2023學(xué)年完整公開課版ELISA技術(shù)

ELISA技術(shù)免疫檢測的基礎(chǔ)知識(shí)1ELISA基本知識(shí)2目錄頁CONTENTSPAGE1免疫檢測的基礎(chǔ)知識(shí)一、免疫檢測基礎(chǔ)知識(shí)1.抗原2.抗體3.抗原抗體反應(yīng)1抗原

抗原是能在機(jī)體中引起特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)。抗原進(jìn)入機(jī)體后，可刺激機(jī)體引起細(xì)胞免疫和產(chǎn)生抗體。能在機(jī)體中引起抗體產(chǎn)生的抗原多為分子量大于5000的蛋白質(zhì)，例如完整的病毒粒子、細(xì)菌等。小分子化合物在與大分子蛋白質(zhì)結(jié)合后能引起機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體的，稱為半抗原。例如某些激素、藥物等?？乖姆磻?yīng)性取決于抗原決定簇，或稱為表位。一個(gè)抗原分子可帶有不同的決定簇，例如細(xì)菌的莢膜多糖、類脂中可帶有多個(gè)抗原決定簇。1.抗原2.抗體3.抗原抗體反應(yīng)2抗體抗體的結(jié)構(gòu)抗體是能與抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。Ig分五類，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。與免疫測定有關(guān)的Ig主要為IgG和IgM。Ig由兩個(gè)輕鏈（L）和兩個(gè)重鏈（H）的單體組成。Ig的輕鏈?zhǔn)窍嗤模笑剩╧appa）和λ（Lambda）兩種型別。

五類Ig的重鏈結(jié)構(gòu)不同，這決定了它們的抗原性也不同。IgG和IgM的重鏈分別稱為γ（gamma）鏈和μ（mu）鏈。一、免疫檢測基礎(chǔ)知識(shí)一、免疫檢測基礎(chǔ)知識(shí)1.抗原2.抗體3.抗原抗體反應(yīng)一、免疫檢測基礎(chǔ)知識(shí)1.抗原2.抗體3.抗原抗體反應(yīng)重鏈和輕鏈的N端的氨基酸排列順序因各種抗體而異，稱為可變區(qū)，分別用VH和VL表示。兩者構(gòu)成抗體的抗原結(jié)合部位，只與相應(yīng)的抗原決定簇匹配，發(fā)生特異性結(jié)合（見圖），是抗體專一性結(jié)合抗原的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。機(jī)體被微生物感染后，先產(chǎn)生IgM抗體，然后產(chǎn)生IgG抗體。經(jīng)過一段時(shí)間，IgM抗體量逐漸減少而消失，而IgG抗體可長期存在，在疾病痊愈后可持續(xù)數(shù)年之久。一、免疫檢測基礎(chǔ)知識(shí)1.抗原2.抗體3.抗原抗體反應(yīng)

抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過程是一種動(dòng)態(tài)平衡，其反應(yīng)式為：Ag+Ab→Ag·Ab

可逆性

抗體的親和力（affinity），可以用平衡常數(shù)K表示：K=[Ag·Ab]/[Ag][Ab],Ag·Ab的解離程度與K值有關(guān)。高親和力抗體的抗原結(jié)合點(diǎn)與抗原的決定簇在空間構(gòu)型上非常適合，兩者結(jié)合牢固，不易解離。解離后的抗原或抗體均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性。一、免疫檢測基礎(chǔ)知識(shí)1.抗原2.抗體3.抗原抗體反應(yīng)特異性

抗原抗體的結(jié)合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結(jié)合位點(diǎn)之間?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型互補(bǔ)關(guān)系，具有高度的特異性。

測定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。

一、免疫檢測基礎(chǔ)知識(shí)1.抗原2.抗體3.抗原抗體反應(yīng)最適比例

一、免疫檢測基礎(chǔ)知識(shí)1.抗原2.抗體3.抗原抗體反應(yīng)敏感性

化學(xué)比色法的敏感度為mg/ml水平酶反應(yīng)測定法的敏感度約為5-10μg/ml免疫測定中凝膠擴(kuò)散法和濁度法的敏感度與酶反應(yīng)法相仿標(biāo)記的免疫敏感度可提高數(shù)千倍，達(dá)ng/ml水平例如：用放射免疫測定法或酶免疫測定法測定口蹄疫抗體，其敏感度可達(dá)0.1ng/ml。2ELISA基本知識(shí)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)用酶標(biāo)記抗原或抗體檢測液體（血液、細(xì)胞液）中未知抗體或抗原的方法。1.定義2.分類間接法（IndirectELISA）：將已知抗原吸附于固相載體，酶標(biāo)記二抗檢測液相中未知抗體雙抗體夾心法（SandwichELISA)：將已知抗體吸附于固相載體，酶標(biāo)記一抗檢測液相中的可溶性抗原競爭法（CompetitiveELISA)：將已知抗體或抗原吸附于固相載體，酶標(biāo)記抗原或抗體檢測液相中的可溶性抗原或抗體二、ELISA基本知識(shí)3.ELISA的原理

ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測定時(shí)，受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。二、ELISA基本知識(shí)4.ELISA的試劑(A、B、C三部分)ELISA中有三個(gè)必要的試劑：免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的底物。（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）；（3）酶的底物；（4）陰性對照品和陽性對照品，參考標(biāo)準(zhǔn)品；（5）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；（6）洗滌液；（7）酶反應(yīng)終止液二、ELISA基本知識(shí)ELISA的試劑準(zhǔn)備A

固相載體聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學(xué)活性。聚氯乙烯。聚氯乙烯對蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間性能相近。二、ELISA基本知識(shí)

ELISA的試劑準(zhǔn)備B

結(jié)合物

即酶標(biāo)記的抗體（或抗原）是ELISA中關(guān)鍵的試劑

1酶的催化活性

2抗體（或抗原）的免疫活性

3結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性。二、ELISA基本知識(shí)試劑準(zhǔn)備

C酶的底物二、ELISA基本知識(shí)5對照設(shè)定

陽性對照品(positivecontrol)和陰性對照品(negativecontrol)是檢驗(yàn)試驗(yàn)有效性的控制品，同時(shí)也作為判斷結(jié)果的對照。 陽性對照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測標(biāo)本的組成相一致，多以含蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì)。 加入的量應(yīng)與試劑的敏感度相稱； 在測定中得到的吸光值與受檢標(biāo)本吸光值比較，可以估計(jì)標(biāo)本物質(zhì)的量。二、ELISA基本知識(shí)基本操作注意事項(xiàng)試劑的準(zhǔn)備按試劑盒說明書的要求準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)中需用的試劑。ELISA中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的。自配的緩沖液應(yīng)用pH計(jì)測量較正。從冰箱中取出的試驗(yàn)用試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗(yàn)不需用的部分應(yīng)及時(shí)放回冰箱保存。

二、ELISA基本知識(shí)

在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。加樣:二、ELISA基本知識(shí)保溫抗原抗體完成反應(yīng)的保溫過程稱為溫育(incubation)。ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時(shí)間的溫育？溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。二、ELISA基本知識(shí)保溫方式：ELISA儀器附有特制的電熱塊，水浴。若用保溫箱：ELISA板放在濕盒內(nèi)，在盒底墊濕的紗布，最后將ELISA板放在濕紗布上。反應(yīng)板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。室溫溫育的反應(yīng)，操作時(shí)的室溫應(yīng)嚴(yán)格限制在規(guī)定的范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)室溫溫度是指20-25℃，但具體操作時(shí)可根據(jù)說明書的要求控制溫育。應(yīng)注意溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。為保證這一點(diǎn)，一個(gè)人操作時(shí)，一次不宜多于兩塊板同時(shí)測定。二、ELISA基本知識(shí)洗滌洗滌在ELISA過程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻也決定著實(shí)驗(yàn)的成敗。ELSIA洗滌：達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。清除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來?？梢哉f在ELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)。洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動(dòng)洗滌儀外，手工操作有流水沖洗式和浸泡式兩種：二、ELISA基本知識(shí)顯色顯色是酶催化無色的底物生成有色產(chǎn)物的溫育反應(yīng)。反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。在一定時(shí)間內(nèi)，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時(shí)間的延長而呈色加強(qiáng)。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。TMB受光照的影響。但為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當(dāng)時(shí)間閱讀結(jié)果。TMB經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達(dá)頂峰，隨即逐漸減弱，至2小時(shí)后即可完全消退至無色。二、ELISA基本知識(shí)拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀中。以蒸餾水校零點(diǎn)，測讀底物孔（未經(jīng)任何反應(yīng)僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標(biāo)本作全過程的孔），以記錄本次試驗(yàn)的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點(diǎn)，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果以光密度（oplicaldensity，OD），現(xiàn)按規(guī)