細(xì)菌D．及時(shí)補(bǔ)充消耗的營養(yǎng)物質(zhì)解析：細(xì)菌群體生長規(guī)律的測定是人們在一定條件(tiáojiàn)下進(jìn)行的。這些條件(tiáojiàn)是：一種細(xì)菌、恒定容積的培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基、定時(shí)測定細(xì)菌總數(shù)。在這些條件下，才能測定出細(xì)菌的生長規(guī)律。測定時(shí)只能用一種細(xì)菌的子細(xì)胞群體的變化規(guī)律表達(dá)微生物的生長；恒定容積是給微生物提供一定的生存環(huán)境；液體培養(yǎng)基才能通過樣品推測細(xì)菌總數(shù)。若接種多種細(xì)菌，則會(huì)發(fā)生種間斗爭而不能測定一種微生物的生長規(guī)律。在接種時(shí)，要保證一定的接種量。答案：A第三十五頁，共三十九頁。例2．在微生物群體生長規(guī)律的測定中，種內(nèi)斗爭(dòuzhēng)最顯著最激烈的時(shí)期是

A．調(diào)整期B．對數(shù)期

C．穩(wěn)定期D．衰亡期

解析：種內(nèi)斗爭是一種生態(tài)因素。種內(nèi)斗爭反應(yīng)(fǎnyìng)了種內(nèi)生物對生存空間和生活資源的爭奪。在生活空間充裕，營養(yǎng)充足的時(shí)候，種內(nèi)斗爭的程度是比較低的。隨著微生物個(gè)體數(shù)目的增加，每個(gè)個(gè)體的生存空間越來越少，營養(yǎng)物質(zhì)也越來越少，每個(gè)個(gè)體對生存空間和資源的爭奪也越來越激烈，種內(nèi)斗爭就越來越激烈。由此可知，在穩(wěn)定期的種內(nèi)斗爭最激烈。在衰亡期，微生物的數(shù)目已經(jīng)開始減少，pH已經(jīng)極度不適于微生物的生存，次級代謝產(chǎn)物積累到很高的程度，這時(shí)的微生物的生存斗爭主要是與無機(jī)環(huán)境的斗爭。答案(dáàn)：C第三十六頁，共三十九頁。例3．（2005年江蘇）抗生素作為治療細(xì)菌感染的藥物，其高效性和巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值使抗生素工業(yè)經(jīng)久不衰。其中青霉素的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用具有劃時(shí)代的意義。⑴青霉素發(fā)酵產(chǎn)生青霉素。青霉菌的新陳代謝類型(lèixíng)是

，青霉素是青霉菌的

代謝產(chǎn)物。⑵在生產(chǎn)和科研中，常選用處于

期的青霉菌作為菌種或研究材料，因?yàn)榇藭r(shí)的青霉菌代謝旺盛，

和

比較穩(wěn)定。⑶對青霉菌菌體生長情況的測定：取一定體積的發(fā)酵液，經(jīng)離心分離、反復(fù)洗滌后，

，再計(jì)算發(fā)酵罐中菌體的總重量。異養(yǎng)需氧型次級(cìjí)對數(shù)(duìshù)個(gè)體的形態(tài)生理特性稱菌體的濕重（稱烘干后的重量）第三十七頁，共三十九頁。

解析：青霉菌屬于真菌，其代謝類型應(yīng)為異養(yǎng)需氧型，而青霉素作為它的代謝產(chǎn)物，并不是它生長、繁殖所必需的，所以青霉素應(yīng)屬于次級代謝產(chǎn)物。在測定培養(yǎng)基上青霉菌菌體的生長情況時(shí)，常用的方法有兩種：一種是測量青霉菌的細(xì)胞數(shù)目，另一種是測重量，取一定體積的發(fā)酵液，經(jīng)離心分離、反復(fù)洗滌后，稱菌體的濕重，或烘干后稱干