膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測(cè)

斜面培養(yǎng)物4支，營(yíng)養(yǎng)肉湯4支，生理鹽水2支，鏡油瓶、拭鏡紙1套，吸水紙1本，載玻片4張。器材準(zhǔn)備染色瓶6組，染色架8個(gè)。醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

綜合性實(shí)驗(yàn)一膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測(cè)（四）斜面培養(yǎng)物的觀察革蘭染色法肉湯接種法顯微鏡油鏡的使用斜面培養(yǎng)物的觀察從普通平板上挑取的黃色或白色菌落接種的斜面，菌苔的顏色，還是原來菌落的顏色，黃色或白色。從伊紅美藍(lán)平板上挑取的紫黑色或粉紅色菌落接種的斜面，菌苔已經(jīng)沒有原來菌落的顏色。菌苔灰白色、表面濕潤(rùn)、光滑、不透明或半透明。為了講解方便，以后的實(shí)驗(yàn)，仍然沿用初次分離得到菌落的顏色—紫黑或粉紅。從斜面上取菌時(shí)，不管是涂片，還是接種，每次只取半個(gè)小菌落大小的菌量；接種環(huán)或接種針在培養(yǎng)基表面輕刮一下即可取菌。

細(xì)菌染色法單染色法：只用一種染料染色，能清楚觀察菌體大小、形態(tài)與排列，不能鑒別細(xì)菌。復(fù)染色法（鑒別染色）：采用兩種以上的不同染料進(jìn)行先后染色，可將細(xì)菌染成不同的顏色，以便鑒別細(xì)菌?？顾崛旧?用于檢查結(jié)核分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌等抗酸性細(xì)菌，陽性者為紅色。特殊染色：莢膜染色，芽胞染色，鞭毛染色，極體染色（用于白喉?xiàng)U菌異染顆粒染色）。結(jié)核分枝桿菌抗酸染色麻風(fēng)分枝桿菌抗酸染色產(chǎn)氣莢膜梭菌莢膜Hiss染色破傷風(fēng)梭菌芽胞芽胞染色變形桿菌鞭毛Leifson染色

白喉棒狀桿菌異染顆粒Albert染色革蘭染色法GramStaining

革蘭染色法是丹麥內(nèi)科醫(yī)生ChristainGram于1884年創(chuàng)立的一種細(xì)菌染色方法，已有120多年的歷史，仍在廣泛使用，是細(xì)菌學(xué)中最為經(jīng)典的染色法。革蘭染色法原理的三種學(xué)說通透性學(xué)說：G+菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)比較致密，肽聚糖層厚，脂質(zhì)含量少，酒精不易透入，反而可使細(xì)胞壁脫水而形成一道屏障，阻止染料向細(xì)胞外滲。G-菌細(xì)胞壁比較疏松，肽聚糖層很薄，而外膜、脂蛋白、脂多糖均含有大量脂質(zhì)，易被酒精溶解，致使細(xì)胞壁通透性增高，細(xì)胞內(nèi)的結(jié)晶紫—碘復(fù)合物容易被酒精脫出。等電學(xué)說：G+菌等電點(diǎn)(pH2～3)比G-菌(pH4～5)低，一般染色時(shí)染液的酸堿度在pH7.0左右，電離后陽性菌帶的負(fù)電荷比陰性菌多，因此與帶正電荷的結(jié)晶紫染料結(jié)合牢固，不易脫色?；瘜W(xué)學(xué)說：G+菌細(xì)胞內(nèi)含有某種特殊化學(xué)成分，一般認(rèn)為是核糖核酸鎂鹽與多糖的復(fù)合物，它與染料—媒染劑復(fù)合物結(jié)合，使已著色的細(xì)菌不易脫色。革蘭染色的意義鑒別細(xì)菌：把細(xì)菌分成G+和G-兩大類。選擇抗菌藥物：G+球菌對(duì)青霉素敏感,G-桿菌耐藥。了解細(xì)菌的致病機(jī)理：G+菌大多產(chǎn)生外毒素,G-菌產(chǎn)生內(nèi)毒素。革蘭染色的步驟涂片→干燥→固定→染色接種環(huán)取生理鹽水3～4ul，2滴。菌苔少許（1mm小菌落的半量）與鹽水混勻，涂成≥1cm2。涂畢→環(huán)移至涂膜中央側(cè)立，待環(huán)內(nèi)菌膜破裂，接種環(huán)→滅菌。涂片的制備甲→黃色，紫黑。乙→黃色，紫黑。丙→白色，粉紅。丁→白色，粉紅。涂片干燥固定Fixation革蘭染色方法步驟涂片→干燥→固定→↓結(jié)晶紫→初染1分鐘→水洗→↓盧戈碘液→媒染1分鐘→水洗→↓95％乙醇→脫色約20秒鐘→水洗→↓稀釋復(fù)紅→復(fù)染1分鐘→水洗→↓吸干,鏡檢?！锶【m量,涂片均勻,水洗輕緩,脫色適當(dāng)?！镉绊懜锾m染色的關(guān)鍵步驟是涂片和脫色。革蘭陽性菌革蘭陰性菌G+鏈球菌G-雙球菌G+桿菌G+短桿菌G-弧菌G-螺菌甲→黃色,乙→白色,丙→紫黑,丁→粉紅。標(biāo)記：組號(hào)，顏色36℃培養(yǎng)4小時(shí)4～5×108cfu/ml液體培養(yǎng)基接種BrothTransfer—懸浮法SuspendingMethod生物安全警告本次實(shí)驗(yàn)操作，可產(chǎn)生幾十至幾百個(gè)微生物氣溶膠顆粒。氣溶膠粒徑＞100um沉降很快,＜50um在0.4s內(nèi)擴(kuò)散開,＜5um通過呼吸道直接到達(dá)肺泡。Pike博士對(duì)實(shí)驗(yàn)室感染統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不明原因的感染高達(dá)82%，大多數(shù)是氣溶膠在空氣中擴(kuò)散引起的。實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)坐著，在火焰周圍10～20厘米內(nèi)操作，保持安靜、有序，盡量少說話、少走動(dòng)，以免感染病原菌。100倍浸油物鏡使用方法油鏡放入光路之前，一定要在標(biāo)本的觀察部位上加一滴浸油。旋轉(zhuǎn)物鏡轉(zhuǎn)盤，使油鏡進(jìn)入光路，用微調(diào)旋鈕對(duì)好焦距。如果浸油內(nèi)有氣泡，會(huì)影響觀察，可稍微旋轉(zhuǎn)物鏡轉(zhuǎn)盤，使油鏡來回通過1～2次浸油，排除油內(nèi)氣泡。提示因染色場(chǎng)地受限，1～5組先涂片染色，后接種肉湯。6～10組先接種肉湯，后涂片染色。待染色和肉湯接種完畢，桌面收拾干凈，才可鏡檢，以免污染。鏡檢過的載玻片不必擦拭，直接投入玻片缸內(nèi)消毒、滅菌。革蘭染色法P15

甲→黃色，紫黑乙→黃色，紫黑丙→白色，粉紅丁→白色，粉紅肉湯接種法P10

甲→黃色乙→白色丙→紫黑丁→粉紅油鏡的使用P13

10×物鏡→標(biāo)本位置→滴加香柏油→100×油鏡→浸泡油中,幾乎與標(biāo)本接觸（工作距離0.13mm）→細(xì)調(diào)節(jié)調(diào)焦，觀察物像→記錄結(jié)果→關(guān)閉電源→擦鏡紙拭去香柏油→擦鏡紙沾少許乙醇和乙醚（7:3）混合液擦拭→擦鏡紙擦拭油鏡。思考題革蘭染色法的關(guān)鍵步驟是什么?為什么?染色時(shí)為什么通常要用新鮮的細(xì)菌培養(yǎng)物?如何使用油鏡?實(shí)驗(yàn)小結(jié)用普通平板，從濃汁標(biāo)本中分離得到黃色、白色兩種菌落，這兩株細(xì)菌，顯微鏡油鏡下均為G+球菌，排列不規(guī)則，呈葡萄串狀，是典型的葡萄球菌。結(jié)合菌落色素，這兩株葡萄球菌可能是金黃色葡萄球菌和白色葡萄球菌。電鏡油鏡葡萄菌落黃色白色葡萄球菌三個(gè)種的鑒別試驗(yàn)金黃色葡萄球菌表皮葡萄球菌腐生葡萄球菌血漿凝固酶+--甘露醇發(fā)酵+--新生霉素敏感性SSRA蛋白+--注：敏感（SensitiveS）,耐藥（ResistantR）。用伊紅美藍(lán)平板,從糞便標(biāo)本分離、獲得紫黑色和粉紅色半透明兩種菌落。紫黑色菌落是能分解乳糖的非致病菌大腸埃希菌。粉紅色菌落是不能分解乳糖的致病菌。顯微鏡下，均為G-桿菌，散在排列，從形態(tài)上不能鑒別是什么細(xì)菌。電鏡油鏡紫黑菌落粉紅常用器材擺放順序：電源插座→試管架→酒精燈→污物盤。試管